SD大鼠股骨骨折合并脊髓损伤模型的构建

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.18.006

中国组织工程研究

• 器官移植动物模型 organ transplantation and animal model • 上一篇下一篇

SD大鼠股骨骨折合并脊髓损伤模型的构建

王海龙，盛伟斌，徐韬，郭海龙

新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2014-02-05 出版日期:2014-04-30 发布日期:2014-04-30
通讯作者: 郭海龙，硕士生导师，副教授，新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:王海龙，男，1988年生，甘肃省静宁县人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事外科学、骨外科学、脊柱外科方面的研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2012211A078)

Preparation of a femoral fracture model combined with spinal cord injury in Sprague-Dawley rats

Wang Hai-long, Sheng Wei-bin, Xu Tao, Guo Hai-long

The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2014-02-05 Online:2014-04-30 Published:2014-04-30
Contact: Guo Hai-long, Master’s supervisor, Associate professor, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Wang Hai-long, Studying for master’s degree, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2012211A078

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨折合并脊髓损伤的动物模型创伤大，造模后存活率较低，而改良Allen法和股骨开放截骨法制作动物模型时操作简单，不需要特殊器械，建模时间及出血较少，适用于骨折合并脊髓损伤动物模型的制作。
目的：建立一种既能成功维持长时间存活，并符合临床特征，又简便易行的实验动物模型。
方法：将48只SD雄性大鼠随机数字表法均分为单纯股骨骨折组和股骨骨折合并脊髓损伤组，通过双侧小切口开放截骨造成股骨中端横行骨折并植入内固定建立股骨骨折模型，改良Allen法自制打击装置造成大鼠T10段脊髓急性挫伤性损伤，两种方法融合制造股骨骨折合并脊髓损伤模型，观察大鼠制模成功后不同时间点大体情况及4周后骨折断端愈合情况。
结果与结论：建模后骨折合并脊髓损伤动物模型均成活，双下肢感觉及运动功能丧失，但可利用双上肢缓慢匍匐向前移动，前3 d进食少，活动少，夜间采用尾端悬吊后，骨折患肢未出现缺血坏死，到达第4周时，单纯股骨骨折组死亡1只，股骨骨折合并脊髓损伤组共死亡4只，成活率为83.33%，髓腔内固定未见脱出，两组骨折断端均有连续骨痂生成，从体积上来看，股骨骨折合并脊髓损伤组骨痂组织明显大于单纯股骨骨折组。证实将改良Allen法与小切口股骨外侧开放截骨法结合后，简单易行，可以成功制作股骨骨折合并脊髓损伤动物模型并成活至第4周。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 股骨骨折合并脊髓损伤, 脊髓损伤, 股骨骨折, 动物模型, 内固定, SD大鼠, 存活率, 术后护理, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In the animal model of spinal cord injury associated with fractures, the trauma is severe and postoperative survival rate is low. The improved Allen method and open femoral osteotomy method for making animal model has many advantages, such as simple operation, no need of special equipment, quick establishment, shortened operation time and reduced intraoperative bleeding, so they are suitable for preparing a femoral fracture model combined with spinal cord injury.
OBJECTIVE: To design an animal model of femoral fracture combined with spinal cord injury, which can maintain long time survival, meet clinical features, and is simple and easy.
METHODS: Forty-eight male Sprague-Dawley rats were randomly divided into simple femoral fracture group and femoral fracture merging spinal cord injury group. Femoral fracture model was caused by opening osteotomy to cause transverse fracture and implantation of internal fixator in femur. According to the improved Allen method, a self-made blow device was applied to cause acute T10 segment contusion injury of spinal cord in rats. Thus the femoral fracture model merging spinal cord injury was successfully established. The rats in two groups were grossly observed at different time points after the modeling, and the fracture healing at 4 weeks was detected.
RESULTS AND CONCLUSION: All the animal models of femoral fracture with spinal cord injury survived, which exhibited the loss of sensory and motor function of the lower limbs, but could slowly creep forward by the upper limbs. In the first 3 days, the rats had poor appetite and few activity, with tail suspension at night there were no ischemia and necrosis of the limb fracture. At 4 weeks, one rat in simple femoral fracture group died, while four rats in femoral fracture merging spinal cord injury group died, with the survival rate of 83.33%, intramedullary fixation were not prolapsed. In the two groups, continuous bone callus formation was found in the fracture, and the bone callus volume in femoral fracture merging spinal cord injury group was significantly higher than those in simple femoral fracture group. The results demonstrated that combining the improved Allen method with small lateral incision open femoral osteotomy is a simple and feasible method for the establishment of femoral fracture model merging spinal cord injury, and the models survive for 4 weeks.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: femoral fractures, spinal cord injuries, models, animal, postoperative complications, osteotomy

