氢盐水可抑制脊髓缺血再灌注损伤兔模型运动神经元的凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.18.013

摘要/Abstract

摘要：

背景：脊髓缺血再灌注损伤是一种严重的继发性脊髓损伤，其损伤机制是多因素综合作用的结果，其治疗上也有多种措施，但治疗效果不甚理想。
目的：探讨氢盐水对脊髓缺血再灌注损伤兔模型运动神经元的保护作用及机制。
方法：采用ZIVIN法制备脊髓缺血再灌注损伤兔模型，并采用氢盐水治疗(设为氢盐水组)，同时设模型组和假手术组为对照。
结果与结论：氢盐水组兔后肢运动功能Tarlov评分于再灌注后6，12，24，72 h明显优于模型组(P < 0.01)。再灌注后72 h，与模型组相比，氢盐水组丙二醛浓度降低(P < 0.05)，过氧化氢酶活性升高(P < 0.05)。苏木精-伊红染色显示，假手术组脊髓前角运动神经元细胞结构完整，模型组脊髓前角大量运动神经元细胞坏死，胞浆内颗粒变性和空泡变性。氢盐水组脊髓前角运动神经元细胞结构基本完整，仅有少量运动神经元细胞空泡变性。原位末端标记染色显示，假手术组未见运动神经元细胞凋亡；模型组见大量凋亡的运动神经元及大量炎性细胞浸润；氢盐水组见脊髓前角少量凋亡的运动神经元及少量炎性细胞浸润。结果证实，氢盐水可抑制兔缺血再灌注损伤脊髓运动神经元的凋亡，其机制与其抗氧化作用有关。

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关键词: 实验动物, 组织构建, 组织构建基础实验, 氢盐水, 脊髓损伤, 缺血再灌注, 运动神经元, 凋亡, 抗氧化, 腹腔注射, 模型, 运动功能, 保护

Abstract:

BACKGROUND: Spinal cord ischemia-reperfusion injury is a serious secondary injury of the spinal cord. Multifactor could contribute to the mechanism of this injury, and many therapeutic measures emerge, but the therapeutic effect is not ideal.
OBJECTIVE: To investigate the protective effects and mechanism of hydrogen-rich saline on spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits.
METHODS: ZIVIN method was adopted to prepare the model of spinal cord ischemia-reperfusion injury. The rabbit models were randomly divided into model group, sham operation group, and hydrogen-rich saline group.
RESULTS AND CONCLUSION: Improved Tarlov scores for the evaluation of motor function were significantly increased in hydrogen-rich saline group compared with the model group at 6, 12, 24, 72 hours after reperfusion (P < 0.01). The contents of malondialdehyde were significantly lower (P < 0.05), while catalase activity was significantly higher (P < 0.05) in hydrogen-rich saline group than that in model group at 72 hours after reperfusion. Hematoxylin-eosin staining revealed that, spinal cord anterior-horn motor neurons maintained intact structure in sham operation group; more necrotic spinal cord anterior-horn motor neurons were found in model group, and granular-vacuolar degeneration occurred in the endochylema. In hydrogen-rich saline group, the structure of spinal cord anterior-horn motor neurons was basically intact, only a small amount of spinal cord anterior-horn motor neurons appeared vacuolar degeneration. TUNEL staining showed no apoptotic spinal cord anterior-horn motor neurons in sham operation group. Many inflammatory cells and apoptotic neurons were found in model group. There were few inflammatory cells and apoptotic neurons in hydrogen-rich saline group. Hydrogen-rich saline can prevent the apoptosis of spinal cord anterior-horn motor neurons in rabbits with spinal cord ischemia-reperfusion injury, and the underlying mechanism is associated with antioxidative effect.

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Key words: hydrogen, spinal cord injuries, reperfusion injury, apoptosis, oxidation-reduction

中图分类号:

R318

孙延卿，陈雄生，曹东，朱巍，贾连顺. 氢盐水可抑制脊髓缺血再灌注损伤兔模型运动神经元的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(18): 2861-2866.

