瓦楞状组织工程骨支架对种子细胞接种和成骨的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.25.004

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (25): 3953-3960.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.25.004

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瓦楞状组织工程骨支架对种子细胞接种和成骨的影响

曾宪利¹，杨春露²，李江¹，徐湲¹，王硕¹，吴鹏³，王翠芳¹，丁艳丽¹，郑新丽¹

1沈阳医学院附属中心医院，辽宁省手外科组织工程实验室，辽宁省沈阳市 110024；2武警辽宁省总队医院骨科，辽宁省沈阳市 110034；3沈阳医学院科学实验中心，辽宁省沈阳市 110034

收稿日期:2014-05-16 出版日期:2014-06-18 发布日期:2014-06-18
通讯作者: 曾宪利，沈阳医学院附属中心医院，辽宁省手外科组织工程实验室，辽宁省沈阳市 110024
作者简介:曾宪利，男，1967年生，辽宁省本溪市人，汉族，2007年南方医科大学毕业，博士，主任医师，副教授，主要研究方向为组织工程骨的研究。
基金资助:
辽宁省手外科组织工程实验室建设项目(201104523)；辽宁省科技厅自然科技基金(201102217)；沈阳医学院优秀人才基金(20081024)

Effects of corrugated tissue engineered bone scaffold on cell seeding and osteogenesis

Zeng Xian-li¹, Yang Chun-lu², Li Jiang¹, Xu Yuan¹, Wang Shuo¹, Wu Peng³, Wang Cui-fang¹, Ding Yan-li¹, Zheng Xin-li¹

1Tissue Engineering Laboratory of Hand Surgery of Liaoning Province, Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, China; 2Department of Orthopedics, Armed Police Corps General Hospital in Liaoning Province, Shenyang 110034, Liaoning Province, China; 3Science Experiment Center of Shenyang Medical College, Shenyang 110034, Liaoning Province, China

Received:2014-05-16 Online:2014-06-18 Published:2014-06-18
Contact: Zeng Xian-li, Tissue Engineering Laboratory of Hand Surgery of Liaoning Province, Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, China
About author:Zeng Xian-li, M.D., Chief physician, Associate professor, Tissue Engineering Laboratory of Hand Surgery of Liaoning Province, Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, China
Supported by:
Tissue Engineering Laboratory Construction Projects for Hand Surgery of Liaoning Province, No. 201104523; Natural Science and Technology Fund of Liaoning Provincial Science and Technology Bureau, No. 201102217; Excellent Talents Fund of Shenyang Medical College, No. 20081024

摘要/Abstract

摘要：

背景：不同形状工程骨支架负载种子细胞修复骨缺损的研究效果评价不一，而负载细胞数量的多少是影响疗效的重要因素之一，目前该方面研究证据不多。
目的：自制瓦楞状组织工程骨支架和其他3种形状的支架，比较4种不同形状支架负载种子细胞的数量，以及瓦楞状组织工程骨支架体内成骨时凹槽的优势及特点。
方法：①体外实验：将体积和样本数相同的4组支架分为单纯瓦楞状支架组、无瓦楞支架组、圆柱状支架组和带中空管柱状支架组，分别以相同密度、相同容积的成骨诱导兔骨髓间充质干细胞悬液接种于支架表面，孵育、培养、消化、收集，进行细胞计数、吸光度值检测以及碱性磷酸酶和茜素红染色。②体内实验：将兔随机分为重组人骨形态发生蛋白2/瓦楞状自固化磷酸钙人工骨组，瓦楞状自固化磷酸钙人工骨组和松质骨组，将体积相同的3组支架植入兔L5-6两侧横突间，植入后4，8，12周行大体、组织学观察。
结果与结论：体外实验显示，瓦楞状工程骨支架上滴注的细胞液能充分停留在表面，由于表面瓦楞状凹槽和液体的表面张力以及支架本身的无孔隙性使得细胞液不向培养皿流失，每个样本平均消化下来的正常形态的细胞数量高于其他3组(P < 0.05)，吸光度值差异无显著性意义(P > 0.05)。体内实验显示，各时间点重组人骨形态发生蛋白2/瓦楞状自固化磷酸钙人工骨组的成骨量比瓦楞状自固化磷酸钙人工骨组明显多(P < 0.05)，与松质骨组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。结果证实，实验自制的瓦楞状工程骨支架的形状特点有利于种子细胞负载，从数量上保证了接种种子细胞的有效性，可促进支架大量成骨和段状骨缺损的愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 瓦楞状, 骨组织构建, 自固化磷酸钙人工骨, 重组人骨形态发生蛋白2, 凹槽, 组织工程骨支架, 骨髓间充质干细胞, 接种, 静态接种法, 成骨, 兔