中图分类号:

R318

王海龙，盛伟斌，徐韬，郭海龙. SD大鼠股骨骨折合并脊髓损伤模型的构建[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.18.006.

Wang Hai-long, Sheng Wei-bin, Xu Tao, Guo Hai-long. Preparation of a femoral fracture model combined with spinal cord injury in Sprague-Dawley rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.18.006.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量、成活率及死亡原因分析纳入48只SD大鼠，其中单纯股骨骨折组因麻醉死亡1只，股骨骨折合并脊髓损伤组因排尿困难死亡2只(1只行膀胱穿刺后1 d死亡)，1只因感染死亡(因同笼老鼠啃食骨折患肢，导致皮肤和肌肉大面积缺损，给予每天碘伏消毒和青霉素皮下注射治疗后死亡)，无明显原因死亡1只。

单纯股骨骨折组、股骨骨折合并脊髓损伤组成活率分别为95.83%、83.33%，死亡原因多与脊髓损伤并发症有关，但也有其特殊性，术后尾端悬吊可以避免骨折患肢因长时间被SD大鼠身体压迫而缺血坏死，骨折造模选取股骨外侧截骨可减少术中出血及手术时间。

股骨骨折合并脊髓损伤组大鼠的死亡时间多在手术后4-6 d和16-18 d，从南国新等^[25]的研究中提示，动物死亡的主要原因可能不是麻醉意外、术后护理不当、肺部感染

和泌尿系感染，而是脊髓损伤后早期的肺水肿和肺出血导致的呼吸功能衰竭，对于有脊髓损伤的模型动物来说，降低呼吸衰竭发生的概率，可能可以进一步增加动物模型的成活率。

2.2 建模后SD大鼠一般情况 SD大鼠在术后1 h完全清醒后，单纯股骨骨折组SD大鼠骨折后肢屈曲，可自由在笼中走动，股骨骨折合并脊髓损伤组SD大鼠使用双前肢可匍匐向前移动，双后肢肌力和感觉消失，出现典型的下肢截瘫症状。

单纯股骨骨折组造模前及造模后一般情况未见明显变化，股骨骨折合并脊髓损伤组SD大鼠造模后1周内活动较少、饮食少，常伴有腹部胀气、大便困难伴硬结或黏液状、尿潴留、肌张力低、双后肢肌力为0级。

造模后2周时，股骨骨折合并脊髓损伤组有个别SD大鼠可恢复排便、排尿或尿便失禁。单纯股骨骨折组SD大鼠造模后第7天后患肢可持续着地支撑，股骨骨折合并脊髓损伤组SD大鼠2周时大部分可自行不完全排尿，此时人工排尿次数可改为1次/d。

有少部分SD大鼠因下肢瘫痪，尿道外口与敷料摩擦出现感染，甚至堵塞现象，应遵从正确方法缓慢排尿，避免过度挤压膀胱。

股骨骨折合并脊髓损伤组SD大鼠在建模后2周以后，大部分双下肢肌力可恢复至1级。单纯股骨骨折组SD大鼠手术切口均愈合良好，无感染，缝线在2周内自动脱落；股骨骨折合并脊髓损伤组个别SD大鼠人工骨折患肢出现肿胀，经人工按摩数天后可自行缓解。2周后，股骨骨折合并脊髓损伤组SD大鼠与单纯股骨骨折组比较可见后肢肌肉均出现较明显的萎缩(图3)，组内之间双后肢肌肉萎缩程度未见明显区别。