Sun Yan-qing, Chen Xiong-sheng, Cao Dong, Zhu Wei, Jia Lian-shun. Hydrogen-rich saline can inhibit apoptosis of spinal cord motor neurons in rabbits with spinal cord ischemia-reperfusion injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(18): 2861-2866.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析纳入新西兰白兔30只，实验过程无脱失，均进入结果分析。

2.2 脊髓缺血再灌注损伤兔后肢运动功能变化假手术组兔后肢运动功能正常。缺血再灌注6 h后，模型组、氢盐水组兔后肢运动功能即出现不同程度的损害，再灌注12 h后模型组部分兔后肢运动功能评分再次下降，氢盐水组兔后肢运动功能未见继续恶化。再灌注24 h后模型组兔后肢运动评分全部低于1分，氢盐水组有1只兔后肢运动评分低于2分，其他动物运动功能评分均大于2分。再灌注72 h后模型组兔有5只完全瘫痪，5只仅有可察觉的关节活动，氢盐水组仅有1只无法站立，其他动物运动功能评分均大于3分。经统计分析，再灌注后6，12，24，72 h，氢盐水组后肢运动功能评分明显高于模型组(P < 0.01)。各组动物后肢运动功能评分结果见表1。

2.3 脊髓缺血再灌注损伤兔脊髓组织形态苏木精-伊红染色结果显示，再灌注72 h后光镜下观察假手术组兔脊髓组织灰白质界限清楚，神经细胞形态完整。模型组兔脊髓组织灰白质界限欠清楚，大量神经细胞坏死，胞浆内颗粒变性和空泡变性。氢盐水组神经细胞结构基本完整，核仁明显，见少量神经元细胞空泡变性，见图1。

原位末端标记染色结果显示，再灌注72 h后光镜下观察假手术组兔脊髓组织见未见神经细胞凋亡；模型组见脊髓组织破坏严重，大量凋亡的神经细胞，核固缩，核浓染，大量炎性细胞浸润；氢盐水组见脊髓组织少量凋亡细胞伴核固缩、浓染，见图2。

2.4 氢盐水对脊髓组织丙二醛浓度和过氧化氢酶活性的影响再灌注后72 h，与模型组相比，氢盐水组丙二醛降低(P < 0.05)，过氧化氢酶活性升高(P < 0.05)。氢盐水组和模型组丙二醛浓度和过氧化氢酶活性与假手术组相比均差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

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引言

脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII)常常继发于原发性脊髓损伤^[1]。Allen于1911年首先描述^[2]，脊髓损伤严重者可致四肢瘫痪，甚至死亡(其致瘫率3.8%-17.6%)^[3]。目前关于脊髓缺血再灌注损伤的机制尚不明确，已经成为国内外研究的热点问题之一。

引起脊髓缺血再灌注损伤的病理机制比较复杂，大多数研究认为它是多种因素、多种途径共同作用的结果。近年来主要从以下7个方面对脊髓缺血再灌注损伤的机制进行研究：①氧自由基介导的细胞凋亡。②细胞内外离子浓度的改变。③兴奋性氨基酸的毒性作用。④细胞凋亡及相关基因表达。⑤炎症反应。⑥血-脊髓屏障通透性改变。⑦金属蛋白酶类与脊髓损伤^[4]。上述机制中，大多数学者支持氧化应激学说。脊髓损伤会造成脊髓组织内氧化应激，产生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)和活性氮(reactive nitrogen species, RNS)，包括羟自由基(hydroxyl radical, -OH)、超氧阴离子(superoxide anion, O₂^-)、过氧化氢(hydrogen dioxide, H₂O₂)、一氧化氮(nitric oxide, NO)，过氧亚硝酸阴离子(peroxynitrite, ONOO^-)等，其中一氧化氮与超氧阴离子在一定条件下会反应，生成氧化作用更强的过氧亚硝酸阴离子。氧化应激过程中，自由基的过度生成会导致组织内氧化/还原平衡紊乱，过多的自由基将使细胞DNA解链和脂质过氧化等，从而引起蛋白的失活等。由于脊髓的脂质含量较多，因而更容易受到自由基的损伤，实验也进一步证实，脂质过氧化在脊髓损伤中扮演了重要的角色^[5]。

过多的自由基能够损伤血管内皮细胞，从而引起血管通透性改变和组织水肿，进一步加重了血管损伤，导致组织的缺血/缺氧^[6]；自由基还可以灭活相关通道蛋白，损伤细胞膜(含磷脂较多)，继而引起通透性改变，这些会导致细胞释放兴奋性神经递质(主要是谷氨酸)，引发脊髓组织内兴奋性/抑制性神经递质的紊乱。谷氨酸作用于离子型和代谢型受体，导致离子通道开放，引起细胞内外离子浓度失去了正常的梯度，引起细胞的功能紊乱，造成脊髓损伤^[7]；过多的自由基破坏相关酶活性及破坏线粒体的结构，导致神经和胶质细胞的凋亡和死亡，加重脊髓损伤^[8]；自由基也是炎症和免疫反应的重要参与者，自由基对细胞损伤使其释放大量细胞因子或趋化因子，从而引起中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞在损伤脊髓组织的聚集。另外，其释放的其他非细胞成分，如肿瘤坏死因子α、前列环素I2、白细胞介素1β、白细胞介素6等进一步加重了组织损伤^[9]。

