血管性血友病因子A1分子在大肠杆菌中的可溶性表达及功能鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.38.015

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (38): 6153-6159.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.38.015

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血管性血友病因子A1分子在大肠杆菌中的可溶性表达及功能鉴定

王依璐，刘晓玲，丁孝茹，方颖

华南理工大学生物科学与工程学院，广东省广州市 510006

收稿日期:2014-06-12 出版日期:2014-09-10 发布日期:2014-09-10
通讯作者: 方颖，副教授，硕士生导师，华南理工大学生物科学与工程学院，广东省广州市 510006
作者简介:王依璐，女，1989年生，湖南省常德市人，汉族，华南理工大学在读硕士，主要从事蛋白表达纯化及生物力学方面的研究。并列第一作者：刘晓玲，女，1990年生，江西省赣州市人，汉族，华南理工大学在读硕士，主要从事蛋白表达纯化及生物力学方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(10972081, 11072080, 11272125)

Soluble expression and function of von Willebrand factor-A1 in Escherichia coli

Wang Yi-lu, Liu Xiao-ling, Ding Xiao-ru, Fang Ying

School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China

Received:2014-06-12 Online:2014-09-10 Published:2014-09-10
Contact: Fang Ying, Associate professor, Master’s supervisor, School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
About author:Wang Yi-lu, Studying for master’s degree, School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China Liu Xiao-ling, Studying for master’s degree, School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China Wang Yi-lu and Liu Xiao-ling contributed equally to this study.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 10972081, 11072080, 11272125

摘要/Abstract

摘要：

背景：血管性血友病因子A1通过介导随流血小板在受损血管部位的黏附在初始止血中发挥至关重要的作用，但重组A1在原核中多为包涵体表达，不利于纯化及体外的功能研究。
目的：在大肠杆菌中稳定高效表达可溶性野生型血管性血友病因子A1以及突变型血管性血友病因子G1324S，并研究其生物学功能。
方法：将血管性血友病因子A1(野生型)、血管性血友病因子G1324S(功能失去型突变体)重组质粒分别转化到感受态细胞DH5α中，筛选提取质粒。将提取的质粒分别转化到大肠杆菌(E.coli)BL21、E.coli M15中，筛选挑单克隆菌于LB培养基，扩大培养。比较溶菌酶破碎法和超声波破碎法两种不同的裂菌方法，使目的蛋白血管性血友病因子A1的可溶性表达，经过Ni柱亲和层析纯化蛋白，用SDS-PAGE和Western-blot鉴定纯化的血管性血友病因子A1、血管性血友病因子G1324S纯度和免疫学活性；采用流动腔实验系统分析在不同流体剪应力条件下，血小板在两种目的蛋白上的黏附能力。
结果与结论：每100 mL上清液可分别纯化得到5.77 mg血管性血友病因子A1，6.83 mg血管性血友病因子G1324S纯品，并具有较高的纯度和免疫学活性。流动腔结果显示，对每个剪切应力下铺设不同A1分子的底板进行两两比较，随着流体剪应力从0.1 Pa提高1 Pa，G1324S突变组所黏附细胞数下降的幅度(46.8%)要远高于野生型组(20.5%)，说明突变后的A1分子的功能有所减弱。结果表明纯化的蛋白介导血小板黏附的能力与临床特征一致，野生型血管性血友病因子的结合活性明显高于突变型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 血管性血友病因子A1, 血管性血友病因子G1324S, 血小板, 原核表达, 可溶性, 亲和层析, 流动腔, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: von Willebrand factor-A1 (VWF-A1) plays a crucial role in primary hemostasis by mediating blood platelet adhesion to sites of vascular damage under conditions of high shear stress. However, mostly expression of recombinant VWF-A1 in form of inclusion bodied within Escherichia coli (E. coli) that is not conducive to purify and functional study in vitro.
OBJECTIVE: To acquire soluble recombinant VWF-A1 including wild type and its mutation G1324S which can be stable efficiently expressed in E. coli and to verify their biological function.
METHODS: Wild-type VWF-A1 and its mutation G1324S recombinant plasmids were transformed into competent cells DH5α, to screen and extract the plasmids. Then the extracted plasmids were respectively transformed into E. coli BL21 and E. coli M15, to screen monoclonal bacterium. The bacterium was cultured in LB culture medium. The bacteria breaking methods with lysozyme and with ultrasonic were compared. Then, the solubilized proteins were passed over Ni-NTA agarose column to purify the VWF-A1 protein, and the purity and immune activity of purified products were identified with SDS-PAGE and western blot analysis. Finally, the biological function of the purified proteins was assessed by their ability to support flow-dependent platelet adhesion by parallel-plate flow chamber system.
RESULTS AND CONCLUSION: We obtained about 5.77 mg VWF-A1, 6.83 mg VWF-G1324S in culture supernatants per 100 milliliter, respectively, which all showed high purity and immune activity. The data of flow chamber experiment demonstrated that both VWF-A1 and VWF-G1324S could mediate platelet adhesion. As the shear stress increased from 0.1 Pa to 1 Pa, the decline (46.8%) of the number of adhesive cells in G1324S mutation group was higher than that of wild type group (20.5%). This evidence indicated that, the A1 molecule functions were attenuated after mutation. Our research shows that, wild type of VWF-A1 showed a stronger interaction with platelet in shear stress, which is consistent with clinical characteristics.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: von Willebrand Diseases, hemophilia A, blood platelets

