周期性张应力对C2C12成肌细胞增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.023

摘要/Abstract

摘要：

背景：在力学刺激下，肌肉组织发生改建，其中的成肌过程是一个多阶段的发育过程，细胞外基质的许多信号参与了成肌过程，其中力学信号是肌肉形成和再生的重要外界因子。目前国内外有许多关于周期性张应力刺激成肌细胞凋亡和增殖的报道，但是力学刺激在成肌作用中的具体机制目前还明确。
目的：探讨周期性张应力对C2C12成肌细胞增殖的作用及影响机制。
方法：采用FX4000T应力加载系统对体外培养的C2C12成肌细胞施加10%的周期性张应力，分别作用6，12，24 h。
结果与结论：MTT结果显示，随着加力时间的延长C2C12成肌细胞的增殖情况及S期的细胞周期率逐渐增加，在应力作用12 h时增殖效果最明显(P < 0.05)，随后开始降低。Western blot检测显示，C2C12成肌细胞中核转录因子κB蛋白的表达随加力时间增加而不断减少，加力24 h时表达量又开始上升。结果提示，周期性张应力可以诱导C2C12成肌细胞增殖，能够改变其细胞周期，核转录因子κB可能也参与了此调节过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

关键词: 组织工程, 骨组织工程, 组织构建基础实验, 张应力, 周期性, C2C12成肌细胞, 增殖, 核转录因子κB, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Mechanical stimulation triggers a muscle tissue remodeling, during which, myoblast process is a multi-stage development process. Many signals in extracellular matrix are involved in myoblast process, and mechanical signals are considered as important external factors for muscle formation and regeneration. Numerous studies concerning cyclic tensile stress effects on myoblast proliferation and apoptosis have been reported, but the specific mechanism underlying the mechanical stimulation in muscle formation is still unclear.
OBJECTIVE: To study the effects of cyclic stretch on proliferation of C2C12 myoblasts and its mechanism.
METHODS: C2C12 myoblasts were cultured in vitro under 10% cyclic stretch for 6, 12 and 24 hours.
RESULTS AND CONCLUSION: The results of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay showed that with the time of cyclic stretch, the proliferation of C2C12 myoblasts and the rate of S-phase fraction were gradually increased and peaked at 12 hours (P < 0.05), and then decreased. Western blot assay showed that the expression of nuclear transcription factor κB protein was decreased with time, which was inversely correlated to the proliferation of C2C12 myoblasts, but increased at 24 hours under the cyclic stretch. These findings indicate that the cyclic stretch can induce C2C12 myoblasts proliferation and alter the cell cycle. Nuclear transcription factor κB may be involved in this process.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

Key words: myoblasts, periodicity, elasticity, cell count, cells

中图分类号:

R318

王洪玲，刘东旭，袁晓. 周期性张应力对C2C12成肌细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(20): 3242-3245.

Wang Hong-ling, Liu Dong-xu, Yuan Xiao. Effect of cyclic stretch on the proliferation of C2C12 myoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(20): 3242-3245.

图/表（结果） 1

2.1 张应力干预后C2C12成肌细胞的增殖情况 MTT结果显示：加力组与对照组总体上差异有显著性意义(P < 0.05)，表明细胞受力后功能状态发生改变，加力组细胞功能状态

显著升高。其中加力12 h组细胞的增殖情况与其他3组相比差异有显著性意义。加力组与对照组间吸光度值比值的变化显示，加力后6 h 细胞功能状态即发生改变，12 h 时升高最为明显(P < 0.05)，24 h 以后与对照组差异降低。见图1。

2.2 张应力干预后C2C12成肌细胞的细胞周期变化：采用FX4000T应力加载系统对体外培养的C2C12成肌细胞施加10%的周期性张应力，分别作用0，6，12，24 h，张应力干预后不同时间C2C12成肌细胞的S期细胞周期率变化如下：对照组为(48.34±0.68)%，加力6，12，24 h组为(53.98±2.31)%，(62.55±1.34)%和(51.77±2.27)%。随着加力时间的延长C2C12成肌细胞S期的细胞周期率逐渐增加(P < 0.01)，在应力作用12 h时效果最明显。见图1。