组织损伤后产生的自由基中，超氧阴离子能够通过超氧化物歧化酶代谢，产生过氧化氢，其能通过过氧化物酶还原为水，而羟自由基及过氧亚硝酸阴离子在人体内则缺少相应的清除酶，并且两者是体内最强的氧化物质。因此，对于上述二者的清除在减少机体氧化应激时作用尤为重要。因而，可以针对上述自由基损伤的机制采取相应的抗氧化措施，抑制自由基的产生或清除自由基，促进血管的再生，抑制神经和胶质细胞的凋亡和死亡，改善神经血管之微环境，促进神经细胞功能的恢复和重建。

实验拟建立脊髓缺血再灌注损伤的动物模型，选用氢盐水对兔进行腹腔注射治疗，通过检测清除自由基、抑制神经细胞凋亡和减轻炎症反应等方面相关指标，探讨氢盐水对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用机制。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2010年1月至2011年7月在解放军第二军医大学潜水医学实验室完成。

材料：

动物：健康雄性新西兰白兔30只，兔龄6个月，体质量2.0-2.5 kg，由解放军第二军医大学实验动物中心提供，动物实验许可证号：SYXK(沪)2007-0003；生产许可证号SCXK(沪)2007-0003。

兔脊髓缺血再灌注损伤实验相关试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、RIPA裂解液(中)、脂质氧化(丙二醛)检测试剂盒、过氧化氢酶检测试剂盒	江苏碧云天生物技术研究所
盐酸氯胺酮注射液，利多卡因注射液，冰冻石蜡切片机(型号：Leica CM1900)、匀浆机(型号：Mini Bead Beater-16,607 EUR)、高速冷冻离心机(型号：Eppendorf 5804R)、显微镜(型号：Leica Microsystems, 020-519.010LB30T)、温箱(型号：Incucell 55)	第二军医大学

方法：

分组及干预：将30只兔随机分为3组，每组10只，假手术组：只开腹而不夹闭腹主动脉，无脊髓损伤；模型组：开腹并夹闭腹主动脉35 min，于再灌注前5 min腹腔注射生理盐水，建立脊髓缺血再灌注损伤兔模型；氢盐水组：开腹并夹闭腹主动脉35 min，于再灌注前5 min腹腔注射饱和氢盐水(5 mL/kg 8 h重复腹腔注射)^[10-11]。再灌注72 h后，处死动物，各组取4只用于病理学观察，其他6只行丙二醛及过氧化氢检测。

脊髓缺血再灌注损伤模型制作：将兔盐酸氯胺酮注射液(20 mL，0.2 g)肌注(50 mg/kg)麻醉，取仰卧位固定，胸腹部去毛，常规消毒，铺无菌单。采用改良的ZIVIN法^[12]，取腹部正中切口，无菌操作下依次切开皮肤和皮下组织，自腹膜后间隙钝性分离暴露腹主动脉，确定左肾动脉分支，于左肾动脉水平远端0.5 cm处及左右髂动脉分支上方，以动脉夹夹闭腹主动脉，完全阻断腰骶段脊髓供血。手术过程中仔细分离腹主动脉与腹腔静脉，防止出血。用温盐水纱布覆盖动物内脏和切口，避免损伤内脏，室温保持在 22 ℃左右，物理方法保持肛温在(37.5±0.5) ℃。用0号可吸收线缝合皮肤，建模后予庆大霉素(40 000 IU/kg)肌注，预防感染。人工辅助排尿、排便。兔脊髓缺血模型建模成功标准：夹闭段腹主动脉搏动消失，颜色暗淡。血流再通标志：松开动脉夹后腹主动脉恢复搏动，颜色鲜红明亮。

兔后肢运动功能评分：分别于建模后6，12，24，72 h用单盲法对兔后肢运动功能进行评分。评分参照Tarlov标准^[13]，即：0分，后肢完全瘫痪；1分，可觉察的后肢关节活动；2分，后肢可自由运动但无法站立；3分，可站立但无法行走；4分，后肢运动功能完全恢复，能正常跳动。