Abstract:

BACKGROUND: The effects of engineered bone scaffold containing seeding cells with different shapes to repair bone defect are varied, while the loaded cell quantity is the important factor influencing the curative effect, but which is rarely reported.
OBJECTIVE: By preparing self-made corrugated tissue-engineered bone scaffold and other three forms of bone tissue engineering scaffolds, to study the quantity of loaded cells on different scaffolds and osteogenesis of corrugated tissue-engineered bone scaffold so as to discuss the advantages and features of self-made corrugated tissue-engineered bone scaffold.
METHODS: (1) Experiment in vitro: There were four kinds of scaffolds with the same volume and samples: calcium phosphate cement (CPC) corrugated surface scaffold group, smooth surface scaffold group, cylindrical scaffold group and porous cylindrical scaffold with hollow tubes group, in which the latter three groups are control ones. A certain volume with same density of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) suspension after osteogenesis induction was seeded onto the scaffolds. After incubation, culture, digestion and collection, cell quantity was counted, absorbance value was finally detected and cell activity was proofed by alkaline phosphatase and alizarin red staining. (2) Experiment in vivo: New Zealand rabbits were randomly and equally divided into recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2)/CPC/BMSCs corrugated scaffold group, pure CPC corrugated scaffold group and cancellous bone implant group. Three kinds of scaffold implants with the same volume were inserted into the area between rabbit’s L5, 6 transverse processes bilaterally. At 4, 8, 12 weeks postoperatively, gross and histological observation was performed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Experiment in vitro: The drip of cell suspension steadily stayed on the surface of corrugated scaffold because of corrugated shape groove and the surface tension of the liquid. The amount of cells per sample digested down from the CPC corrugated surface scaffold was significantly more than that from the other three groups (P < 0.05), while the absorbance values did not differ (P > 0.05). (2) Experiment in vivo: At each time point the osteogenesis quantity of rhBMP-2/CPC/BMSCs corrugated scaffold group was more than that of the pure CPC corrugated scaffold group (P < 0.05), while there was no difference from the cancellous bone implant group (P > 0.05). These findings indicate that the characteristics of the self-made corrugated engineered bone scaffold are beneficial to seed cell loading, which supports a large number of osteogenesis and provides feasibility to promote the healing of segmental bone defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: calcium phosphates, bone morphogenetic proteins, stents, mesenchymal stem cells

中图分类号:

R318

曾宪利，杨春露，李江，徐湲，王硕，吴鹏，王翠芳，丁艳丽，郑新丽. 瓦楞状组织工程骨支架对种子细胞接种和成骨的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(25): 3953-3960.

Zeng Xian-li1, Yang Chun-lu, Li Jiang, Xu Yuan, Wang Shuo, Wu Peng, Wang Cui-fang, Ding Yan-li, Zheng Xin-li. Effects of corrugated tissue engineered bone scaffold on cell seeding and osteogenesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(25): 3953-3960.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析纳入兔45只，瓦楞状自固化磷酸钙人工骨组和松质骨组分别有1只动物在植入后3 d死亡，均及时补充。实验动物均未发生感染，植入后切口愈合良好，所有动物均进入结果分析。

2.2 工程骨接种成骨诱导后的骨髓间充质干细胞情况细胞液接种于4组支架材料上时情况迥异。

单纯瓦楞状支架组(实验组)支架上滴注的细胞液能充分停留在表面，由于表面瓦楞状凹槽和液体的表面张力以及支架本身的无孔隙性使得细胞液不向培养皿流失。

无瓦楞支架组支架上滴注的细胞液由于液体表面张力和无孔隙使得细胞液也能做到不轻易流失，但随着时间的延长或些许晃动，细胞液也会很快分散流失。

圆柱状支架组支架由于是圆柱状，滴注细胞液后很快分散，流失至培养皿，只能转动支架、反复多次接种。带中空管柱状支架组支架为多孔隙柱状有侧槽支架，在接种外表面时，除了有无瓦楞支架组支架的接种情况外，细胞液通过孔隙缓慢流失至培养皿，但如果先将细胞液接种于侧槽中，其停留于支架上的时间明显延长，约5 min后缓慢经孔隙渗至培养皿，故实验中采取后者接种方法。经胰酶将工程骨上成骨诱导后的骨髓间充质干细胞消化后形态及密度观察：接种6 h后，将支架移入新的培养皿并加入适量培养基覆盖支架，孵育3 d，用2-4 mL胰酶滴注在支架表面，柱状支架要反复滴注，消化60 s后，迅速终止消化，用培养基反复吹打支架，收集6孔培养皿中所有细胞并观察。可以看到来自4种支架消化下来的细胞，多呈圆形，个别呈簇排列；少量细胞形态不规则，胞膜不完整，

