乌司他丁抑制破骨细胞活化及与基质金属蛋白酶2和9的关系：预防假体骨溶解的潜在价值

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.35.011

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (35): 5633-5639.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.35.011

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乌司他丁抑制破骨细胞活化及与基质金属蛋白酶2和9的关系：预防假体骨溶解的潜在价值

茹江英，赵建宁，郭亭，俞磊，丁浩，江辉

解放军第二军医大学附属南京临床医学院(解放军南京军区南京总医院)，江苏省南京市 210002

修回日期:2014-07-29 出版日期:2014-08-27 发布日期:2014-08-27
通讯作者: 赵建宁，教授，博士生导师，解放军第二军医大学附属南京临床医学院(解放军南京军区南京总医院)，江苏省南京市 210002
作者简介:茹江英，男，1976年生，山西省晋城市人，汉族，2006年南通大学毕业，硕士，现工作于武警江苏省总队医院骨科，副主任医师，主要从事关节外科、创伤骨科方面的研究。
基金资助:
江苏省基础研究计划(自然科学基金)-面上研究项目(BK2012776)

Inhibitory effect of ulinastatin on osteoclast activation and the relationship of ulinastatin to matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9: potential of preventing prosthetic osteolysis

Ru Jiang-ying, Zhao Jian-ning, Guo Ting, Yu Lei, Ding Hao, Jiang Hui

Nanjing Clinical Medical School Affiliated to the Second Military Medical University of Chinese PLA (Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command of Chinese PLA), Nanjing 210002, Jiangsu Province, China

Revised:2014-07-29 Online:2014-08-27 Published:2014-08-27
Contact: Zhao Jian-ning, Professor, Doctoral supervisor, Nanjing Clinical Medical School Affiliated to the Second Military Medical University of Chinese PLA (Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command of Chinese PLA), Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
About author:Ru Jiang-ying, Master, Associate chief physician, Nanjing Clinical Medical School Affiliated to the Second Military Medical University of Chinese PLA (Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command of Chinese PLA), Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Jiangsu Province Basic Research Program (Natural Science Foundation)-General Project, No. BK2012776

摘要/Abstract

摘要：

背景：推测尿胰蛋白酶抑制剂可能在假体磨屑诱发的机体炎症反应中，对局部组织在缺血缺氧、长期慢性炎症环境下起保护作用，并可抑制破骨细胞的增殖和活化。
目的：探讨尿胰蛋白酶抑制剂在核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)诱导RAW264.7细胞分化、增殖及形成成熟破骨细胞中的作用及与基质金属蛋白酶2和9的关系。
方法：采用不同浓度尿胰蛋白酶抑制剂(0，500，5 000 U/mL乌司他丁)处理小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7后24，48，72 h。实验分为4组：空白组(RAW264.7细胞)、RANKL诱导组(0 U/mL乌司他丁)、500 U/mL乌司他丁组和5 000 U/mL乌司他丁组。
结果与结论：①MTT法检测结果表明，尿胰蛋白酶抑制剂乌司他丁浓度在0-5 000 U/mL对RAW264.7细胞增殖无明显影响(P > 0.05)。②抗酒石酸酸性磷酸酶染色法检测结果表明，与RANKL诱导组相比，乌司他丁组抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数量均显著减少(P < 0.05)，呈时间剂量依赖关系。③免疫组织化学结果显示，与RANKL诱导组比较，乌司他丁组的基质金属蛋白酶9染色阳性细胞百分率均显著降低。④Western blot结果显示，单独RAW264.7细胞仅表达少量基质金属蛋白酶9，加入RANKL 48 h后基质金属蛋白酶9蛋白大量表达，5 000 U/mL乌司他丁组培养72 h后, 基质金属蛋白酶9蛋白表达显著减少。⑤明胶酶谱分析结果显示，与RANKL诱导组比较，5 000 U/mL乌司他丁组基质金属蛋白酶9活性水平均显著降低(P < 0.05)。结果表明，尿胰蛋白酶抑制剂对RANKL诱导破骨细胞活化具有一定的抑制作用，且可降低基质金属蛋白酶9的表达水平及活性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