流式细胞仪检测显示，随着加力时间的延长C2C12成肌细胞的数量和S期的细胞周期率逐渐增加，在应力作用12 h时增殖效果最明显(P < 0.05)，随后开始降低。

2.3 张应力干预后C2C12成肌细胞核转录因子κB-P65蛋白的表达 Western blot检测显示，以在张应力刺激下基本保持恒定的β-actin 作为内参，不同时段的张应力的刺激下，核转录因子κB-P65蛋白的表达出现变化。对照组，加力6，12，24 h组的核转录因子κB-P65蛋白的相对吸光度值分别为0.309，0.290，0.141和0.408，可见随着加力时间的延长，其表达量出现降低，至加力12 h时降至最低点(P < 0.05)，随后又开始升高。见图1。

参考文献

[1] 赵美英,罗颂椒,陈扬熙.牙颌面畸形功能矫形[M].北京:人民卫生出版社,2000.
[2] Sanchez-Esteban J, Wang Y, Cicchiello LA, et al. Cyclic mechanicalstretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lungfibroblasts. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002;282(3):448-456.
[3] 邱小忠,李小娜,陈维毅,等.周期性机械拉伸对C2C12成肌细胞增殖的影响[J].中国临床解剖学杂志,2006,24(2):183-185.
[4] Kumar A, Murphy R, Robinson P, et al. Cyclic mechanical strain inhibits skeletal myogenesis through activation of focal adhesion kinase, Rac-1 GTPase, and NF-κB transcription factor. FASEB J. 2004;18(13):1524-1535 .
[5] 刘立斌,周红雨.成肌细胞的临床应用现状及前景[J].中国修复重建外科杂志,2007,21(7):767-770.
[6] Formigli L, Meacci E, Sassoli C, et al. Sphingosine 1-phosphate induces cytoskeletal reorganization in C2C12 myoblasts: physiological relevance for stress fibres in the modulation of ion current through stretch-activatedchannels. J Cell Sci. 2005;118(6):1161-1171.
[7] 宋锦璘,李志华,陈扬熙,等.周期性牵张应力下成肌细胞面积、周长的变化研究[J].口腔医学,2006,26(4):241-243.
[8] 曲明娟,刘波,姜宗来.不同频率张应变对大鼠血管平滑肌细胞外基质的影响[J].生物医学工程学杂志,2008,25(4):826-830.
[9] 宋锦璘,李志华,陈扬熙,等.周期性牵张应力下成肌细胞形态指数、长度变化的初步研究[J].北京口腔医学,2006,14(3):157-160.
[10] You L, Cowin SC, Schaffler MB, et al. A model for strain amplification in the actin cytoskeletion of osteocytes due to fluid drag on pericellular matrix. J Biomech. 2001;34(11): 1375-1386.
[11] Moller W, Nemoto I, Matsuzaki T, et al. Magnetic phagosome motion in J774A. Imacrophages: influence of cytoskeletal drugs. Biophys J. 2000;79(2):720-730.
[12] Basak S, Hoffmann A. Crosstalk via the NF-kappaB signaling system. Cytokine Growth Factor Rev. 2008;19(324):187-197.
[13] Wegener E , Krappmann D. Dynamic protein complexes regulate NF-kappaB signaling. Handb Exp Pharmacol. 2008; (186):237-259.
[14] Senftleben U, Karin M. The IKK/NF-kappaB pathway. Crit Care Med. 2002;30(1 Suppe):18-26.
[15] Karin M, Delhase M. The I kappa B kinase (IKK)and NF-kappa B: key elements of proinflammatory signaling. Semin Immunol. 2000;12(1):85-98.
[16] Kumar A, Takada Y, Boriek A, et al. Nuclear factor-kappaB: its role in health and disease. J Mol Med. 2004;82(7):434-448.