肿大。细胞数量明显不同，无瓦楞支架组最多，无瓦楞支架组和带中空管柱状支架组次之，圆柱状支架组最少。

植入后4，8，12周3组植入物与L₅_-₆横突连接的紧密程度：植入后4周3组植入物与横突连接较松动，无明显差别。植入后8，12周，重组人骨形态发生蛋白2/瓦楞状自固化磷酸钙人工骨组(实验组)、松质骨组植入物与L₅_-₆横突相对缘有较稳固的连接，而瓦楞状自固化磷酸钙人工骨组具有一定的活动度。实验在取材过程中所看到的疏密程度也证实了这一点。

2.3 成骨诱导后的骨髓间充质干细胞检测结果通过对4种支架材料形态数据的检测，计算出每个样本的体积，由于单纯瓦楞状支架组支架表面的凹槽表浅，在计算体积时忽略不计。单纯瓦楞状支架组(实验组)、无瓦楞支架组、圆柱状支架组、带中空管柱状支架组每个样本体积分别(480±9)，(478±11)，(502±12)，(492±7) mm³，差异无显著性意义(P > 0.05)。

分别将4组支架所有样本用胰酶消化后，收集细胞，用2 mL培养基重悬，利用细胞计数板计算细胞数，同一实验人员，反复测3次。以计数形态正常细胞为准，得出总细胞数，计算出每个样本细胞数。在96孔板中每孔加入5 000个细胞，每孔100 µL培养基加20 µL Cell Titer 96^®AQueous One Solution Reagent，检测A_{490 nm}，见表1。实验组每个样本平均消化下来的正常形态的细胞数量高于其他3组 (P < 0.05)，吸光度值差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 消化下来的细胞碱性磷酸酶和茜素红染色检测结果图2显示，为从支架消化下来细胞的碱性磷酸酶、茜素红染色均呈阳性。

2.5 植入后脱钙和不脱钙组织学检测结果脱钙组织切片Masson染色观察和不脱钙聚甲基丙烯酸甲酯包埋磨片观察显示，植入后4周重组人骨形态发生蛋白2/瓦楞状自固化磷酸钙人工骨组(实验组)、松质骨组支架与横突连接处和支架表面可见少量软骨组织，范围较局限，瓦楞状自固化磷酸钙人工骨组未见到，支架材料没有明显降解；植入后8和12周重组人骨形态发生蛋白2/瓦楞状自固化磷酸钙人工骨组(实验组)、松质骨组支架表面有明显骨痂形成，有新生编织骨呈条状和网格状，可见骨小梁长入材料中，数量随时间呈递增趋势，材料部分降解，中央部有小的空隙形成，瓦楞状自固化磷酸钙人工骨组仅在支架与横突连接处有少量骨组织形成，其表面和材料中间没有空隙，降解不明显，没有编织骨和骨小梁形成，见图3，4。

在6个脱钙标本和在4个不脱钙标本中各取出3张切片和磨片就成骨情况进行图像分析，见表2。利用图像分析软件将整个视野划分为1 024个统计场面积单位(μm²)，每张磨片均匀标注9个观察点，然后计算出视野中成骨面积比(%)。各时间点实验组成骨百分比与瓦楞状自固化磷酸钙人工骨组明显高(P < 0.05)，与松质骨组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。植入后4周，实验组脱钙切片支架表面Ⅱ型胶原阳性显示成骨形成，见图5。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2011年6月至2014年6月在沈阳医学院以及沈阳市手外科研究所完成。