中图分类号:

R318

王依璐，刘晓玲，丁孝茹，方颖. 血管性血友病因子A1分子在大肠杆菌中的可溶性表达及功能鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(38): 6153-6159.

Wang Yi-lu, Liu Xiao-ling, Ding Xiao-ru, Fang Ying. Soluble expression and function of von Willebrand factor-A1 in Escherichia coli[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(38): 6153-6159.

图/表（结果） 2

2.1 两种方法诱导血管性血友病因子A1的可溶性表达

使用溶菌酶破碎法：即1.5 mmol/L的IPTG诱导培养 4 h后，经过溶菌酶的处理反复冻融后，得到的上清和沉淀产物(图1A)，从图中可以看出，上清和沉淀中的目的蛋白含量相差很大，诱导后大量的目的蛋白均处于沉淀中，即目的蛋白以其疏水区积聚在一起，几乎都以包涵体方式表达。

使用超声波破碎法：即0.2 mmol/L的IPTG诱导表达 6 h后，经过超声波破碎后，得到的上清和沉淀产物(图1B)，此时，上清中的目的蛋白含量与沉淀中的相似，相对于溶菌酶破碎法处理法得到的上清中的目的蛋白的产量有了极大的提升，达到进一步纯化要求。

SDS-PAGE结果显示：两种方法均能实现目的蛋白的成功表达，但超声波破碎法通过降低诱导剂浓度、降低培养时的温度并延长培养时间和适当提高摇床转速，确实可提高目的蛋白在上清中的表达，另外机械破碎法优于化学破碎法，溶菌酶的生物活性可能会影响目的蛋白的表达和完整性。

2.2 用12%SDS-PAGE鉴定亲和层析纯化的血管性血友病因子A1、血管性血友病因子G1324S纯度由于超声波破碎法诱导破碎的血管性血友病因子A1在上清中的表达优于溶菌酶破碎法，所有后续实验均采用超声波破碎法诱导表达和破碎，提取上清液。由于目的蛋白的N端均带有His标签，所以可以通过镍柱(HisTrap^TM HP)亲和层析来对目的蛋白进行纯化。按材料与方法中所述的纯化方法将破碎后分离的上清液纯化，并将纯化后得到的目的蛋白进行12%SDS-PAGE检测，结果显示：①血管性血友病因子A1：与诱导前相比，诱导后菌体蛋白泳道于相对分子质量23 000附近新增一蛋白条带，与预计的目的蛋白相对分子质量一致，且纯化后在此位置出现单一蛋白条带。纯化后的目的蛋白主要存在于 300 mmol/L咪唑洗脱液部分(图2A)。②血管性血友病因子G1324S：与诱导前相比，诱导后的菌体蛋白泳道于相对分子质量31 000附近新增一蛋白条带，与预计的目的蛋白相对分子质量一致，且纯化后在此位置出现单一蛋白条带。纯化后的目的蛋白主要存在于200 mmol/L咪唑洗脱液部分(图2B)。说明血管性血友病因子A1和血管性血友病因子G1324S能够进行正确的表达，并且纯化出的目的蛋白具有较高的纯度。