引言

材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：于2009年1至12月在山东大学口腔医学院完成。

材料：FX-4000T细胞加载装置(美国Flexercell公司)，该装置加载原理是用一个真空泵抽吸由特制弹性硅胶膜制成的培养皿底部，形成负压使培养皿底部产生拉伸变形，从而使附底生长的细胞受机械牵张。细胞所受力值大小以培养皿底部硅胶膜拉伸应变率(%)表示，拉伸率越大，表示细胞所受张力越大。

细胞：小鼠成肌细胞C2C12购自美国ATCC公司。

C2C12成肌细胞增殖检测相关试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
6孔BioFlex柔性细胞培养皿，四甲基偶氮唑蓝(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)	Sigma公司
核转录因子κB p65抗体，IgG-HRP抗体	signaling公司
β-Actin 抗体	Santa Cruz公司
ECL发光液	碧云天公司

实验方法：

C2C12细胞的体外传代培养：从液氮罐中取出C2C12细胞冻存管，立即放入37 ℃水浴中，快速摇晃，尽量使冻存液在1 min内完全融化。将细胞悬液移入离心管，加入适量培养液，4 ℃离心(1 000 r/min，10 min)，去上清，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养液调整细胞浓度，将细胞接种于培养瓶中。置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中，隔天换液。随后每隔二三天更换1次培养液。在细胞融合达到80%左右时传代。

成肌细胞体外培养-力学刺激模型的建立：调整细胞浓度，以1×10⁵/cm²接种至6孔BioFlex柔性细胞培养皿(Flexcell International Corp，PA，USA)内继续培养，培养24 h后第1次换液，每孔加入培养基2 mL。待细胞融合达到75%-80%时，更换无血清培养基继续培养24 h使细胞同步化，之后开始加力干预。

实验分对照组(未加力)，加力组6，12，24 h组。细胞所受力值大小以培养皿底部硅胶膜拉伸应变率(%)表示，拉伸率越大，表示细胞所受张力越大。分别对待测细胞加载 6，12，24 h的牵张力，加力组细胞的力值定为10%表面延伸^[3]，频率为6 cycles/min，每一循环包括3 s stretch/3 s relaxation。

MTT检测：每组细胞于加力结束前4 h加入MTT(5 g/L)，200 μL/孔，加力结束后，尽量吸干培养液，加入DMSO终止反应。将6孔细胞加力板放在摇床上摇晃15 min。然后将DMSO转移至96孔细胞培养板上，150 μL/孔。每组设置调零孔和对照孔。酶联免疫检测仪测定570 nm处的吸光度值(A)，参比波长620 nm。

流式细胞仪分析：加力结束后收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤。离心沉淀1 500 r/min，共5 min，再用PBS洗2次，去上清。用PBS调整细胞浓度为(0.5-1.0)×10⁶个的细胞悬液。使用BECKMAN COULTER公司生产的DNA-Prep试剂盒，加入DNA-Prep LPR 100 μL，涡旋混匀，再加入DNA-Prep Stain 1 mL，混匀后室温避光15 min，流式细胞仪检测细胞周期率的变化。

Western blot检测：收集各组的C2C12成肌细胞，用4 ℃预冷的PBS洗3遍，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液适量，至于冰上30 min。12 000 r/min，4 ℃离心5 min。取上清。用10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，上样蛋白15 μg/孔。根据预染得蛋白Maker确定目的蛋白和内参的位置。转膜后加入封闭液室温封闭2 h，孵育核转录因子κB抗体(1∶1 000)和β-actin抗体(1∶1 000)，4 ℃过夜，次日用TBST洗膜3次，5 min/次。之后加入二抗IgG-HRP抗体(1∶1 000)，于侧摇床上室温放置一两小时，用ECL显影，曝光。实验重复3次。使用Alpha Imager 2200软件对图像进行半定量分析，以目标蛋白条带与内参蛋白条带积分吸光度值之比作为最终结果。

主要观察指标：张应力干预后各组细胞增殖情况，细胞周期率及核转录因子κB蛋白的表达情况。

统计学分析：采用SPSS 10.0统计软件进行数据处理，计量资料以x(_)±s表示，多组间均数差异的比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

讨论

正畸治疗是医生使用各种矫治装置作用在牙、牙槽骨和颇骨上，通过施加机械力和肌能力的刺激使牙齿移动，牙槽骨和领骨发生形态改建的过程，是很多复杂的生物学反应的集合，不仅体现在牙、领骨等硬组织的变化，而且肌肉、关节等相应的软硬组织也发生适应性改建。肌肉作为口腔行使各种功能的动力机构，对错颌畸形的发生、发展以及正畸所能达到的最佳治疗效果和对治疗效果的保持都起着重要作用。