材料：

实验动物：选取新西兰白兔45只，雌雄不限，体质量3.0-3.5 kg，体表无病损，由沈阳医学院动物中心提供，动物许可证号：SCXK(辽)2009-0002。

瓦楞状组织工程骨支架的制备及对种子细胞接种和成骨的影响的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
瑞邦骨泰粉末(CPC粉末)、固化液和重组人骨形态发生蛋白2	上海瑞邦生物材料有限公司
DMEM培养基、双抗penicillin-streptomycin 、Trypsin-EDTA、PBS、胎牛血清	英濰捷基(上海)贸易有限公司
兔骨髓间充质干细胞分离液	天津灏洋TBD
CellTiter 96^® AQueous One Solution Reagent	普洛麦格(北京)生物技术有限公司
胰岛素、地塞米松、碱性磷酸酶、茜素红、氯胺酮、安定、聚甲基丙烯酸甲酯、四唑盐	沈阳市手外科组织工程实验室
倒置显微镜ECLIPSE TS 100LED-FMV	日本尼康仪器公司
酶标仪THEIMO	赛默飞世尔(上海)仪器有限公司
Leica Q-500 MC图像分析仪	德国徕卡仪器公司

方法：

重组人骨形态发生蛋白2/CPC瓦楞状工程骨、CPC瓦楞状工程骨和CPC无瓦楞状工程骨的制备：采用复相吸附法，按照1 g CPC吸附复合1 mg重组人骨形态发生蛋白2，固化后冻干制备重组人骨形态发生蛋白2/CPC，不吸附重组人骨形态发生蛋白2的CPC固化后制成单纯支架，支架大小为长10 mm、宽8 mm、厚1.5 mm。使用自制金属网将上述支架制成表面呈瓦楞状工程骨支架；不使用金属网的支架为无瓦楞支架。通过体积计算公式分别计算出上述两个支架叠放一起的体积和4个支架叠放在一起的体积。

圆柱状工程骨支架、带中空管多孔圆柱状工程骨支架的制备：CPC固化后装入圆柱状无菌模具中，放入CO₂孵箱、37 ℃下干燥，制成外径8 mm、长10 mm圆柱状支架。应用盐析法和特殊模具，煅烧CPC，制成外径8 mm、内径3 mm、长12 mm、开口2 mm的带中空管多孔圆柱状支架。通过体积计算公式计算出上述两种支架单个体积。

兔骨髓间充质干细胞的体外分离、培养：将骨髓穿持针接内容5 mL低糖培养基(DMEM，内含3 000 U/mL肝素)20 mL注射器，抽取髂骨骨髓4-6 mL，与兔淋巴细胞分离液按照1∶1比例进行梯度离心，1 000 r/min。离心 15 min，吸取中间的单核细胞层，PBS洗2次，以2×10⁹ L^-¹的细胞浓度接种入25 cm²培养瓶中，加入低糖培养液(内含青霉素100 U/mL、链霉素100 μg、体积分数为10%的胎牛血清)，置于37 ℃、体积分数5%的CO₂培养箱中，培养4 d首次换液，换液2次/周。培养2周后长满培养瓶底，用体积分数0.25%Trypsin-EDTA消化，以1∶3进行传代培养，传至第3代备用。

兔骨髓间充质干细胞成骨诱导：取生长良好的P2兔骨髓间充质干细胞加入诱导剂(高糖DMEM培养基、胰岛素1×10⁴ U/L、地塞米松100 nmol/L)，换液2次/周，诱导7 d备用。

体外实验：将体积和样本数相同的4组支架分为单纯瓦楞状支架组(实验组)、无瓦楞支架组、圆柱状支架组和带中空管柱状支架组，后3组为对照组。单纯瓦楞状支架组和无瓦楞支架组中组合4片支架为1个样本，圆柱状支架组和带中空管柱状支架组为1个支架构成1个样本，见图1。将4组支架按顺序放入6孔培养皿，做好标记，支架最大面朝上，带中空管柱状支架侧开口朝上，每组样本数各为12个。用PBS反复浸洗4组支架3次，在培养箱中干燥后，将收集到的成骨诱导后的骨髓间充质干细胞重悬，调至细胞浓度2×10⁹ L^-¹缓慢滴注于支架表面，每个最大面表面滴加2 mL细胞悬液，同时对比观察细胞液接种于四种支架材料后的状态；培养6 h后加入培养基覆盖支架继续孵育3 d，用体积分数0.25% Trypsin-EDTA消化、收集、观察和计数，利用计数板和倒置显微镜观察各组细胞形态及疏密程度，各组细胞数量通过计数板计数。以低于1×10⁵ L^-¹细胞浓度置入96孔板和培养皿中，继续孵育7 d，进行MTS法检测细胞毒性，测出490 nm吸光值(A_{490 nm})；取少量细胞接种于培养皿中培养24 h后进行碱性磷酸酶和茜素红染色，通过典型细胞数量和钙化结节形成情况观察细胞活性和成骨诱导情况。