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关键词: 植入物, 人工假体, 乌司他丁, 骨组织工程, 基质金属蛋白酶2, 基质金属蛋白酶9, 破骨细胞, 人工关节, 无菌性松动, 骨溶解, 江苏省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: It is presumed that urinary trypsin inhibitor could have protective effects on local and systemic tissues and could inhibit osteoclast proliferation and activation under long-term chronic inflammation conditions and in ischemic and anoxic environment which was induced by prosthetic wear.
OBJECTIVE: To investigate the inhibitory effect of ulinastatin on receptor activator for nuclear factor-κb ligand-induced differentiation, proliferation and osteoclastogenesis of RAW264.7 cells and its effects on matrix metalloproteinase-2, matrix metalloproteinase-9 expression level and activity.
METHODS: Mouse monocyte/macrophage cell line RAW264.7 was treated with different concentrations of urinary trypsin inhibitor (0, 500, 5 000 U/mL) for 24, 48 and 72 hours. Experiments were divided into four groups: the blank group (RAW264.7 cells), receptor activator for nuclear factor-κb ligand-induced group (0 U/mL ulinastatin), 500 U/mL ulinastatin group and 5 000 U/mL ulinastatin group.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) MTT results indicated that there was no significant difference on the proliferation of RAW264.7 cells treated with urinary trypsin inhibitor at 0-5 000 U/mL (P > 0.05) (2) Tartrate-resistant acid phosphatase staining results revealed that compared with receptor activator for nuclear factor-κb ligand-induced group, the number of tartrate-resistant acid phosphatase-positive cells was significantly less in the ulinastatin group (P < 0.05), showing a time-dose dependent manner. (3) Immunohistochemisical results found that compared with receptor activator for nuclear factor-κb ligand-induced group, the percentage of matrix metalloproteinase-9-positive cells was apparently lower in the ulinastatin group. (4) Western blot assay results demonstrated that matrix metalloproteinase-9 expression was low in the RAW264.7 cells alone. At 48 hours after addition of receptor activator for nuclear factor-κb ligand, matrix metalloproteinase-9 protein expression was large. At 72 hours after culture in the 5 000 U/mL ulinastatin group, matrix metalloproteinase-9 protein expression was evidently reduced. (5) Gelatin zymography results showed that compared with the receptor activator for nuclear factor-κb ligand-induced group, matrix metalloproteinase-9 expression was significantly lower in the 5 000 U/mL ulinastatin group (P < 0.05). Results suggested that urinary trypsin inhibitor inhibited receptor activator for nuclear factor-κb ligand-induced osteoclastogenesis and diminished matrix metalloproteinase-9 expression and activity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

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Key words: trypsin inhibitors, RANK ligand, osteoclasts, matrix metalloproteinase 2, matrix metalloproteinase 9

中图分类号:

R318

茹江英，赵建宁，郭亭，俞磊，丁浩，江辉. 乌司他丁抑制破骨细胞活化及与基质金属蛋白酶2和9的关系：预防假体骨溶解的潜在价值[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(35): 5633-5639.

Ru Jiang-ying, Zhao Jian-ning, Guo Ting, Yu Lei, Ding Hao, Jiang Hui. Inhibitory effect of ulinastatin on osteoclast activation and the relationship of ulinastatin to matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9: potential of preventing prosthetic osteolysis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(35): 5633-5639.

图/表（结果） 2

2.1 乌司他丁对RAW264.7细胞增殖活性的影响 将不同浓度及不同时间尿胰蛋白酶抑制剂作用下的RAW264.7细胞进行MTT分析，尿胰蛋白酶抑制剂浓度分别为0，500，5 000 U/mL，MTT法检测加入乌司他丁后24，48，72 h的吸光度值(表1)。0-5 000 U//mL的尿胰蛋白酶抑制剂乌司他丁对RAW264.7细胞增殖无明显影响(P > 0.05)。