2.3 SD大鼠伴脊髓损伤时骨折断端外观第4周时，对比单纯股骨骨折组和股骨骨折合并脊髓损伤组骨折断端，均有连续骨痂生成，从体积上来看，股骨骨折合并脊髓损伤组骨痂组织明显大于单纯股骨骨折组(图4)。

参考文献

引言

临床观察中发现，骨折合并脊髓损伤时，骨折的愈合速度较不伴脊髓损伤时加快^[1-5]，其机制可能是脊髓损伤后，使成骨细胞和破骨细胞之间的活性不平衡，骨形成和骨吸收发生紊乱，影响新生骨痂的生成^[6]。虽然骨折合并脊髓损伤的发病率较低，但严重影响患者的运动及生活质量，给社会、家庭及个人带来严重的经济及心理负担。国内外对其骨折愈合加速机制的研究是近些年的热点，能建立理想的骨折合并脊髓损伤动物模型是非常必要的。由于SD大鼠种系纯和性好，应用广泛，与大动物相比，易于统一和行大数量实验，成本较低，手术前后饲养及护理方便等优点^[7-10]，非常适合用来测试新的治疗方法和研究骨折的愈合过程^[11]。

然而骨折合并脊髓损伤动物模型的主要缺点是造模时间长，术中出血多，建模后并发症多，动物存活率较低。以往的实验主要是简单的将脊髓损伤模型及骨折模型两种方法相结合，由于脊髓损伤和骨折模型的制作方法比较多，选择适合骨折合并脊髓损伤模型的方法并加以改进是非常必要的。

SD大鼠脊髓损伤模型建立的方法已经成熟，改良Allen重物坠落法是使用最为广泛的脊髓损伤造模方法^[12-14]，简单并易于操作。骨折模型目前有开放截骨和闭合造模两种方法^[15-17]，由于骨折合并脊髓损伤的SD大鼠双下肢截瘫，不需要考虑骨折断端抗旋转和非常稳定的固定，考虑到骨折合并脊髓损伤模型的自身缺点，故实验选取易于操作并能和脊髓损伤模型制造相结合的开放性截骨，并将其改进制造骨折模型，将改良的Allen重物坠落法和股骨开放截骨法结合同时制作骨折合并脊髓损伤的模型，减少手术中麻醉意外^[18-20]、造模时间、术中出血。

骨折合并脊髓损伤动物模型建立后的护理很关键^[21]，由于脊髓损伤的原因，SD大鼠术后膀胱尿潴留是最常见也是最容易导致死亡的并发症^[22-24]，每天按时及使用正确的方法进行膀胱挤压排尿是非常重要的。由于SD大鼠脊髓损伤建模后双下肢截瘫，活动较少，并在Tl箱内匍匐活动，在建模后3 d应采用夜间尾端悬吊法减少骨折肢体感染及缺血坏死。

作者旨在通过将骨折模型和脊髓损伤模型两种方法合理的结合，并将其改进，通过特殊的术后护理，建立一种既能成功维持模型长时间存活，并符合临床特征，又简便易行的实验动物模型。为今后对此类损伤进行更加深入的研究奠定一定的基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
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材料方法

设计：动物实验观察。

时间及地点：实验于2013年3至10月在新疆医科大学第一附属医院动物实验室完成。

材料：

实验动物：相同条件下喂养的健康SD雄性大鼠48只， 1月龄，体质量(280±20) g，由新疆医科大学实验动物中心提供，许可编号：SOXK(新)2013-0007。

将48只大鼠摸球法随机均分为单纯股骨骨折组(n=24)和股骨骨折合并脊髓损伤组(n=24)。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