兔脊髓组织学观察：于再灌注72 h后，再次麻醉动物并处死, 取出L₄_-₆节段脊髓组织，每组随机抽取4只脊髓标本，用40 g/L甲醛中性溶液固定，行石蜡包埋后切片 (4 μmol/L)，行苏木精-伊红染色及原位末端标记染色，光镜下观察3组脊髓组织神经细胞形态学差异。每组剩余6只脊髓标本标记后迅速放入-80 ℃冰箱保存，用于丙二醛浓度及过氧化氢活性检测。

兔脊髓组织丙二醛浓度及过氧化氢活性测定：将冷冻后的各组脊髓组织标本取出后，解冻称重。解冻并称质量后的脊髓组织用RIPA裂解液裂解，依次放入匀浆机及离心机中匀浆、离心，取上清液对脊髓标本进行蛋白浓度测定。

丙二醛浓度测定：①用蒸馏水将适量标准品稀释至1，2，5，10，20，50 μmol/L，准备作标准曲线。②将0.1 mL裂解液加入到离心管中作为空白对照，加入0.1 mL上述不同浓度标准品用来制作标准曲线，加入0.1 mL样品用于测定；随后加入0.2 mL丙二醛检测工作液。③充分混匀后，沸水加热15 min。④冷却至室温，离心机(1 000 r/min)室温离心10 min。取200 μL上清液加入到96孔板中，随后用酶标仪在532 nm波长处测定其吸光度值。⑤根据丙二醛标准曲线计算各组脊髓组织中丙二醛浓度。

过氧化氢活性测定：①取10 μL样品至1.5 mL塑料离心管中，加入过氧化氢酶检测缓冲液至体积为40 μL混匀。再加入250 mmol/L过氧化氢溶液10 μL，用移液器迅速混匀。25 ℃反应5 min。②加入450 μL过氧化氢酶反应终止液，颠倒混匀以终止反应。③在15 min内在一洁净的塑料离心管内加入40 μL过氧化氢酶检测缓冲液，再加入10 μL已终止并混匀的上述反应体系，混匀。④从上一步骤的50 μL体系中取10 μL加入到96孔板中的1个孔内。加入200 μL显色工作液。⑤25 ℃温箱孵育15 min后测定吸光度值(A_{520 nm})，根据标准曲线计算各组脊髓组织中过氧化氢活性。

主要观察指标：兔后肢运动功能，脊髓组织形态、丙二醛浓度及过氧化氢活性变化。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，应用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理。兔后肢运动功能评分采用非参数秩和检验。各组丙二醛浓度及过氧化氢活性的组间两两比较采用单因素方差分析和LSD-t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

脊髓缺血再灌注损伤模型有多种，目前实验用脊髓缺血再灌注损伤模型主要根据夹闭的部位不同，分为直接阻断腹主动脉与选择性阻断脊髓供血动脉两种。由于选择性阻断脊髓段供血动脉手术操作复杂，且并发症较多，因此较少应用。直接阻断腹主动脉根据阻断的位置又分为肾动脉分支上端阻断腹主动脉或胸主动脉和肾动脉分支下端阻断腹主动脉，由于在肾动脉分支上端阻断腹主动脉同时也阻断了肾动脉血流，可能会引发肾缺血性坏死等一系列并发症，因此目前采用肾动脉分支下端阻断腹主动脉作为脊髓缺血再灌注损伤模型居多，其中较多采用ZIVIN法来制备脊髓缺血再灌注损伤模型。脊髓缺血再灌注损伤模型的实验动物以兔居多，因其脊髓供血血管呈节段性分布，腰骶部脊髓主要供血动脉起自远端腹主动脉，因此只要夹闭腹主动脉，彻底阻断腹主动脉远端的血流，就能够造成兔腰骶部脊髓供血中断而引起脊髓缺血性损伤。而且操作较为简便，后肢行为学变化较易观察。因此通过肾动脉分支下端阻断腹主动脉被广泛的应用于脊髓缺血再灌注引起的组织病理学及神经学变化的研究^[14-15]。

有研究显示，造成脊髓缺血再灌注损伤的时间范围从17-60 min不等，常温下脊髓耐受缺血时限为20 min以内^[16]，也有报道脊髓耐受缺血时限为25 min，缺血时间超过25 min即会引起再灌注损伤^[17]。实验通过预实验发现夹闭兔腹主动脉35 min再灌注后，会造成脊髓的永久性损害，且操作简单，重复性较好。早期研究发现，脊髓缺血再灌注损伤后14-48 h会造成兔神经功能持续恶化^[18]，因此实验将再灌注后72 h作为观察脊髓缺血再灌注后组织病理学及神经行为学变化的时限。