2.2 尿胰蛋白酶抑制剂抑制RANKL诱导RAW264.7细胞形成破骨细胞 采用TRAP染色法光镜下观察RAW264.7细胞增殖、活化为成熟破骨细胞的情况(图1)。光镜下计数空白组未见TRAP阳性细胞；RANKL诱导RAW264.7细胞48 h后，RAW264.7细胞变大，有伪足伸出，TRAP染色阳性细胞呈酒红色，诱导组成熟破骨细胞数量为(195.701± 5.262)/cm²；加入不同浓度尿胰蛋白酶抑制剂(0，500，5 000 U/mL)24，48，72 h后，TRAP阳性细胞逐渐减少，呈时间剂量依赖关系；加入500，5 000 U/mL的尿胰蛋白酶抑制剂共培养72 h后，光镜下TRAP阳件细胞数分别为(78.802±2.793)/cm²和(23.204±1.405)/cm²；500 U/mL乌司他丁组和5 000 U/mL乌司他丁组分别与与RANKL诱导组比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)，且500 U/mL乌司他丁组和5 000 U/mL乌司他丁组之间差异也有显著性意义(P < 0.05，见表2，图2。

2.3 尿胰蛋白酶抑制剂抑制基质金属蛋白酶9的表达和活性

免疫组织化学结果：光镜下观察基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9阳性细胞的胞浆内有不同程度染色的棕黄色或褐色颗粒(图3)。与RANKL诱导组相比，500 U/mL乌司他丁组中基质金属蛋白酶9染色阳性细胞百分率明显降低(10.911±1.598)%(P < 0.05)，而5 000 U/mL乌司他丁组中基质金属蛋白酶9染色阳性细胞百分率则显著降低(5.509±0.784)%(P < 0.01)；但在不同组间基质金属蛋白酶2阳性细胞百分率差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3、图4。

Western blot结果：单独RAW264.7细胞仅表达少量基质金属蛋白酶9，加入RANKL 48 h后可检测到大量基质金属蛋白酶9蛋白表达，加入尿胰蛋白酶抑制剂(5 000 U/mL)共培养72 h后，基质金属蛋白酶9蛋白表达显著减少；而基质金属蛋白酶2在不同组的表达无明显变化(图5)。明胶酶谱分析结果显示，与空白对照组基质金属蛋白酶9活性水平(82.786±0.772)比较，RAW264.7细胞经RANKL诱导48 h后基质金属蛋白酶9活性水平(172.146±0.242)显著增高 (P < 0.01)，而500 U/mL乌司他丁组和5 000 U/mL乌司他丁组的基质金属蛋白酶9活性水平分别为(121.585±0.422)和(98.125±0.373)，较RANKL诱导组均显著降低(P < 0.05)；但不同组间基质金属蛋白酶2活性水平差异无显著性意义(P > 0.05)，见表4、图6。

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引言

大量研究表明，人工关节置换后假体磨屑所引发机体产生的一系列炎症级联反应的失衡，是最终导致假体周围骨溶解和发生假体无菌性松动的主要原因^[1-3]。如何利用药物通过长期作用机制来阻断炎症级联反应的放大，实现假体周围组织微环境下的骨自稳状态，从而防止假体周围骨溶解和假体无菌性松动的发生，是目前关节外科研究的热点和难点。目前研究较多的药物主要包括双膦酸盐类、大环内酯类及四环素类，这些药物对核因子κB通路和成熟破骨细胞形成都有一定的抑制作用，遗憾的是却都存在一些临床上难以忽略的缺陷^[4-10]。

尿胰蛋白酶抑制剂作为一种广谱蛋白酶抑制剂，具有下调促炎症因子产生和抑制核因子κB激活的作用^[11]，近年已被成功用于内毒素导致急、慢性心、肺、肾等重要器官炎症反应的救治及抑制多种肿瘤细胞的侵袭转移^[12-13]。与糖皮质激素相比，尿胰蛋白酶抑制剂具有与其相类似的抑制炎症递质释放的作用，但无明显不良反应而被广泛在日本和中国应用于临床。近年来有研究报道，围手术期应用尿胰蛋白酶抑制剂能降低下肢深静脉血栓和肢体功能障碍的发生风险，改善高凝状态并保护重要脏器功能^[14]；对于骨科大手术，麻醉后即时静脉输注尿胰蛋白酶抑制剂可显著减少术后早期出血量^[15]。此外，研究表明尿胰蛋白酶抑制剂可抑制兔退变髓核细胞对诱导型一氧化氮合酶、基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶3的表达，可能对慢性炎症引发的椎间盘退变的防治具有潜在价值^[16]。但关于尿胰蛋白酶抑制剂在磨屑颗粒诱导的假体周围骨溶解中的保护作用，迄今为止尚未查到相关文献报道。乌司他丁是一种存在于人尿中的胰蛋白酶抑制剂。