2.3 Western-blot测定纯化产品的免疫活性血管性血友病因子A1与血管性血友病因子G1324S的N端都带有6×His标签，所以用兔IgG抗6×His多克隆抗体(一抗)和羊抗兔IgG HRP标记多克隆抗体(二抗)进行Western-blot鉴定，证实相对分子质量为23 000和31 000的蛋白条带分别为血管性血友病因子A1与血管性血友病因子G1324S(图3)，说明纯化的蛋白具有免疫学活性。

2.4 血管性血友病因子A1与血管性血友病因子G1324S的功能测定方差分析结果表明，底板功能化与流体剪应力均对血小板黏附数量产生显著影响，前者F=448.12，P= 1.22×10^-¹⁵；后者F=89.60，P=5.86×10^-⁸；且存在二因素的交互作用(P=2.24×10^-⁶)。

图4显示所纯化的蛋白A1及其突变体G1324S都具有黏附血小板的生物学功能，但通过图4A上下2组照片的比较，可明显看出血小板在G1324S上的黏附数要低于其在野生型A1的数目。图4B的实验数据表明，实验组(包括野生型A1和其突变体G1324S)黏附的细胞数要显著高于其实验对照组和空白对照组(P < 0.01)；而实验对照组又显著低于空白对照组(P < 0.01)，说明BSA能够有效阻断血小板与底板之间的物理黏附，但又不影响血小板与A1分子间的特异性相互作用，以保证实验组的细胞黏附确实是由于A1与血小板膜上的糖蛋白分子GPIbα特异相互作用所介导的。同时，对每个剪切应力下铺设不同A1分子的底板进行两两比较，发现：0.1 Pa组，野生型A1所黏附的细胞数比突变体G1324S组稍多，但差异无显著性意义(P=0.08)；1 Pa组，野生型A1上黏附的细胞数显著高于其突变体G1324S组(P < 0.01)，即随着流体剪应力从0.1 Pa提高1 Pa，G1324S突变组所黏附细胞数下降的幅度(46.8%)要远高于野生型组(20.5%)，说明突变后的A1分子的功能有所减弱，在高速流场中，其与GPIbα的结合亲和力更是大幅下降，完全不足以保证止血所必需的最低限度血小板的黏附。

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引言

在循环血流中，血管性血友病因子通过介导高速流动的血小板在血管内壁受损部位的黏附，在初始止血过程中起着至关重要的作用，是连接血小板与血管内皮下胶原的桥梁^[1]。任何血管性血友病因子数量或质量上的缺陷均能导致出血性或血栓性疾病，即血管性血友病^[2]。它是一种常见的遗传型出血性疾病，发病率极高，严重危害着人类健康^[3]。

根据血管性血友病因子数量缺陷的严重程度分为Ⅰ类和Ⅲ类；而其质量上的缺陷则归为Ⅱ类，包括2B型(功能获得性)和2M型(功能失去性)血管性血友病^[4-6]。目前已知血管性血友病因子是由A，B，C，D 4种不同功能结构域构成的多聚体糖蛋白其前体从N端到C端排列依次是D1-D2-D’-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK^[7]。其中A1、A2和A3因分别含有与血小板表面受体GPIbα、金属蛋白剪切酶和胶原等的结合位点^[8-10]，在诱导血小板在血管壁破损处的黏附、激活和聚集这一凝血反应发挥着关键影响^[11-12]，而受到广泛关注。

