体外构建内皮抑素基因真核表达载体抑制血管生成

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.008

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (29): 4636-4641.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.008

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体外构建内皮抑素基因真核表达载体抑制血管生成

邵佳甲¹，于音²，姜涛³

¹长春职业技术学院食品与生物技术分院，吉林省长春市 130033；吉林大学白求恩第三医院，²神经外二科，³血管外科，吉林省长春市 130033

修回日期:2014-06-26 出版日期:2014-07-09 发布日期:2014-07-09
通讯作者: 于音，博士，主治医师，吉林大学白求恩第三医院神经外科，吉林省长春市 130033
作者简介:邵佳甲，女，1982年生，吉林省长春市人，汉族，2008年吉林农业大学生物工程专业毕业，硕士，主要从事制药等相关生物技术的教学与研究。

Construction of pcDNA3-Endo eukaryon expression plasmid and angiogenesis inhibition in vitro

Shao Jia-jia¹, Yu Yin², Jiang Tao³

¹School of Food Production Technology and Biotechnology, Changchun Vocational Institute of Technology, Changchun 130033, Jilin Province, China; ²Department of Neurosurgery, the Third Affiliated Hospital (China-Japan Union Hospital of Jilin University), Changchun 130033, Jilin Province, China; ³Department of Vascular Surgery, the Third Affiliated Hospital (China-Japan Union Hospital of Jilin University), Changchun 130033, Jilin Province, China

Revised:2014-06-26 Online:2014-07-09 Published:2014-07-09
Contact: Yu Yin, M.D., Attending physician, Department of Neurosurgery, the Third Affiliated Hospital (China-Japan Union Hospital of Jilin University), Changchun 130033, Jilin Province, China
About author:Shao Jia-jia, Master, School of Food Production Technology and Biotechnology, Changchun Vocational Institute of Technology, Changchun 130033, Jilin Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：胶质瘤的根除治疗至今仍是一大难题，抗血管生成治疗胶质瘤有望成为新的有效途径。

目的：证实内皮抑素在体外对血管生长的抑制作用，为今后利用其抑制肿瘤生长奠定实验室基础。

方法：取Wistar大鼠肝脏，提取mRNA后利用RT-PCR获取内皮抑素cDNA片段。碱裂解法小量提取质粒pcDNA3。重组质粒pcDNA3-Endo的构建。重组pcDNA3-Endo真核表达载体转染骨髓间充质干细胞。RT-PCR及Western Blot检测内皮抑素基因的表达。MTT法检测ECV-304细胞增殖抑制实验。体外实验共分成4个组：重组质粒组、空载质粒组、脂质体对照组及空白对照组。

结果与结论：成功构建pcDNA3-Endo重组真核表达质粒，pcDNA3-Endo质粒能在体外有效转录并分泌内皮抑素基因，转染了外源pcDNA3-Endo质粒的ECV-304细胞增殖明显受到抑制。结果提示内皮抑素基因能在体外有效抑制血管内皮细胞的增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 血管内皮细胞, 内皮抑素, 血管生成, 人脐静脉血管内皮细胞, 间充质干细胞, 质粒, 转染

Abstract:

BACKGROUND: The eradication therapy of glioma is the major problem, and anti-angiogenesis therapy is a potential treatment of glioma.

OBJECTIVE: To confirm the inhibiting effect of endostatin on angiogenesis in vitro, and to lay the foundation in inhibiting the growth of tumor by endostatin in the future.

METHODS: Endostatin mRNA was extracted from the liver of Wistar rats by Trizol and endostatin cDNA was synthesized by RT-PCR. Endostatin cDNA and pcDNA3 were connected and pcDNA3-Endo recombined plasmid was constructed successfully. The recombinant pcDNA3-Endo was transfected into bone marrow mesenchymal stem cells by Lipofectamine. The expression of endostatin was identified by RT-PCR and western blot analysis. Endostatin proteinum activity was detected by ECV-304 cell proliferation inhibition experiment using MTT assay. The in vitro experiments were divided into four groups: recombinant plasmid group, vector plasmid group, liposome control group and blank control group.