近年来，金属磨屑的致瘤性和基质金属蛋白酶在假体磨屑导致假体周围骨溶解中的作用正逐渐被引起重视^[17-18]。有研究表明假体周围界膜中基质金属蛋白酶1，2，3，9，10，12，13和MT-1-MMP的过表达，与假体周围骨溶解的发生有关^[18-19]。假体周围骨溶解所导致的假体无菌性松动是导致人工关节置换后假体固定失败、制约假体使用寿命的主要远期并发症^[1-3]。目前研究表明，骨微环境的自稳状态失衡是导致人工关节置换后发生假体无菌性松动远期并发症的主要原因^[20]。炎症早期通过多重级联反应，形成骨微环境的自稳状态。随着磨屑颗粒在体内的逐渐增多、堆积，骨微环境的自稳状态会出现失衡，最终破骨细胞的活化、增殖及破骨作用超过成骨细胞的成骨作用而发生假体周围骨溶解^[20]。近年研究表明假体周围组织缺氧被认为是发生假体无菌性松动的又一重要因素。对于破骨细胞、组织巨噬细胞和成纤维细胞，能相对更好地适应缺氧状态。与之相反的是，成骨细胞系在缺氧条件下却显示出生长、分化和矿化能力下降，这也可能是导致破骨细胞的功能较成骨细胞占优势的原因之一^[20]。实验旨在探讨乌司他丁对核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κb ligand，RANKL)诱导破骨细胞活化是否具有抑制作用及与基质金属蛋白酶2，基质金属蛋白酶9的关系，从而为假体周围骨溶解的防治提供新思路。

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材料方法

设计：随机对照细胞学试验。

时间及地点：实验在解放军第二军医大学南京临床医学院(南京军区南京总医院)骨科研究所完成。

材料：

实验方法：

细胞培养及药物干预：在无血清RPMI1640培养基(含体积分数10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素)37 ℃、体积分数5%的CO₂条件下，培养小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7，每3 d换液1次，细胞长至70%-80%单层融合时，进行0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶消化传代。取第3，4代培养细胞洗涤3次，加入DMEM全培养液配制成细胞混悬液，在细胞计数后将细胞浓度调整至4×10⁸ L^-¹，细胞活力经锥虫蓝排除法检测后均大于95%。滴加细胞悬液至培养板中，接种细胞于6孔板，3 mL/孔，贴壁后加无血清RPMIl640培养基同步化。

噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖：RAW264.7细胞以5×10⁷ L^-¹密度传96孔板，用不同浓度尿胰蛋白酶抑制剂(0，500，5 000 U/mL乌司他丁)刺激24，48，72 h后，每孔加入110 μL无血清RPMI1640培养基配制的MTT试剂(5 g/L)，37 ℃，体积分数5%CO₂，继续培养4 h后弃上清，加入二甲亚砜150 μL/孔孵育10 min，在酶标仪570 nm波长处测吸光度A值，计算乌司他丁对RAW264.7细胞增殖活性的影响。

抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色检测成熟破骨细胞：取各组细胞以1×10⁴/孔接种于6孔板，用50 μg/L的RANKL (R&D公司)诱导，每3 d换液1次，6 d后分别加入500 U/mL和5 000 U/mL的尿胰蛋白酶抑制剂各处理24 h。用柠檬酸盐/丙酮溶液固定细胞30 s，以萘酚ASBI磷酸盐作为底物，在37 ℃ TRAP染液中孵育1 h，蒸馏水洗3次后苏木精复染2 min，干燥后聚苯乙烯+酞酸丁二酯+二甲苯封固，光镜下观察含有2个细胞核以上染色阳性的多核巨细胞为破骨细胞。100倍光镜下任选10个视野，记录TRAP阳性破骨细胞平均数。