从临床患者的资料来看，血管性血友病因子分子在特定位点上的突变会导致血管性血友病因子与血小板的结合出现异常，引起出血和凝血紊乱^[13]。Cruz等^[14]对血管性血友病因子A1结构域中折叠区外表面上可能与GPIbα结合的6个位点进行突变，其中血管性血友病因子A1区的蛋白序列1324位由甘氨酸突变为丝氨酸，表现出对瑞斯托酶素诱导的血小板聚集的抑制作用的减弱。在临床上G1324S突变的确与2M型血管性血友病密切相关，携带G1324S突变的患者表现为出血时间延长以及止血功能缺失等特点^[15]。但仅一个位点的残基突变究竟是如何影响其止血功能的发挥，至今尚未有清晰答案。

根据野生型血管性血友病因子A1的晶体结构^[16]，蛋白序列1324位的甘氨酸是暴露在表面的、并位于可能与GPIbα结合面的中心，这个位点的突变极有可能会直接导致与血小板GPIbα结合亲和力的下降；但Morales等^[17]以特定位点的抗体为探针，采用流动腔实验证明，在流体剪应力下，野生型A1与胶原的结合诱导了构象变化，从而暴露了A1与瑞士托酶素和GPIbα的结合位点，而G1324S突变则阻止了这种构象变化，因此明显下降了瑞斯托酶素诱导的血小板聚集；或者如最近Liu等^[18]通过分子动力学模拟研究所揭示的，A1的2B型突变由于N末端臂的失稳和α2螺旋摆动的加剧上调了其与GPIbα结合的亲和力，那么是否可以推测2M型突变则是由于这些区域局部刚性的增强而降低与GPIbα的结合能力？迄今为止，因为缺乏相应A1突变体及其与GPIbα复合物的晶体结构，2M型血管性血友病的分子调节机制未能进一步探明。

众所周知，稳定表达、具有生物活性的高纯度蛋白的制备是进行晶体结构分析的前提，也是后续体外生理、病理实验研究的基础。由于血管性血友病因子A1与血小板GPIbα的相互作用在凝血止血方面的重要性，针对血管性血友病因子A1及其突变体的表达纯化研究也是目前的一大热点问题，各个实验室相继应基础与临床需要制备了不同氨基酸序列的血管性血友病因子A1蛋白^[19-20]。基于蛋白的理化性质，主要的纯化方法有蛋白质沉淀、缓冲液交换、离子交换色谱和亲和层析等^[21]。但目前在原核生物体内表达的血管性血友病因子A1蛋白经镍柱亲和层析纯化后易形成包涵体，通过尿素变性复性后稳定性差并且易发生错误折叠，影响蛋白的生物活性，因此解决血管性血友病因子A1及其突变体蛋白的稳定表达和高纯度提取这一关键问题具有非常重要的意义。

本实验试图从诱导物浓度、温度和时间、细胞破碎方法和洗脱浓度等方面着手，完善Cruz等^[14]发展的传统的A1表达纯化实验方法，并在大肠杆菌(E.coli)内获得大量可溶性表达的A1及A1突变体G1324S。通过流动腔实验观察不同流动条件下血小板在血管性血友病因子A1及突变体G1324S上的黏附，比较分析所得蛋白分子的生物活性以及残基突变与血管性血友病的关联性。本工作有助于揭示血管性血友病病理机制的分子结构基础，深化对于出血与凝血生理、病理过程的理解，为血管性血友病的临床诊断和相关药物的开发设计提供参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：对比观测及二因素随机区组设计的鉴定实验。

时间及地点：实验于2012年9月至2013年11月在华南理工大学生物科学与工程学院完成。

材料：

血管性血友病因子A1分子在大肠杆菌中的可溶性表达及其功能鉴定所用质粒、菌种及试剂：
质粒、菌种及试剂	来源
血管性血友病因子A1重组质粒	由中山大学张擎教授馈赠
血管性血友病因子G1324S重组质粒	由贝勒医学院Dr.Miguel A.Cruz馈赠
蛋白表达菌株M15、BL21	深圳百恩维公司
DH5α感受态细胞	TIANGEN公司
质粒小提试剂盒	QIAGEN公司
HisTrap^TM HP	GE Healthcare
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒	捷倍斯
兔IgG抗6×His多克隆抗体ab9108、羊抗兔IgG HRP标记多克隆抗体ab6721	购于Abacam
硝酸纤维素膜	Osmonics公司
ECL化学发光试剂盒	Thermo公司