试剂：硫酸阿托品注射液、地西泮注射液、盐酸氯胺酮注射液、青霉素、医用乙醇、生理盐水、喜德宝牌碘伏消毒液，均由新疆医科大学第一附属医院动物实验室提供。

器械及仪器：电动理发器、咬骨钳、手术刀、咬骨钳、蚊式钳、有齿镊、克氏针、电钻(描述)、钻头、手术剪、自制Allen打击器，均来自新疆医科大学第一附属医院动物实验室。

方法：

建模方法：改良Allen法(30 g重物3 cm高度打击)建造SD大鼠脊髓损伤模型(图1A)。股骨骨折采用开放截骨造成股骨中端横行骨折(图1B)。

动物模型制备：SD大鼠腹腔注射以氯胺酮为主的混合注射液(硫酸阿托品注射液∶地西泮注射液∶盐酸氯胺酮注射液∶生理盐水=1∶2∶2∶5，7.5 mL/kg)。建模前所有动物使用电动理发剪推掉背部T₁₀周围或左后肢外侧和前侧毛发，为手术做准备。

手术时用碘伏消毒手术区域，先俯卧位，铺无菌单，纵行切开大鼠背部皮肤及皮下组织，剥离棘突旁肌肉，切除T₁₀棘突，用咬骨钳咬去椎板，暴露脊髓硬膜。采用改良Allen 重物坠落法，用30 g重物由3 m高度坠落打击开放的SD大鼠脊髓，逐层缝合SD大鼠肌层、皮下组织、皮肤，用碘伏消毒。再仰卧位，碘伏消毒，铺无菌单，纵行切开髌上韧带表面皮肤1.0 cm，剥离皮下组织至髌上韧带，使膝关节屈曲，用2.0钻头拨开髌上韧带至股骨髌z面，用电钻破开股骨髌面骨皮质，确定进入髓腔后，换细克氏针对股骨髓腔进行扩髓，然后纵行切开大鼠大腿外侧皮肤及皮下组织1.0 cm，钝性剥离股骨外侧肌肉，暴露股骨中段，拔出克氏针，用剪刀将大鼠股骨中段离断，将12号针头插入髓腔，确定针头完全在髓腔内并固定牢固后，将多余的12号针头尾截断，逐层缝合肌层、皮下组织、皮肤，给予大鼠皮下注射8×10⁴ U青霉素预防感染。

将上述方法拆开进行制造股骨骨折组，以上手术操作均由一人完成，减少操作造成的误差。

饲养方法：

常规饲养方法：建模后每只动物肌肉注射青霉素 8×10⁴ U/d，连续1周。每El定量供应充足饲料和水，在安静、通风、清洁环境下分笼(485 mm×350 mm×200 mm Tl箱内养)饲养，任意进食新疆第一附属医院动物室自产大鼠全价颗粒饲料和自来水。

动物的饲养环境温度控制在22-25 ℃，相对湿度控制在40%-70%。箱内温度维持在23-26 ℃。箱底垫料保持干燥。

特殊饲养方法：股骨骨折合并脊髓损伤组除以上常规饲养外并予以下饲养：①特殊喂养：建模后3 d内给予皮下注射3 mL葡萄糖注射液。②辅助排尿：建模后大鼠每天辅助排尿3次(6-8 h/次)，部分膀胱阻塞可增加至5次。采用按摩、适当缓慢挤压排空膀胱，尿道阻塞者尽量避免膀胱穿刺，可采用多次、缓慢、反复挤压膀胱排尿。③药物处理：抗生素1次/d(有手术切口感染、呼吸道感染、尿路感染者可2次/d)。股骨骨折合并脊髓损伤组除行以上常规饲养及人工按压排尿外，建模后3 d内夜间可采取尾端悬吊法减少骨折端的缺血坏死，夜间悬吊8 h，白天可不用悬吊，见图2。
主要观察指标：

大体观察：建模后伤口愈合情况、有无针道感染现象，双下肢活动功能。4周时处死动物，观察骨缺损处的表面变化、两截骨端变化及骨折修复情况。

骨折断端大体观察：建模后4周取材，取材包括左侧股骨整段，完全剥离皮肤及肌肉组织，暴露骨折断端。

死亡情况：模型制备建模后开始记录大鼠死亡情况及死亡原因，至建模后4周为止。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