免疫组织化学SP法检测基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9蛋白表达阳性细胞百分数：用体积分数3% H₂O₂ 封闭内源性过氧化物酶10 min，柠檬酸缓冲液(0.01 mmol/L，pH 6.0)微波修复抗原15 min，加入基质金属蛋白酶一抗 (1∶50)的标本后，用胰酶37 ℃孵育一抗5 min，4 ℃条件下过夜，再行二抗37 ℃孵育30 min，采用DAB显色剂、苏木精复染细胞核，常规封固。以胞浆质出现棕褐色或褐色颗粒为基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9蛋白表达阳性细胞。在每张切片上随机选取10个视野，观察破骨细胞中基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9蛋白表达情况，高倍视野(×200)下每张片随机选取6个阳性细胞数最多的视野，计算出平均阳性细胞百分数。

Western blot法分析基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9蛋白表达变化：用RANKL诱导 RAW264.7细胞后，细胞裂解液冰上孵育裂解细胞30 min，将匀浆于15 000 r/min， 4 ℃离心1 min。处理提取总蛋白。BCA蛋白定量试剂盒定量后吸取40 μg蛋白，用质量浓度为10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳后，再转入聚偏氟乙烯(PVDF)膜。将膜用封闭液(3%脱脂牛奶/0.1%PBST)封闭后，用基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9单克隆抗体(均为1∶1 000；1 mg/L) 室温下反应2 h，过程中不断摇动，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体(1∶10 000)。洗涤后经增敏化学发光法显色显色5 min。结果经光密度面积积分分析，用与内参照β肌动蛋白产物条带的比值作为相对含量。

明胶酶谱法测定基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9活性：取各组细胞以1×10⁴/孔接种在6孔板上，用1640培养基(含体积分数10%小牛血清)培养至80%汇合，再换1640培养基(含体积分数0.1%小牛血清)继续培养48 h，收集上清液。采用牛血清白蛋白(BSA)法测定上清液总蛋白含量，取上清液(含50 μg总蛋白)与非还原性上样缓冲液混匀，在10% SDS-PAGE(含0.1%明胶)凝胶电泳分离，恒压电泳3.0-4.0 h。凝胶电泳结束后移入2.5% TritonX-100溶液中洗脱4次，15 min/次；洗涤液洗涤3次，5 min/次。加入明胶酶底物缓冲液，在37 ℃中孵育18 h。考马斯亮蓝染色液染色4 h，脱色4-8 h，直至出现明显清晰的负染条带。在灰阶模式下扫描电泳凝胶，设定参考值后应用BandScan5.0软件分析基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9活性，用条带的酶解量表示，条带的酶解量=条带面积× (背景灰度-条带灰度)，每组设3个平行样。相对分子质量为92 000，86 000，72 000和66 000的明胶溶解条带分别代表基质金属蛋白酶9酶原，活化基质金属蛋白酶9，基质金属蛋白酶2酶原和活化基质金属蛋白酶2。

主要观察指标：RAW264.7细胞增殖活性、破骨细胞数量及细胞内基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9的活性及表达水平。

统计学分析：应用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，计量资料以x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

目前研究表明与破骨细胞活化、增殖有关的信号途径主要包括：①MAP激酶途径(JNK/c-jun/AP-1)。②Akt/PI3K途径。③核因子κB信号传导途径。④NFAT途径及NALP3炎症复合体途径^[21]。在所有破骨细胞激活途径中，核因子κB信号传导途径是破骨细胞分化、成熟的最经典的途径，也是目前用来研究假体周围骨溶解机制的最热的信号传导途径之一。RANKL和破骨细胞表面的RANK结合后，激活破骨细胞，启动核因子κB信号传导途径，随后引起破骨细胞的分化和增殖。炎症反应、肿瘤侵袭及假体周围骨溶解的发生均涉及胞外基质的降解、细胞迁移运动及信号传导等诸多因素，而基质金属蛋白酶在胞外基质降解中具有非常重要的作用^[18]。基质金属蛋白酶可由炎性细胞和多种基质细胞产生，是一类依赖Zn²⁺、Ca²⁺高度保守的内切蛋白水解酶家族，几乎能降解细胞外基质的所有成分^[18]。