实验方法：

原核表达载体的抽提：将血管性血友病因子A1(野生型)、血管性血友病因子G1324S(功能失去型突变体)重组质粒分别转化到感受态细胞DH5α中，氨苄抗性筛选， 37 ℃倒置培养过夜(8-12 h)。用质粒小提试剂盒提取质粒(按试剂盒说明操作)。

转化-挑单克隆菌株及扩大培养：将提取的质粒分别转化到大肠杆菌(E.coli )BL21、E.coli M15中，涂板，氨苄、卡那抗性筛选，37 ℃倒置培养过夜(8-12 h)。挑单克隆菌于LB培养基，扩大培养。取5 mL菌液以1∶30稀释，接种于含有卡那的LB锥形瓶中，于摇床37 ℃、200 r/min培养1.5-2 h至A值(A₅₉₅)达到0.5-0.7。

两种方法探索目的蛋白血管性血友病因子A1的可溶性表达：

溶菌酶破碎法^[14]：扩大培养后的菌液以终浓度为 1.5 mmol/L的IPTG诱导，在37 ℃、150 r/min条件下培养 4 h。诱导后将菌液在4 ℃、6 000 r/min下离心10 min，收集沉淀重悬于含250 mg/L的溶菌酶缓冲液中，含有沉淀的缓冲液4 ℃下静置15 min。经过3次冻融循环(-20 ℃)，使细菌裂解。将裂解物在4 ℃、5 000 r/min下离心20 min，分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测是否为可溶性表达。

超声波破碎法：是作者进行了大量的前期预实验比较后，在表达水平和可溶性表达间取得一个相对平衡，其实验参数和步骤为：扩大培养后的菌液以终浓度为 0.2 mmol/L的IPTG诱导，30 ℃、200 r/min条件下培养6 h。诱导后将菌液于4 ℃、5 000 r/min下离心20 min，收集沉淀，用PBS/NaCl溶液洗涤2次。在恒定功率300 W条件下超声破碎仪工作3 s，间隔3 s，共99次，并重复3次。超声破碎后的菌液在4 ℃、5 000 r/min下离心20 min分离上清和沉淀，SDS-PAGE检测。两种方法的主要参数差异见表1。

表1 溶菌酶破碎法和超声波破碎法的实验参数对比

Table 1 Comparison of experimental parameters of two methods

参数	溶菌酶破碎法	超声波破碎法
IPTG浓度(mmol/L) 诱导温度(℃) 摇床转速(r/min) 诱导时间(h) 溶菌酶(mg/L) 超声破碎(s)	1.5 37 150 4 250 /	0.2 30 200 6 / 99×3

血管性血友病因子A1、血管性血友病因子G1324S 纯化：蛋白可溶性表达后，收集上清液用蛋白分离纯化系统AKTATMPURIFIER进行镍柱(HisTrap^TM HP)亲和层析，采用1 mL/min的流速上样，按3 mL/min的流速使用不同浓度梯度的Elution Buffer(20，100，200，300，500 mmol/L咪唑/PBS)洗脱，并收集洗脱液。并用BCA蛋白定量试剂盒测定纯化所得的蛋白浓度。

12%SDS-PAGE鉴定亲和层析纯化的血管性血友病因子A1、血管性血友病因子G1324S纯度：

Western-blot测定纯化产品的免疫活性：将纯化后的蛋白经12%SDS-PAGE电泳后，转移到硝酸纤维素薄膜上，含有1%BSA的TBST缓冲液封闭1 h后，用兔抗6×His多抗(一抗)ab9108室温孵育1 h，再用羊抗兔HRP标记多抗(二抗)ab6721室温孵育1 h，ECL化学发光试剂盒进行显影定影。

