硬膜外注入亚甲蓝对腰椎脊髓及脊神经节结构的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.38.016

摘要/Abstract

摘要：

背景：亚甲蓝可阻碍感觉神经的异常疼痛传导，其机制是阻断缓激肽诱导的痛觉过敏，消除局部组织炎症引起的痛觉过敏反应。
目的：观察亚甲蓝溶液对大鼠腰椎脊髓及脊神经节功能的影响，明确亚甲蓝治疗椎间盘源性腰痛的安全性。
方法：将120只Wistar大鼠随机分为5组，每组24只。暴露大鼠腰节段硬膜，亚甲蓝0.2 mL组、亚甲蓝 1 mL组、亚甲蓝2 mL组分别于大鼠硬膜外注入相应量的亚甲蓝；生理盐水组大鼠硬膜外注入1 mL生理盐水；空白对照组不进行此步操作。分别在注入后30 min，2 h，24 h，72 h每组分别随机对6只大鼠进行灌流固定，并切除相应节段脊髓及神经节，行苏木精-伊红染色，在光镜下观察对比组织结构改变。
结果与结论：亚甲蓝各组大鼠注入后30 min，2 h，24 h，72 h时间脊髓及神经根苏木精-伊红染色，显示脊髓背侧面结构完整，白质与灰质分界清晰，白质中神经纤维致密，纤维间有圆形或卵圆形的神经胶质细胞核；灰质后角神经纤维致密；神经元细胞，胞核圆形染色浅，核仁明显；细胞群间有成束的神经纤维。亚甲蓝各组大鼠腰椎脊髓及脊神经节与生理盐水组及空白对照组比较均无明显的组织结构变化。结果表明硬膜外注入1%亚甲蓝对脊髓及脊神经结构无明显影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 亚甲蓝注射液, 脊髓, 神经节, 安全性

Abstract:

BACKGROUND: Methylene blue can hinder abnormal pain conduction via the sensory nerve, and its mechanism is to block bradykinin-induced hyperalgesia and eliminate pain caused by local tissue inflammation.
OBJECTIVE: To observe the influence of methylene blue solution on the lumbar spinal cord and spinal ganglia function of rats, and to investigate whether methylene blue is safe for treating discogenic low back pain.
METHODS: Totally 120 Wistar rats were randomly divided into five groups: three experimental groups, a saline control group and a blank control group, n=24 in each group. Lumbar segmental dura was exposed in rats. In the three experimental groups, 0.2, 1, and 2 mL methylene blue were injected epidurally, respectively. The saline control group was subjected to the epidural injection of 1 mL saline. In the blank control group, there was no treatment. Six rats from each group were selected randomly and perfused at 30 minutes, 2 hours, 24 hours, 72 hours after injection, respectively. Then, the corresponding segments of the spinal cord and ganglions were removed. Hematoxylin eosin staining was used for comparing histological and structural changes under light microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining showed that at 30 minutes, 2 hours, 24 hours and 72 hours after injection of methylene blue, the spinal dorsal side exhibited the structural integrity, clear boundaries between the white matter and gray matter, dense nerve fibers in the white matter, and round or oval nuclei of glial cells among fibers; dense nerve fibers in the posterior horn of gray matter; light-colored neuronal nuclei with prominent nucleoli; a bundle of nerve fibers among cell populations. There was no significant change in tissue structure of lumbar spinal cord and spinal ganglia between the experimental groups and the saline control group
or between the experimental groups and the blank control group. Thus, the epidural injection of 1% methylene blue has no significant effect on the spinal cord and spinal nerve structures.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: spinal cord, methylene blue, ganglia

中图分类号:

R318

刘春雨，金丽，彭宝淦. 硬膜外注入亚甲蓝对腰椎脊髓及脊神经节结构的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(38): 6160-6164.

Liu Chun-yu, Jin Li, Peng Bao-gan. Lumbar epidural injection of methylene blue affects the spinal cord and spinal ganglia structures[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(38): 6160-6164.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年6月在中国军事医学科学院完成。

材料：

实验动物：清洁级Wistar大鼠120只，足3月龄，体质量250-300 g，雌雄不限。由中国军事医学科学院动物中心提供，许可证号SCXK-(军)2011-004。

实验方法：

动物实验分组及方法：将120只Wistar大鼠随机分为3个实验组、1个生理盐水对照组和1个空白对照组，每组24只。经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于手术台上，无菌条件下以L₁椎体棘突为中心，纵行切开背部皮肤约2.5 cm，钝性分离棘突两侧椎旁肌肉达椎板表面，手术

硬膜外注入亚甲蓝对腰椎脊髓及脊神经节结构的影响实验主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
戊巴比妥钠注射液(批号：ACX2390762)	上海第一生化制药公司
40 g/L多聚甲醛、苏木精-伊红染色试剂盒、双蒸水、体积分数70%，80%，90%，95%，100%乙醇溶液	中国军事医学科学院动物中心提供
亚甲蓝注射液(批号：2011061215)	山东华鲁制药有限公司
苏木精染液	北京赛驰生物科技有限公司
BT100K蠕动泵	保定申辰泵业有限公司
石蜡切片机	英国Thermo Fisher Scientific公司
Olympus显微成像系统	日本奥林巴斯公司

器械牵开两侧椎旁肌，暴露椎板和椎体棘突，咬骨钳咬除腰椎体棘突及椎板，剥离黄韧带，然后暴露腰节段硬膜,手术中避免损伤该阶段脊髓及神经节。实验组分别用亚甲蓝0.2 mL组)、亚甲蓝1 mL组、亚甲蓝2 mL组滴入大鼠硬膜外；生理盐水对照组将1 mL生理盐水滴入；空白对照组不行此步操作。术后用青霉素冲洗切口，然后逐层缝合切口，继续饲养，恒温保暖，供食供水。然后分别在滴入后 30 min，滴入后2，24，72 h时间段上每组分别随机对6只大鼠进行灌流固定，并切除相应节段脊髓及神经节，行苏木精-伊红染色，在光镜下观察对比组织结构改变。

