骨形态发生蛋白2诱导成骨分化与长链非编码RNA AK007000的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：长链非编码RNA调控一系列生理过程，被认为在发育、分化和代谢的基因调控中发挥重要的作用。MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2细胞可向骨细胞、肌细胞等多个方向分化，用于肌肉骨骼等运动系统相关疾病的研究。
目的：观察长链非编码RNA在骨形态发生蛋白2诱导成骨分化中的作用。
方法：对MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2细胞在骨形态发生蛋白2诱导下，成骨分化过程中的长链非编码RNA表达变化进行芯片分析，找到在3株细胞中同时变化的长链非编码RNA，siRNA干扰方法观察长链非编码RNA对骨形态发生蛋白2诱导成骨分化的影响，采用Real-Time PCR与碱性磷酸酶染色检测成骨相关指标。
结果与结论：骨形态发生蛋白2诱导MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2成骨分化过程中，相应成骨指标增高，成肌指标肌细胞生成素降低。筛选出骨形态发生蛋白2诱导成骨分化过程中出发挥作用的长链非编码RNA AK007000。AK007000被干扰后成骨分化指标碱性磷酸酶、骨钙素、RUNX2、SP7表达下降，肌细胞生成素表达上升。因此，AK007000可能具有促进成骨抑制成肌作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, MC3T3-E1, C2C12, C3H10T1/2, 骨形态发生蛋白2, 长链非编码RNA, 成骨分化, 成肌分化, 基因芯片分析, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Long non-coding RNA (lncRNA) regulates a series of physiological processes and it is considered to play important roles in the gene regulation of development, differentiation and metabolism. MC3T3-E1, C2C12 and C3H10T1/2 cells are able to differentiate into different cell lineages, such as bone cells and muscle cells, and they can be used in the study of musculoskeletal diseases.
OBJECTIVE: To study the role of lncRNA in osteogenic differentiation induced by bone morphogenetic protein 2.
METHODS: Osteogenic differentiation of MC3T3-E1, C2C12 and C3H10T1/2 cells was induced by bone morphogenetic protein 2, and microarray expression profiling of lncRNA was undertaken in osteogenic differentiation. LncRNA simultaneous changes in three cells were found out. The siRNA interference of the lncRNA was used to study its effects on the osteogenic differentiation induced by bone morphogenetic protein 2. Real-time PCR and alkaline phosphatase staining were applied to detect osteogenesis related indicators.
RESULTS AND CONCLUSION: In the process of osteogenic differentiation induced by bone morphogenetic protein 2, osteogenic differentiation indicators were increased, while myogenic differentiation indicator myogenin was reduced. LncRNA AK007000 was screened out to play a role in osteogenic differentiation induced by bone morphogenetic protein 2. Knockdown of lncRNA AK007000 decreased the expression of osteogenic differentiation indicators, while increased the expression of myogenin. Therefore, AK007000 may play a role in promoting osteogenic differentiation and inhibiting myogenic differentiation.

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Key words: bone morphogenetic proteins, alkaline phosphatase, osteocalcin, RNA interference

中图分类号:

R318

高艳，程晨，李静，张越，肖伟凡，潘秋辉. 骨形态发生蛋白2诱导成骨分化与长链非编码RNA AK007000的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(15): 2297-2302.

Gao Yan, Cheng Chen, Li Jing, Zhang Yue, Xiao Wei-fan, Pan Qiu-hui. Osteogenic differentiation induced by bone morphogenetic protein 2 and long non-coding RNA AK007000[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(15): 2297-2302.

图/表（结果） 3

2.1 骨形态发生蛋白2 诱导C2C12、C3H10T1/2与MC3T3-E1成骨分化 以C2C12、C3H10T1/2与MC3T3-E1细胞为实验对象，骨形态发生蛋白2 (100 μg/L)诱导7 d，成骨分化经典指标碱性磷酸酶染色观察成骨分化水平。结果表明，与未诱导对照组相比，骨形态发生蛋白2诱导时碱性磷酸酶表达水平显著增高(图1A)。为观察其他骨分化相关指标，C2C12、C3H10T1/2与MC3T3-E1在骨形态发生蛋白2(100 μg/L)中诱导3 d，进行RT-PCR 反应。与未诱导对照组比较，C2C12骨分化指标碱性磷酸酶、骨钙素、RUNX2、SP7增高，成肌指标肌细胞生成素降低(图1B)；C3H10T1/2骨分化指标骨钙素增高，成肌指标肌细胞生成素降低(图1C)；MC3T3-E1骨分化指标碱性磷酸酶、RUNX2、SP7增高，成肌指标肌细胞生成素降低(图1D)；(P < 0.05)。不同发育阶段原始成骨细胞在成骨发育过程中各指标变化并不完全相同，但都有共同的趋势，成骨指标增高，成肌指标下降。