体内实验：将45只新西兰兔随机平均分成3组，分别为重组人骨形态发生蛋白2/瓦楞状自固化磷酸钙人工骨组(实验组)，瓦楞状自固化磷酸钙人工骨组和松质骨组，后两组为对照组。

将体积相同的三组支架植入兔L₅_-₆两侧横突间，其中实验组植入接种骨髓间充质干细胞载重组人骨形态发生蛋白2自制瓦楞状工程骨2片(两片对应叠放)，瓦楞状自固化磷酸钙人工骨组植入接种骨髓间充质干细胞不载重组人骨形态发生蛋白2自制瓦楞状工程骨2片，并将2片对应叠放。3组支架接种骨髓间充质干细胞浓度为2×10⁹ L^-¹，2 mL细胞悬液，培养6 h后加入适量培养基覆盖支架，孵育48 h后植入动物体内。使用氯胺酮(40 mg/kg)、安定 (10 mg/kg)复合肌肉注射麻醉后，取L₄_-₇棘突轴后正中切口，棘上韧带旁0.5 cm处纵行切开腰背筋膜、竖脊肌，暴露L₅_-₆横突，切除L₅_-₆横突相对缘的骨膜，磨除其骨皮质并露出松质骨，分别将3组实验物植入L₅_-₆横突相对缘间，止血后逐层缝合。

植入后4，8，12周3组分别5只动物处死后取L₅_-₆横突间植入物及连接处新生骨标本。大体标本切去时，检查各组植入物与L₅_-₆横突连接的牢固性、活动度；各时间点每组3只6份标本体积分数10%硝酸脱钙，石蜡包埋、切片、Masson染色和Ⅱ型胶原染色，光学显微镜观察；另外，3组取2只4份标本脱水后用聚甲基丙烯酸甲酯包埋，硬组织磨片，50-100 μm厚，苏木精-伊红染色，光学显微镜观察。将石蜡切片和磨片植入物区做标记，每个样本随机选取9个观察区，利用Leica Q-500 MC软件图像分析软件分别检测出成骨面积及总面积(μm²)，随后计算出成骨比率(%)。

主要观察指标：自制工程骨支架数量和体积、接种后工程骨上存活的细胞数量、接种后的细胞活性和成骨诱导情况、体内异位成骨比率。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，采用SPSS 11.0统计学软件对测得的参数进行统计学分析，组间数据的差异比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

组织工程中种子细胞能否有效接种于支架材料上是组织工程化研究和拟在临床应用过程中至关重要的一步。既往研究多停留在以一定密度的种子细胞接种于支架材料上，但对于最终有效接种在材料上的细胞数量没有进行必要的探究，只能通过间接指标比如电镜扫描和成骨情况等来推断接种细胞的有效程度^[8-10]。针对支架材料接种的种子细胞的数量的研究不可或缺，它不仅能直接显示接种细胞的有效程度，也能通过其数量与支架材料面积、体积等指标的相关性证实接种有效的种子细胞浓度，从而为支架和细胞两者的复合提供理论支持。实验通过设计并自制形状不同的4组支架材料。从标准上，采用相同的材料，每组每个样本的体积相同，接种细胞的密度、容量相同，培养的条件相同，通过计量证实实验组的细胞数量明显大于其他3组。

针对目前临床上难治的管状骨长段骨缺损的组织工程化治疗，其拟采用的组织工程骨支架的形状和形态设计也是个不小的难题。根据目前的研究，无论采用何种方式的制作模式，其所选支架遵循三维、足够尺寸、有一定的生物力学强度的基本标准，在设计理念上要保证种子细胞的有效附着，多数研究没有直接检测接种的细胞数量，尤其是有活力细胞的多少^[11-18]。如果不能保证支架材料接种种子细胞的数量和质量，那么植入骨缺损处的“工程骨”无疑类似不含种子细胞的单纯人工骨，也就不能做出合理的评价。实验中实验组工程骨支架材料被设计成近 1.5 mm的薄片状，最大面的表面带有均匀一致的瓦楞状凹槽，纵横交错，凹槽相对密集，支架上滴注的细胞液能充分停留在表面，由于表面瓦楞状凹槽和液体的表面张力以及支架本身的无孔隙性使得细胞液不向培养皿流失；而其他3组支架上滴注的细胞液不能做到长时间停留，细胞液会轻易流失至瓶底，尤其是柱状支架和多孔支架更加明显。通过从支架上消化下来的细胞数量的检测结果也证实了这一点。