分组及各组处理方法：
组别	处理方法
空白对照组	大鼠硬膜外不滴入任何液体
生理盐水组	大鼠硬膜外滴入1 mL生理盐水
亚甲蓝0.2 mL组	大鼠硬膜外滴入0.2 mL亚甲蓝
亚甲蓝1 mL组	大鼠硬膜外滴入1 mL亚甲蓝
亚甲蓝2 mL组	大鼠硬膜外滴入2 mL亚甲蓝

脊髓取材及苏木精-伊红染色：每组大鼠于相应分组时间段内取材麻醉状态下剖胸，通过左心室及升主动脉插管灌流固定，先用生理盐水400 mL冲洗至流出澄清液，再用4 g/L多聚甲醛液约300 mL灌流固定。固定结束后2 h开始解剖椎管，完整取出腰椎节段脊髓约1 cm脊髓组织及对应节段的脊神经节，经脱水、石蜡包埋，切片并进行苏木精-伊红染色。

主要观察指标：不同时间点各组大鼠L₁节段脊髓后角正中区形态学观察。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

亚甲蓝是一种氧化还原剂具有较强的亲神经性，可阻碍感觉神经的异常疼痛传导，在临床上应用于局部注射治疗疼痛，其机制是阻断缓激肽诱导的痛觉过敏，消除局部组织炎症引起的痛觉过敏反应^[6]。亚甲蓝应用于临床治疗椎间盘源性腰痛现已得到多数学者认可，术前采用标准的腰椎间盘造影术检查。椎间盘造影阳性包括两方面内容：一是在推注对比剂后，C臂透视见其纤维环破裂，对比剂由髓核处漏出至纤维环外1/3或腰椎管硬膜外；二是患者诉剧烈腰部疼痛感，且疼痛相似于平时的腰痛或准确复制了平时的腰痛或牵涉痛^[7]。此时就证实为椎间盘造影阳性，通过腰椎间盘造影针立即推入1%亚甲蓝1.0-2.0 mL。在椎间盘内注入亚甲蓝来治疗椎间盘源性腰痛，收到了良好的治疗效果，临床研究证明亚甲蓝能灭活椎间盘内的神经纤维和伤害感受器，降低了椎间盘内致痛神经纤维的痛阈，能有效缓解症状，且长期临床观察疗效稳定^[8]。但曾有学者对椎间盘造影作为诊断椎间盘源性腰痛的依据提出质疑^[9-11]，认为无症状的患者和有其他疼痛来源患者也可以出现阳性表现。

大量研究表明，假阳性率降低可以通过相邻节段的对比以及保持注射对比剂低压力注射而实现^[12-14]。任何原因刺激椎间盘的感觉神经末梢均可引起椎间盘源性腰痛。疼痛被认为是由机械因素和化学因素刺激纤维环的伤害性感受器所引起。有学者研究发现，椎间盘源性腰痛患者病理疼痛椎间盘的特征性改变是沿着由纤维环外层到髓核的裂隙形成由大量神经纤维分布的血管肉芽组织条带区^[15-17]。研究表明，在血管肉芽组织区域内有丰富的SP阳性神经，局部炎症可能刺激肉芽组织内的疼痛感受器而产生疼痛。如果能够毁灭这些肉芽组织内的疼痛感受神经纤维和神经末梢，椎间盘来源的疼痛可能会减轻或缓解。有研究表明，电子显微镜下观察到皮内亚甲蓝注射能够毁灭皮肤神经末梢^[18-28]。大量研究证实了椎间盘内注射亚甲蓝治疗椎间盘源性腰痛及亚甲蓝镇痛的治疗效果。

本实验之所以选择的亚甲蓝，是因为它是一种化学性质活泼的氧化还原剂。动物实验发现，亚甲蓝作为鸟苷酸环化酶的抑制剂，可通过降低组织局部浓度，阻断缓激肽诱导的痛觉过敏^[29]。但是亚甲蓝的不良反应一直以来没有文献报道，尤其是将亚甲蓝作用到硬脊膜上，是否会对脊髓功能产生不良的影响。所以作者设计了这项动物试验以了解在亚甲蓝治疗椎间盘源性腰痛时，亚甲蓝顺着髓核到纤维环外层的裂隙流出，到椎管内硬膜外腔后是否会渗透到脊髓内对脊髓神经结构产生影响。通过本次实验用亚甲蓝溶液0.2，1，2 mL注入大鼠脊髓硬脊膜外分别在注射后30 min，2 h，24 h，72 h的时间段内观察L₁节段的病理学苏木精-伊红染色，与同样剂量及时间段内的正常组及盐水对照组相比较，脊髓及神经节结构完整，大鼠手术结束后，继续饲养过程中行为学观察：大鼠精神状态正常，能饮食水，四肢运动功能正常。

结论：实验可以看到亚甲蓝溶液0.2，1，2 mL 3种不同剂量分别在注射后30 min，2 h，24 h，72 h的不同时间段上对大鼠脊髓及脊神经节无明显的破坏性。如果临床治疗中应用亚甲蓝溶液时，亚甲蓝溶液顺着纤维环裂隙流入硬脊膜上时，对脊髓及脊神经节不会引起不良反应。通过本实验得到了初步的动物实验数据，可以确定临床上亚甲蓝溶液治疗椎间盘源性腰痛是安全的。

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