氢是自然界最小的分子，可以与羟基反应生成水。氢的还原性已得到科学论证，日本学者于2007年研究发现，动物呼吸2%的氢气可以有效清除自由基，能够明显改善脑的缺血再灌注损伤，氢气溶解在液体中能够选择性的中和羟自由基及亚硝酸阴离子^[19]。由于其具有电中性，容易渗透细胞膜；氧化后生成水，因而对人体无害；它在清除自由基的同时不会对人体造成氧化还原代谢紊乱，因而适用于临床大多数缺血/缺氧性疾病治疗。近期研究发现，氢气可以通过抑制氧化应激，来减轻缺血缺氧引起的短暂性脑损伤、肺损伤、肾损伤、肝脏损伤及心肌损伤等，这说明氢气对于缺血缺氧引起的组织器官损伤具有潜在的保护及治疗作用^[20-26]。也有研究发现饱和氢盐水能够有效降低脑缺血再灌注损伤、肠缺血再灌注损伤及由其引起的肺损伤等^[27-29]。同时氢气对于败血症引起的小鼠器官功能损伤具有一定的保护作用^[26]。呼吸体积分数2%的氢气还可以通过减少氧化产物及提高抗氧化酶的活性，对脑外伤及脊髓损伤产生一定的保护作用^[30-31]。

此外，脊髓缺血再灌注损伤中神经元细胞死亡的主要方式是细胞凋亡，而且在迟发性瘫痪中起到了重要的作用^[32-33]。细胞凋亡是程序性细胞死亡，主要包括细胞萎缩、核固缩和DNA断裂^[34]。原位末端标记染色对于识别DNA断裂具有高度特异性和敏感性^[35]。

氧自由基介导的脂质过氧化作用被认为是导致脊髓缺血再灌注损伤的机制之一，组织中丙二醛含量与自由基引起的损伤程度相关联^[36]。丙二醛的检测被广泛应用于氧化应激状态的评价^[37-38]，也是组织损伤的重要标志^[39]。过氧化氢酶广泛存在于各类生物体中，是一种抗氧化剂，主要催化过氧化氢分解为水和氧气。过氧化氢酶1811年被Louis Jacques Thénard首次发现，1900年，Oscar Loew将这种催化过氧化氢分解为水和氧气的酶命名为“catalase”，即过氧化氢酶^[40]。过氧化氢酶主要存在于细胞的过氧化物酶体系中，细胞线粒体和细胞质中也含有少量过氧化氢酶，它能分解细胞内产生的过氧化氢，避免过氧化氢通过反应生成自由羟基，同时也可以使血红蛋白及含巯基蛋白质不被氧化。因此过氧化氢酶是生物体内重要的抗氧化剂，通常被用来衡量氧自由基的损害程度^[41]。过氧化氢酶是脊髓缺血再灌注损伤后所诱导的一系列基因表达中主要的抗凋亡基因^[42]。

实验通过记录在不同时间点3组家兔后肢运动功能评分，并行相关数据统计分析发现氢盐水组家兔后肢运动功能评分明显高于模型组。通过对脊髓组织苏木精-伊红染色及原位末端标记染色发现，氢盐水组运动神经元细胞结构基本完整，优于模型组。通过检测各组动物脊髓组织中丙二醛浓度发现，氢盐水组脊髓组织中丙二醛浓度明显低于模型组，这说明氢盐水能够抑制脊髓缺血再灌注损伤时产生的脂质过氧化产物，从而减轻脊髓缺血再灌注导致的脊髓氧化损伤。通过检测各组动物脊髓组织中过氧化氢活性发现，氢盐水组脊髓组织中过氧化氢活性明显高于模型组，这说明氢盐水可以通过提高生物体内抗氧化物活性来减轻脊髓缺血再灌注损伤后氧自由基的损害。以上结论说明氢盐水能够明显减轻脊髓缺血再灌注引起的后肢运动功能损害，抑制脊髓缺血再灌注损伤时产生的脂质过氧化产物，并提高动物体内抗氧化酶的活性来发挥其保护作用，从而减轻脊髓缺血再灌注带来的损害。因而腹腔注射氢盐水对脊髓缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

缺血再灌注损伤及炎症反应所产生的细胞外毒素、自由基和炎症递质引发神经细胞坏死和凋亡是脊髓继发性损伤的病理基础。神经细胞凋亡常在神经细胞坏死后继续发生，并能持续数周，可见，神经细胞凋亡的预防对脊髓损伤后的神经细胞的保护和功能恢复起着至关重要的作用。