血管性血友病因子A1与血管性血友病因子G1324S 的功能测定：为了检测血管性血友病因子A1与血管性血友病因子G1324S的生物学功能，作者通过平行平板流动腔实验来观察分析血小板在野生型及突变体血管性血友病因子A1上的黏附。为确保血小板在流动腔底部的黏附是由血管性血友病因子A1特异介导的，特设计了对照实验：实验组：底板分别铺有100 mg/L血管性血友病因子A1与血管性血友病因子G1324S，再用800 µL含有1%BSA的PBS溶液孵育整个底板；实验对照组：底板仅用800 µL 1%BSA的PBS溶液室温孵育；空白对照组：底板不做任何处理。将血小板分别灌注到3组不同底板的流动腔中，在生理条件的血流剪切力范围内(实验分别采用0.1 Pa、1 Pa剪切力)，观察并记录1 min内在底板上黏附下来的血小板的个数。每个剪切力下进行3组独立平行实验，作双因素方差分析。

血小板的提取与纯化：每次抽取20 mL健康成年志愿者静脉血，室温下150×g离心15 min，离心后上层为富含血小板的血浆，将上层富血小板血浆转移至新的15 mL离心管中，再用900×g离心15 min，离心后上清为乏血小板的血浆，弃上清，沉淀为血小板。用含5%血浆的磷酸缓冲溶液(PBS)稀释，调整血小板的浓度至3×10⁶-3×10⁷L^-¹。

平行平板流动腔实验：流动腔底板准备：将纯化出的血管性血友病因子A1、血管性血友病因子G1324S用PBS溶液稀释到终浓度为100 mg/L，并孵育在直径为35 mm培养皿的中间，4 ℃孵育过夜。用含有1%BSA的PBS清洗3次，再用800 µL含有1%BSA的PBS溶液孵育整个底板，室温下孵育2 h。实验采用负压泵(Harvard Pump，PHD 2000)将血小板以不同的剪切力流经功能化的流动腔底板。Harvard Pump可以控制单位时间通过的流体体积，从而实现对流体剪应力的控制。

流体剪切力与流量之间的的换算关系如下：

其中为液体黏度，为流动腔高度，为流动腔宽度^[22]。

本实验中采用h=0.127 mm，w=2.5 mm。

图像分析及数据处理：采用20倍相差显微镜和高速摄像机(ZEISS Axio Observer A1)以20帧每秒的速度跟踪血小板的运动，并录像保存。将保存的录像通过图像分析软件Image Pro Plus(IPP)和Microsoft Excel分析处理数据。

主要观察指标：①Western-blot实验检测血管性血友病因子A1(M_r 23 000)与血管性血友病因子G1324S (M_r 31 000)的蛋白条带。②在流场中，血小板在两种目的蛋白上的黏附事件数，不同流体剪应力对血小板黏附数量产生的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

生理条件下，血小板趋向、黏附并聚集在血管内壁受损部位，主要受血管性血友病因子、GPIb、胶原等黏附分子和血流剪应力的调控。由于血管性血友病因子A1在血小板初始黏附中的关键作用，任何结构突变导致其与GPIb之间反应动力学行为的失常^[23]，均会引起各种出血性和血栓性疾病，因此有关疾病的分子结构基础和动力学调控机制的研究一直是生物物理和生物化学家、临床医生和制药公司的关注焦点。

由于血管性血友病因子结构域之间存在复杂的相互作用^[24]，各结构域单体及若干相连结构域的多联体很难直接从血浆中分离出来，多采用体外基因重组技术获得。自1993年Cruz等^[25]在大肠杆菌中成功表达纯化了具有生物活性的血管性血友病因子A1单体以来，通过扫描突变技术等分子生物学技术，目前已有二十几种A1的变异体，其中部分与临床疾病相关。但业内普遍采用的文献^[14]中方法，所得到的蛋白多为包涵体表达，尽管已经被验证具有一定的活性，但纯化过程中需要尿素来变性和复性，很难保证分子的正确折叠。这种复杂实验过程的不确定性影响了蛋白的生物学活性，所以目前还没有商业化成品的供应，给研究者对血管性血友病因子A1结构与功能的深入研究带来诸多不便。