研究脊髓损伤对骨折愈合过程的影响，需要模型动物能成功维持长时间存活，并能够符合临床特征，造模方法又简便易行。因SD大鼠较其他鼠种抗病性好而能较好地耐受手术创伤^[26-28]，操作简便，成功率高，容易饲养，成本合理等原因，比较适合股骨骨折合并脊髓损伤的实验动物^[29-31]。

目前国内外在选用骨折合并脊髓损伤的模型时，主要是将脊髓损伤模型和骨折模型结合，由于脊髓损伤和骨折模型的制作方法较多，因此要求实验选择其中合适的造模方法并将其结合和改进。骨折合并脊髓损伤模型有其特殊性，就单纯骨折模型来说，闭合性骨折模型或使用外固定架较开放截骨骨折模型有一定优势^[32-33]，但骨折合并脊髓损伤时大鼠下肢截瘫，若使用闭合性骨折模型，首先需要特殊装置，增加造模时间，同时会增加因外固定架压迫患肢缺血坏死甚至感染的可能。而脊髓损伤模型国内外多采用Allen法造模，为减少手术时间及出血量，将其改良进行造模^[34-37]。

因骨折合并脊髓损伤的动物模型创伤程度较大，术中出血量较多，手术时间很长，为制造简便易行的骨折合并脊髓损伤模型，提高实验的可重复性和一致性，实验参考Allen法并改良后选择T₁₀胸椎对应区进行脊髓损伤造模，使用蚊式止血钳经椎板间隙精细操作将椎板揭开，避免损伤椎板下脊髓，此方法操作简单，出血少，可以保持硬脊膜的完整性，防止脑脊液外流，同时防止结缔组织、组织间液、细菌或其他有害物质的侵入^[38-39]。

由于脊髓损伤的影响，SD大鼠下肢截瘫，股骨骨折的造模如果选择内侧切口，会因长期瘫痪压迫增加感染及缺血坏死，故选取股骨外侧切口进行截骨，选取髌上韧带处插入髓内针，两处均行微创的方法，可减少术中出血及造模时间，将两种方法结合后制作骨折合并脊髓损伤的模型，既可以单人简便、重复的完成骨折合并脊髓损伤模型，又可以明显减少术中出血及手术时间，从而增加术后成活率并减少术后感染的发生^[40-41]。

单纯脊髓损伤的实验动物在1周内的死亡率为60%-70%^[42]，因骨折合并脊髓损伤的特殊性，术后实验动物进食和移动较少，为避免骨折患肢缺血坏死及感染，实验在建模后3 d内采用尾部悬吊法^[43]，从实验中对大鼠死亡及死亡原因的观察可以发现死亡原因主要是脊髓损伤所导致的尿路感染及尿路感染引发的排尿不畅和膀胱破裂。因此，在脊髓损伤中模型中，减少和避免尿路感染是提高脊髓损伤模型构建成功率的主要措施，同样也是骨折合并脊髓损伤模型面临的主要问题^[44]。其次，因骨折合并脊髓损伤模型的实验动物后肢无感觉功能，同类之间的对骨折患肢切口的撕咬也比较多，可通过减少笼中大鼠数量或将被撕咬大鼠单笼饲养进行预防。在保证这些护理到位的情况下，若再采取一些减少呼吸衰竭的措施，可能可以进一步减少模型的死亡率^[45-46]。

从外观上来看，实验骨折合并脊髓损伤组骨折断端处骨痂体积明显大于单纯骨折组，从而能证实骨折合并脊髓损伤模型的成功，并能很好的符合临床上的临床症状。

结果证实，骨折合并脊髓损伤模型中可以使用改良后的Allen法制造脊髓损伤部分和使用双侧小切口截骨制造股骨骨折部分，将这两种方法结合可以成功制造骨折合并脊髓损伤模型，并通过特殊的建模后护理饲养及尾端悬吊法，能够维持长时间存活，既符合临床特征，又简便易行。

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