工程骨支架植入骨缺损处种子细胞的营养供应也是一个不可回避的问题。根据目前研究结果显示，通过对组织工程骨支架材料、形态、形状以及构建方式的多方尝试，无论采用哪一种策略，比较公认的是材料的合理降解，多孔(大小)的设计，足够大，便于种子细胞负载和营养的供给，但对于能否有效负载种子细胞以及数量的多少探讨较少^[19-25]。实验所设计实验组支架呈瓦楞状，两个最大面呈相同结构，当多片支架叠合在一起是，两片支架四周和相邻面间有数个较大的孔隙和凹槽相通，能起到营养通道作用，而且由于凹槽纵横交错，营养的分布比较均匀。由于周边空隙较大，相比那些多孔支架上的小孔隙比较不易堵塞。一旦支架表面的孔隙堵塞，那么多孔支架内部接种的种子细胞势必由于缺少营养而死亡。而实验设计的支架之间的较大空隙可以保证接种于表面的细胞的营养供给。实验中所设计的瓦楞状工程骨呈薄片状，可以根据缺损骨的形态进行适量的叠加，理论上可以保证力学上的有效强度，而且在量上也达到可控，对于材料的吸收也能起到多孔支架的效果。

人重组骨形态发生蛋白2能促进成骨诱导和再生^[26-29]。作者选用CPC为原材料，采用复相吸附法，按照1 g CPC吸附复合1 mg重组人骨形态发生蛋白2的比例调制，制作重组人骨形态发生蛋白2/CPC支架。由于原材料为粉剂，可塑性很强，制作成薄片状并不困难。随着材料在体内的吸收，重组人骨形态发生蛋白2促进成骨效果明显。

动物实验结果间接证实了接种细胞数量对成骨的影响。观察结果显示：植入后8和12周，重组人骨形态发生蛋白2/CPC瓦楞状支架组、松质骨组植入物与L₅_-₆横突相对缘有较稳固的连接，而单纯瓦楞状支架组具有一定的活动度，在取材过程中也证实了这一点。脱钙组织切片Masson染色观察和不脱钙聚甲基丙烯酸甲酯包埋磨片观察显示：植入后4周重组人骨形态发生蛋白2/CPC瓦楞状支架组、松质骨组植入物与横突连接处和支架表面可见少量软骨组织，而单纯瓦楞状支架组未见到；植入后8和12周重组人骨形态发生蛋白2/CPC瓦楞状支架组、松质骨组植入物表面有明显骨痂形成，数量呈递增趋势，单纯瓦楞状支架组仅在支架与横突连接处有少量骨组织形成。图像分析显示各时间点重组人骨形态发生蛋白2/CPC瓦楞状支架组成骨百分比与单纯瓦楞状支架组比较有显著性意义，与松质骨组之间比较差异无显著性意义。如果工程骨的植入效果能与自体移植的松质骨效果相当，那么其替代修复骨缺损的可能性会明显提高，同时也与临床治疗的期望是一致的。

工程骨支架接种的种子细胞数量的评估在实际应用中困难较大。因为不可能针对植入体内的每个样本进行检测，不能仅仅凭借单独的体外组织学或扫描电镜等指标来推断体内实验每个样本接种的细胞数量，也不能仅仅通过检测到的标记细胞来推断。虽然实验能很直观的观察到接种细胞的容量，在一定程度上能保证细胞的数量，但针对每个植入物的接种细胞的质量却也难以保证一致性。另外，实验只采用了单面接种的方式，并没有充分利用所设计的支架材料，所以进一步进行双面接种的研究也是有必要的^[30]。实验结果提示，支架表面瓦楞状结构有助于种子细胞的负载，对接种的细胞数量有一定的影响。材料中复合的重组人骨形态发生蛋白2有助于种子细胞成骨诱导及成骨。但就支架表面特殊结构的构建以及支架大小对生物力学的影响等因素还有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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瓦楞状组织工程骨支架对种子细胞接种和成骨的影响

Effects of corrugated tissue engineered bone scaffold on cell seeding and osteogenesis

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