这里，实验利用Dr. Cruz实验室和张擎教授实验室已构建好的pQE9和pET28a表达载体，比照传统方法，采用降低IPTG浓度，将诱导温度从37 ℃降到30 ℃以减少蛋白的聚集，延长诱导时间至6 h使蛋白多肽有充足的时间在细胞内加工和折叠为具有生物活性的成熟蛋白分子；并尝试用超声波破碎代替溶菌酶破碎细胞的方法，以消除酶和反复冻融对目的蛋白可能裂解和性能影响，在M15和E.coli BL21(DE3)菌株成功实现了血管性血友病因子A1和血管性血友病因子G1324S的可溶性表达，得到更高产量的上清表达产物。

改进后的方法既克服了真核表达周期长的缺点，又保持了血管性血友病因子A1功能的完整性。大量培养后，即可收集上清液进行分离纯化，经镍柱(HisTrap^TM HP)亲和层析，采用浓度梯度洗脱法，分别在200 mmol/L和 300 mmol/L咪唑浓度下得到高纯度(90%以上)产品，显著简化了目的蛋白的纯化过程。经过BCA蛋白定量试剂盒进行定量，每100 mL上清液可纯化得到5.77 mg血管性血友病因子A1，6.83 mg血管性血友病因子G1324S纯品。Western-blot实验证明，血管性血友病因子A1和血管性血友病因子G1324S分别在M_r23 000和31 000处与相应抗体结合出现单一条带，说明纯化产品具有较高纯度及免疫学活性。

进一步的流动腔实验显示血小板可黏附在铺有血管性血友病因子A1和血管性血友病因子G1324S的流动腔底部，表明提取的蛋白均具有黏附血小板的生物功能；野生型血管性血友病因子A1在剪应力作用下与血小板的结合能力要高于功能减弱型(2M型)突变体血管性血友病因子G1324S，并且在高剪应力下它们的功能差异呈现加剧趋势。这种突变体的功能差异性受到2M型血管性血友病的临床数据的支持，也与Coburn等^[23]的流动腔实验结果相似。

分析这一现象的产生缘由：①如Yago等^[26]揭示的是：血流剪应力参与调控GPIbα/血管性血友病因子A1的亲和力，并随着剪应力的增加会呈现“逆锁-滑移”的趋势，但A1的2B型以及2M型突变体仅表现出滑移的趋势，即随力的增加复合物迅速解离。②但Coburn进一步的实验显示^[23]：无论A1的野生型、还是其2B型以及2M型突变体与GPIbα的结合亲和力均会呈现“滑移-逆锁-滑移”的现象，只不过2B型突变体的最佳剪应力阈值较野生型前移，而2M型突变体则较野生型后移。③或者如本实验室最近的分子动力学模拟研究所发现的^[18]：尽管A1的野生型与其2B型突变体的晶体结构就全局而言并无明显区别，但局部结构的稳定性却呈现较大差异，野生型的要优于2B型的，因此在力的作用下，2B型突变体更容易发生构象变化，暴露与GPIbα的结合位点以增加亲和力。

据此推测，A1的2M型突变体可能比野生型的局部结构更加稳定，只有在很大外力的作用下，才能产生构象变化以利于与GPIbα的结合位点的暴露，但该转捩点所对应的流体剪切应力已超越了正常生理条件。这样不仅能完满回答2B型及2M型A1剪切应力阈值的前移和后移，也能解释为何在正常的血管流动中A1的2M型突变会导致出血和凝血时间延长，或许是目前对黏附分子的理化性质和力协同调控血小板黏附机制的最好解释。但因为目前尚缺A1的2M型突变体晶体结构，故无法提供该解释的直接分子结构的证据。

然而，实验对重组蛋白在原核细胞上稳定、高效和可溶性表达的探索，将有助于获取系列高纯度、具有免疫学活性以及生物学功能的高品质蛋白，为蛋白的晶体结构分析提供基础实验条件，并为下一阶段深入研究血栓性相关疾病的分子机制奠定了基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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血管性血友病因子A1分子在大肠杆菌中的可溶性表达及功能鉴定

Soluble expression and function of von Willebrand factor-A1 in Escherichia coli

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