2.2 lncRNA AK007000在骨形态发生蛋白2诱导 C2C12 、C3H10T1/2与MC3T3-E1成骨分化中的变化探讨长链非编码RNA在C2C12、C3H10T1/2与MC3T3-E1成骨细胞分化过程中的表达谱，骨形态发生蛋白2处理和未处理的细胞培养3 d，提取RNA。总RNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值接近2.0，A₂₆₀/ A₂₃₀比值> 2.0所有样品。通过凝胶电泳对总RNA的质量检查(图2A)，确认的RNA质量好。未诱导MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2细胞与骨形态发生蛋白2(100 μg/L)诱导细胞芯片杂交，Fisher精确测试是用来寻找比预期更多的DE列表和GO注释列表之间的重叠。P值表示DE基因的GO注释富集。p值越低，GO注释越显著(P < 0.05)。分层聚类技术显示芯片分析结果，3株细胞同时有1.5倍变化的长链非编码RNA有63条，其中39条表达上升，24条表达下降(图2B)，差异有显著性意义(P < 0.05)。通过一系列生物信息学与实验筛选，选择AK007000进行进一步研究。芯片分析显示AK007000在C2C12、C3H10T1/2与MC3T3-E1均表达增高(图2C)(P < 0.05)。

2.3 AK007000干扰影响骨形态发生蛋白2诱导成骨分化结果 为了确定AK007000在成骨分化过程中是否起作用，以及何种作用。实验设计AK007000的siRNA，选择在3株细胞中干扰效率均较高的一条，见图3A。siRNA的序列为AK007000-si-F：CCC TGT CCT TCA GAT ACT A，AK007000-si-R：CCC TGT CCT TCA GAT ACT A。AK007000被干扰后，3株细胞在骨形态发生蛋白2(100 μg/L) 中诱导3 d，分别收mRNA。与未诱导对照组比较，观察C2C12、C3H10T1/2与MC3T3-E13株细胞成骨相关指标碱性磷酸酶、RUNX2、骨钙素、SP7，成肌指标肌细胞生成素(图3B-D)。3株细胞成骨指标降低，并且成肌指标肌细胞生成素明显增高(P < 0.05)。

参考文献

[1]Wapinski O,Chang HY. Long noncoding RNAs and human disease. Trends Cell Biol. 2011;21:354-361.
[2]Guttman M, Amit I, Garber M,et al. Chromatin signature reveals over a thousand highly conserved large non-coding RNAs in mammals. Nature.2009;458:223-227.
[3]Khalil AM, Guttman M, Huarte M, et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc. Natl Acad. Sci.USA. 2009;106:11667-11672.
[4]Rinn JL, Kertesz M, Wang JK, et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.Cell.2007;129:1311-1323 .
[5]Pauli A, Rinn JL, Schier AF. Non-coding RNAs as regulators of embryogenesis. Nature Rev. Genet.2011;12:136-149.
[6]Guttman M, Rinn JL, Modular regulatory principles of large non-coding RNAs. Nature.2012;482:339-346.
[7]Cesana M,Cacchiarelli D,Legnini I,et al.A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA.Cell.2011;147:358-369.
[8]Kretz M,Siprashvili Z, Chu C, et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non coding RNA TINCR.Nature. 2013;493:231-235.
[9]Kretz M,Webster DE,Flockhart RJ,et al.Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev.2012;26:338-343.
[10]Ng SY, Johnson R, Stanton LW. Human long non coding RNAs promote pluripotency and neuronal differentiation by association with chromatin modifiers and transcription factors. EMBO J.2011;31:522-533.
[11]Basem M,Abdallah MK.The use of mesenchymal (skeletal) stem cells for treatment of degenerative diseases: Current status and future perspectives.J Cell Physiol.2009; 218:9-12.
[12]Chen D, Zhao M,Mundy GR. Bone morphogenetic proteins. Growth Factors. 2004; 22: 233-241.
[13]Brooke G,Cook M, Blair C,et al.Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells.Semin Cell Dev Biol.2007;18: 846–858.
[14]Tsuchida K.Targeting myostatin for therapies against muscle‐wasting disorders. Curr Opin Drug Discov Devel.2008;11(4): 487-494.
[15]Hamrick MW, Arounleut P, Kellum E,et al.Recombinant myostatin (GDF-8) propeptide enhances the repair and regeneration of both muscle and bone in a model of deep penetrant musculoskeletal injury. J Trauma. 2010; 69(3):579-83.
[16]Connelly LB, Woolf A, Brooks P.Cost-effectiveness of interventions for musculoskeletal conditions. Disease control in developing countries. Oxford, U.K. Oxford University Press.2006;963-980.
[17]Connelly LB, Supangan R.The economic costs of road traffic crashes: Australia, states and territories.Accid Anal Prev.2006; 38(6):1087-93.
[18]Burge R, Dawson-Hughes B, Solomon DH, et al. Incidence and economic burden of osteoporosis-related fractures in the United States, 2005-2025. J Bone Miner Res.2007; 22(3):465-475.
[19]Marks R. Hip fracture epidemiological trends, outcomes, and risk factors, 1970-2009.Int J Gen Med.2010;3:1-17.
[20]Hamrick M. JMNI special issue: basic science and mechanisms of muscle-bone interactions.J Musculoskelet Neuronal Interact.2010;10(1):1-2.