RESULTS AND CONCLUSION: PcDNA3-Endo eukaryon expression plasmid was constructed successfully. Endostatin gene can be transcribed and expressed effectively in vitro by pcDNA3-Endo plasmid. The growth of ECV-304 cell was inhibited obviously by pcDNA3-Endo. The growth of vascular endothelial cells can be inhibited obviously by endostatin gene.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: endostatins, endothelial cells, neovascularization, physiologic, mesenchymal stem cells

中图分类号:

R318

邵佳甲，于音，姜涛. 体外构建内皮抑素基因真核表达载体抑制血管生成[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(29): 4636-4641.

Shao Jia-jia, Yu Yin, Jiang Tao. Construction of pcDNA3-Endo eukaryon expression plasmid and angiogenesis inhibition in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(29): 4636-4641.

图/表（结果） 3

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引言

材料方法

设计：单一样本观察，形态学描述。

时间及地点：实验于2012年12月至2013年12月在吉林大学药学院生物工程实验室及长春职业技术学院生物技术实验室完成，前者属吉林大学重点实验室。

材料：

实验动物：雄性Wistar大鼠1只，体质量120 g左右，购自吉林大学基础医学院动物培养中心，实验动物级别为二级，许可证号：SCXK-(吉)2012-0010。

实验中对动物处置符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》要求。

实验方法：

内皮抑素cDNA片段的获取：①取Wistar大鼠1只，断头处死，剥离肝脏，-20 ℃预冷数分钟，倒入液氮，将组织研成粉末，把100 mg组织粉末转移至1 mL Trizol中。②将样品转移至无菌1.5 mL Ep管中，15-30 ℃，放置5 min。③加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s，15-30℃放置 2.0-3.0 min，2-8 ℃，12 000×g离心15 min。④将上清液转移至一个新的Ep管中，加入500 μL异丙醇，15-30 ℃放置10 min，2-8 ℃，12 000×g离心10 min，在管底和侧壁可见胶样小团即为RNA沉淀。⑤沉淀加入无RNase水30-50 μL溶解，反复抽吸数次，置于55-60 ℃水浴，放置10 min，-20 ℃保存。⑥RNA液于65 ℃温育5 min后迅速冷却至室温，加入等体积2×柱层析缓冲液，上样，灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1×层析柱加样溶液。⑦加入1/10体积的3 mol/L NaAc(pH 5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20 ℃ 30 min， 4 ℃ 12 000×g离心15 min，弃上清，用体积分数70%乙醇洗涤沉淀，4 ℃、12 000×g离心5 min，弃上清，空气干燥10 min，少量无RNase水30-50 μL溶解RNA，-20 ℃保存。⑧使用TaKaRa One Step RNA PCR Kit建立RT-PCR反应体系，按设定参数进行RT-PCR反应，获取内皮抑素cDNA片段，PCR产物按照DNA片段纯化试剂盒进行纯化，后进行测序鉴定。

pcDNA3-Endo质粒的构建：分别建立PCR产物双酶切反应体系、质粒pcDNA3双酶切反应体系，37 ℃水浴2 h，再建立内皮抑素基因片段与pcDNA3载体连接反应体系，16 ℃水浴16 h后，将连接产物转化感受态E. coli DH5α菌株。

骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定：兔骨髓间充质干细胞分离、培养和鉴定参考文献[9]的方法进行。采用梯度离心法提取兔骨髓中的间充质干细胞，以免疫组织化学及流式细胞检测细胞CD44、CD29、CD34的变化。

RT-PCR及Western Blot检测内皮抑素表达：①利用含pcDNA3质粒DNA的细胞具有Amp抗性的特性，进行阳性克隆筛选，利用碱裂解法大量提取重组质粒。②使用脂质体Lipofectamine 2000介导pcDNA3-Endo转染骨髓间充质干细胞。③将质粒-脂质体-DMEM混合物吸出，在每个细胞孔内加入0.4 mL含体积分数20%血清的DMEM培养基，继续培养24 h后用新鲜含体积分数10%血清的DMEM培养基替换。④48 h后行RT-PCR检测内皮抑素 mRNA的表达，72 h后行Western Blot检测上清液中内皮抑素蛋白表达。