骨基质中的基质金属蛋白酶参与了骨细胞外基质的动态平衡，在病理条件下，基质金属蛋白酶的产生增多，可导致骨细胞外基质的大量降解，骨结构的破坏而导致骨溶解^[18]。基质金属蛋白酶9又称明胶酶B，是基质金属蛋白酶中分子质量最大(以92k酶原形式存在)、最重要的一种的蛋白酶^[22]。Engsig等^[23]研究认为基质金属蛋白酶2、9降解胶原产物可趋化破骨细胞前体细胞或破骨细胞向成骨细胞聚集，诱导破骨细胞分化、成熟。有研究表明基质金属蛋白酶9在松动假体周围组织中高表达，抑制基质金属蛋白酶9能减轻磨损颗粒引起的骨吸收效应^[19]。因此，通过抑制基质金属蛋白酶9的活性来防治假体周围骨溶解，是药物预防人工关节置换后假体无菌性松动的又一个重要思路。尿胰蛋白酶抑制剂作为人体肝脏分泌的一种糖蛋白，是一种典型的Kuniz型广谱蛋白酶抑制剂，其可通过抑制炎症递质释放、清除氧自由基、稳定溶酶体膜、改善微循环和组织灌注的作用来达到保护机体的作用。有研究表明，人体在正常生理状态下，仅存在少量有活性的尿胰蛋白酶抑制剂，而在炎症、肿瘤及应激条件下尿胰蛋白酶抑制剂明显增多，且对炎症反应和肿瘤侵袭起到抑制作用^[12-13]。

本实验免疫组织化学和明胶酶谱结果表明，RANKL诱导24 h后基质金属蛋白酶9蛋白阳性细胞显著增多且活性明显增高。在与尿胰蛋白酶抑制剂(5 000 U/mL)共培养24 h后，基质金属蛋白酶9阳性细胞及活性显著降低，且呈剂量依赖性关系。上述结果表明基质金属蛋白酶9蛋白表达对RANKL诱导破骨细胞分化、成熟至关重要，同时尿胰蛋白酶抑制剂对基质金属蛋白酶9蛋白表达具有一定抑制作用。有研究表明，在破骨细胞分化、增殖、成熟过程中的早期阶段(RANKL诱导24 h内)，MAPK-NFATc1是RANKL信号级联反应中的主要信号传导途径，并可上调基质金属蛋白酶9表达，而伴随着NFAT-c1的诱导，基质金属蛋白酶9的表达处于破骨细胞成熟过程中的中期阶段^[24]。实验TRAP染色阳性细胞数量及活性结果显示，RANKL诱导48 h后RAW264.7细胞变大，有伪足伸出，TRAP染色阳性细胞呈酒红色，其TRAP染色阳性细胞数量及活性显著升高；与不同浓度的尿胰蛋白酶抑制剂共培养48 h后，光镜下观察TRAP阳性细胞数量及活性显著降低，呈剂量依赖关系。结果表明尿胰蛋白酶抑制剂对RANKL诱导RAW264.7细胞活化为成熟破骨细胞具有抑制作用，尤其乌司他丁5 000 U/mL对成熟破骨细胞形成的抑制作用最强。作者推测，尿胰蛋白酶抑制剂可能是通过抑制基质金属蛋白酶9蛋白的表达和活性，来抑制RANKL诱导破骨细胞的分化、增殖和成熟。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程
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乌司他丁抑制破骨细胞活化及与基质金属蛋白酶2和9的关系：预防假体骨溶解的潜在价值

Inhibitory effect of ulinastatin on osteoclast activation and the relationship of ulinastatin to matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9: potential of preventing prosthetic osteolysis

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