引言

材料方法

设计：随机对照细胞学实验。

时间及地点：实验于2013年7月于同济大学附属第十人民医院中心实验室完成。

材料：

细胞：MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2细胞系均购自上海中科院细胞库。

实验方法：

细胞培养及骨形态发生蛋白2诱导成骨分化：MC3T3-E1细胞使用α-MEM培养基进行培养，C2C12与C3H10T1/2细胞使用DMEM培养基培养，其内均含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂及饱和湿度条件下培养。以含体积分数10%胎牛血清培养基2.5×10⁵/cm²接种细胞，第2天细胞汇合度约为80%，换含体积分数0.5%胎牛血清培养基饥饿24 h，用100 μg/L骨形态发生蛋白2、体积分数5%胎牛血清培养基诱导成骨分化，诱导72 h收RNA，诱导7 d碱性磷酸酶染色。

实时荧光定量PCR：按TRIzol试剂说明书提供的方法提取总RNA，测量RNA浓度及检测RNA质量，保证适宜浓度及A₂₆₀/A₂₈₀在1.8-2.0之间。按反转录试剂盒说明书提供的方法将其反转录成cDNA。以此cDNA为模板，18 s为内参照，按实时荧光定量PCR检测试剂盒说明书提供的方法进行PCR 扩增。PCR反应条件：第1步，95 ℃，30 s；第2步，95 ℃，5 s、60 ℃，30 s，共40个循环。SDS2.3确认扩增曲线和熔解曲线及导出实验结果，以2^－^ΔΔCt计算目的基因实验组与对照组mRNA的表达差异。

碱性磷酸酶染色：MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2细胞弃培养基，用PBS洗2遍，室温下40 g/L多聚甲醛固定10 min，按说明书配制碱性磷酸酶染液，弃固定液，蒸馏水洗2遍，24孔板每孔加染液400 μL覆盖细胞膜，分别避光染色1 h，弃染液，自来水洗2遍终止染色。晾干，分别拍摄原倍照片。

芯片分析长链非编码RNA表达差异：骨形态发生蛋白2诱导72 h所收细胞，提取RNA并且进行纯化，单色快速放大标记试剂盒标记、纯化，与探针进行杂交、清洗，扫描，最后使用Agilent Feature Extraction Software提取数据。利用Arraystar公司12×135 K的lncRNA芯片，覆盖目前所有权威数据库NCBI Refseq、UCSC、Known Gene、NRED、RNAdb等的长链非编码RNA。Arraystar lncRNA芯片设计探针为60 bp的长寡核苷酸，这些长寡核苷酸探针在高严格杂交条件下可得到高灵敏度及高特异性的理想实验结果。针对每条序列都设计了多条探针，增加了信号的可靠度。

siRNA干扰：按SuperFectin^TMIIRNA转染试剂说明书进行转染，50 nmol/L的长链非编码RNA siRNA分别转入到3株细胞中。转染后24 h换液，加入100 μg/L骨形态发生蛋白2，体积分数5%胎牛血清培养基诱导成骨分化，诱导72 h收mRNA。

主要观察指标：成骨诱导剂诱导3 d检测各组成骨指标碱性磷酸酶、骨钙素、RUNX2、SP7，成肌分化指标肌细胞生成素。

统计学分析：以上的实验数据均以x(_)±s表示，实验重复3次。用SPSS 10.0统计软件对所有测定值进行平均值、标准差计算和独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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