人脐静脉血管内皮细胞(ECV-304)增殖抑制实验：将细胞浓度1×10⁸ L^-¹、100 μL ECV-304细胞的96孔板，置于37 ℃体积分数5%CO₂培养箱内培养24-48 h，待70%-80%融合后弃去培养液，用不含抗生素的无血清RPMI-1640培养液洗2次，分别加入pcDNA3-Endo瞬时转染骨髓间充质干细胞后细胞培养上清液、空载pcDNA3对照液、脂质体对照液及空白对照液，各12孔，每孔加50 μL。4组分别于24，48，72，96 h后终止培养，每孔加入5 g/L MTT 10 μL，继续培养4 h后弃上清，加入100 μL10%二甲基亚砜，微量振荡器震荡10 min，在酶联免疫检测仪570 nm处测定各孔吸光值。

主要观察指标：①RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。②重组质粒pcDNA3-Endo的酶切鉴定结果。③转染pcDNA3-Endo质粒的细胞内皮抑素的表达结果。④内皮抑素基因对血管内皮细胞增殖的影响。

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讨论

内皮抑素的氨基酸序列分析发现内皮抑素为细胞外基质蛋白胶原XVIII α1链NC1结构域C末端的184个氨基酸片段，相对分子质量为20 000，其中酸性氨基酸16个，碱性氨基酸29个，疏水氨基酸占42%，共有4个半胱氨酸^[10-11]。Hohenester等^[12]研究重组小鼠内皮抑素晶体结构发现，其晶体结构是一个紧密折叠结构，主要由β-折叠和袢环组成，还含有两个α-螺旋；晶体结构表面有多个紧密环绕的袢环，包围着内部的疏水核心；分子内有两个二硫键^[13]。

重组小鼠内皮抑素的7条β-折叠结构极其复杂，体外重组的内皮抑素很难恢复其天然折叠结构，因此90%的重组内皮抑素以不溶形式存在。内皮抑素含有大量碱性残基，小鼠内皮抑素含有15个精氨酸，人内皮抑素含有14个精氨酸，因此内皮抑素对肝素具有高度亲和力。根据精氨酸在分子表面的分布，可推测结合肝素部位，重组小鼠内皮抑素的15个精氨酸中有11个处在分子一侧表面，形成一个面积很大的静电区，两个精氨酸对包围着一个较浅的凹陷部位，周围被几个极性残基包绕，这一部位可能是肝素结合位点，可能是内皮抑素发挥血管内皮细胞生长抑制作用的关键结构区域。

内皮抑素有一个锌离子结合位点^[14]，由氨基末端的组氨酸和天冬氨酸组成，靠近氨基末端，一分子内皮抑素的结合一分子锌。最初认为Zn对内皮抑素发挥抑制血管生成活性是必需的，去除Zn后，重组内皮抑素构象发生变化，暴露出蛋白酶切位点，N-末端会发生降解。EDTA等金属鳌合剂去除锌离子后，可使内皮抑素的N末端氨基酸对蛋白酶敏感，从而使内皮抑素降解失活。内皮抑素通过Hisl、His3、Hisll、Asp76与Zn结合。对该蛋白分别进行Hisl、His3双突变，Hisll、Asp76单突变后，其抗Lewis肺癌功能丧失。但是目前研究指出，锌离子结合位点只是内皮抑素的一个结构域而无功能，去除锌及肝磷脂结合点不会影响内皮抑素对内皮细胞移行的抑制作用^[15]。

随着抗血管生成治疗恶性肿瘤理论的提出，重组人血管内皮抑素(恩度)作为一种新型的抗肿瘤药物，已经有较多的基础及临床研究报道^[16-23]。内皮抑素的生物学功能主要有：

血管生长抑制作用：内皮抑素对内皮细胞增殖和迁移的抑制作用特别强烈，而对正常细胞、静止细胞、肿瘤细胞则无明显作用。经动物实验也证实，内皮抑素强烈抑制肿瘤血管生成，其疗效超过了其他肿瘤血管抑制剂^[24]。O'Reilly使用鸡胚尿囊膜血管生成试验证明内皮抑素抑制了血管的形成。Blezinger等^[25]证实直接肌肉注射内皮抑素表达质粒，对碱性成纤维细胞生长因子诱导的小鼠角膜血管生长有抑制作用。