成肌细胞是小的单核梭形细胞，是源于胚胎中胚层的干细胞，在正常骨骼肌中，它位于基底膜与肌纤维浆膜之间，处于静止状态。当受到外界刺激，在应激状态下可以分裂、增生，形成新的肌纤维，是骨骼肌再生、损伤后修复与适应性改建的储备力量^[4-5]。力学应激是维持细胞生存和生长的重要细胞外刺激，它能够调节细胞的新陈代谢和基因表达过程，在骨骼肌的形成和发育过程中，力学刺激起着非常重要的作用。成肌细胞的激活、增殖与分化在骨骼肌的损伤修复中扮演重要角色^[6]。以往研究表明，细胞在受到机械力刺激后，其本身的形态、细胞骨架乃至细胞核骨架可在力的作用下发生变化^[7-9]。机械力作用于细胞和

周围的基质，借助于细胞膜上分子感受器的直接接触，通过细胞骨架传导将机械力传到细胞的各个部位，使相应的效应分子激活，合成、分泌等功能发生变化，对细胞的增殖、分裂、运动等产生影响^[10-11]。近年来流式细胞术以其快速、简便和准确的检测优势，广泛应用于基础及临床医学研究的各个领域，它是综合单克隆抗体技术、激光技术和电子计算机计数等，利用流式细胞仪为工具的高新技术。在本次试验中，流式细胞术检测C2C12成肌细胞细胞周期结果显示：施加不同持续时间的周期性张应力后，C2C12成肌细胞的细胞周期随着随着加力时间的延长而发生了变化。与未加力组相比，加力组处于S期的细胞比率明显升高。加力12 h时达到高峰，之后开始降低，但是仍高于未加力组。

核转录因子核转录因子κB广泛存在于人体的组织细胞中是一种调节免疫、炎症和生长反应等一系列基因的重要调控因子，在细胞生存和凋亡的调节中起着关键作用^[12-13]。在大多数情况下，核转录因子κB与其抑制子IκBα结合，以一种异源二聚体的形式存在于胞质内，因而没有活性。当外来刺激因素触发IκBα磷酸化后，异源二聚体降解，游离的核转录因子κB就会发生核转移并激活靶基因的转录。在多种细胞中，核转录因子κB的活性都决定着细胞生存或凋亡的命运。目前已有研究表明，它可以介导成肌细胞应激反应中多种基因的表达，包括介导成肌细胞的增殖和分化^[14-16]。这次试验中通过对C2C12成肌细胞施加不同持续时间的周期性张应力，检测不同时间段的核转录因子κB的表达发现，随着加力时间的延长，核转录因子κB的表达呈现先降低后升高的趋势。与未加力组相比，随着加力时间的延长，核转录因子κB的表达降低，加力12 h时达到最低峰，之后又开始呈现上升趋势。与C2C12细胞的增殖呈现负相关关系。这个结果与以往文献证实的核转录因子κB信号通路的激活具有抑制成肌细胞分化、促进细胞凋亡的作用的观点相一致。

本次试验从细胞分子水平研究了周期性张应力对C2C12成肌细胞增殖的作用和机制，并证实了周期性张应力不但能导致C2C12成肌细胞增殖，而且能通过激活核转录因子κB信号通路来调节细胞周期。从上述实验结果可以看出，无论使细胞周期还是核转录因子κB活性都会随着时间的延长在加力12 h这个时间点出现一个分界，随着加力时间的延长到24 h会有一个回落或者上升，这说明在加力12-24 h细胞的增殖和核转录因子κB的表达会出现一个阈值。但是由于实验条件的限制，暂时还未能找到这个阈值，因此在这一方面有待于进一步的研究。

实验构建C2C12成肌细胞体外培养-力学刺激模型，结合细胞力学实验方法和分子生物学测试技术，研究周期性张应力和成肌细胞增殖的关系及可能的调节机制，为探讨功能矫形治疗中成肌细胞的改建机制提供理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：