抑制血管内皮细胞增殖以及诱导凋亡的作用：内皮抑素治疗肿瘤并不是使肿瘤细胞的增生速率改变，而是提高肿瘤血管内皮细胞的凋亡速率，从而抑制肿瘤血管生成^[26]。内皮抑素可以被内皮细胞内吞，使接头蛋白Shb磷酸化，随后可形成一种M_r125 000的具有酪氨酸激酶活性的复合物，引起内皮细胞G₁期阻滞和凋亡。内皮抑素和胶原XVIII的一些片段可竞争与纤维连接素有关的laminin-1、perlecan和fibulins，因此干扰了基底膜内皮细胞的相互作用，加速凋亡^[27]。内皮抑素特异性的抑制毛细血管内皮细胞的增殖并且呈剂量依赖性关系。在碱性成纤维细胞生长因子存在的条件下，内皮抑素的增殖抑制作用更加明显^[28-29]。

影响内皮细胞的迁移：在体外内皮细胞有向碱性成纤维细胞生长因子，血管内皮生长因子等迁移的能力。不同浓度内皮抑素下测定人脐静脉内皮细胞穿透重组基底膜Matrigel的能力，可以证明内皮抑素抑制这种迁移。并且这种抑制呈剂量依赖关系^[30-33]。

对肿瘤的抑制作用：O'Reilly等^[34]将Lewis肺癌移植入小鼠背部形成肿瘤模型。每天皮下注射内皮抑素，在 2.5 mg/kg剂量时肿瘤的生长被抑制53%，10 mg/kg时抑制达97%，当给药20 mg/kg时肿瘤生长几乎被完全抑制。皮下注射0.3 mg/(kg•d)时，Lewis肺癌的转移瘤可被完全抑制。对于其他恶性肿瘤如：B16F10黑素瘤、T241纤维肉瘤和EOMA血管内皮细胞瘤，内皮抑素也能抑制它们在小鼠体内的生长^[35-41]。

内皮抑素抗血管生成、抑制肿瘤发生的分子机制包括以下几点^[42-45]：①内皮抑素对细胞信号传导通路的影响。②调节细胞周期。③促使细胞凋亡。④内皮抑素对基质金属蛋白酶的影响^[46]。⑤内皮抑素抑制细胞与细胞骨架结合。⑥内皮抑素同整合素结合，阻断内皮细胞表面黏附因子作用，抑制内皮细胞与肿瘤细胞的发生、发展^[47-49]。

为了能有效的表达内皮抑素，本实验采用了pcDNA3真核表达质粒作为目的基因载体。pcDNA3质粒是Invitrogen公司的产品，其具有大肠杆菌Ori位点，使它能够在原核细胞中大量复制方便制备，并且它是一种高效真核表达质粒，含有T7多克隆酶切位点，如BamHI、XhoI、EcoRI、XbaI等，可以方便外源基因插入，在它上游序列中含有CMV启动子/增强子，下游有源于牛生长激素基因(BGH)的多聚腺苷酸尾信号和转录终止序列等调控元件。另外，它还含有SV40、fl、ColE1启动子及氨苄青霉素抗性和新霉素抗性基因序列，可以利用其抗生素的抗性基因对导入外源基因的阳性细胞克隆进行筛选。其中CMV启动子/增强子和多聚腺苷酸尾(polyA)信号、转录终止序列、SV40、fl启动子等调控元件能使外源基因在真核细胞进行高效表达。

本实验从大鼠肝脏中利用Trizol法提取并纯化出内皮抑素mRNA，通过RT-PCR合成内皮抑素cDNA，并进行了琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定，然后将从DH5α菌中提取的真核表达质粒pcDNA3及内皮抑素 cDNA双酶切并连接构建重组真核表达质粒pcDNA3-Endo，经含有Amp的培养基筛选后，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组真核表达质粒pcDNA3-Endo构建成功，接着利用脂质体Lipofectamine 2000介导pcDNA3-Endo转染间充质干细胞，瞬时转染间充质干细胞48 h后进行RT-PCR，检测到内皮抑素mRNA的表达，转染72 h后进行Western Blot，检测到上清液中内皮抑素蛋白的表达，通过体外ECV-304细胞增殖抑制实验证明了转染后骨髓间充质干细胞培养上清液可显著抑制血管内皮细胞的生长。

以上实验说明了构建的重组真核表达质粒pcDNA3-Endo能够通过脂质体稳定转染骨髓间充质干细胞并表达出具有活性的内皮抑素蛋白，为下一步利用pcDNA3-Endo-MSCs治疗大鼠胶质瘤打下了良好的基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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体外构建内皮抑素基因真核表达载体抑制血管生成

Construction of pcDNA3-Endo eukaryon expression plasmid and angiogenesis inhibition in vitro

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