微球化人脐带Wharton胶间充质干细胞移植裸鼠皮下构建异位软骨

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.08.006

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (8): 1179-1184.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.08.006

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微球化人脐带Wharton胶间充质干细胞移植裸鼠皮下构建异位软骨

杨建华¹，刘舒云_²，赵鹏_³，卢世璧²，张莉²，黄靖香²，赵斌²，许文静²，郭全义²

1佳木斯大学附属第一医院，黑龙江省佳木斯市 154002；2解放军总医院骨科研究所，北京市 100853；3呼伦贝尔市人民医院，内蒙古自治区呼伦贝尔市 021008

收稿日期:2013-12-03 出版日期:2014-02-19 发布日期:2014-02-19
通讯作者: 郭全义，博士，副主任医师，解放军总医院骨科研究所，北京市 100853
作者简介:杨建华，男，1969年生，黑龙江省鸡西市人，汉族，硕士，主任医师，主要从事关节骨科研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81000810，81071458)；863计划项目(2102AA020502)，国家大学生创新项目资助

Cartilage construction in nude mice with microencapsulated stem cells derived from human umbilical cord Wharton’s jelly

Yang Jian-hua¹, Liu Shu-yun², Zhao Peng³, Lu Shi-bi², Zhang Li², Huang Jing-xiang², Zhao Bin², Xu Wen-jing², Guo Quan-yi²

1First Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital, Jiamusi University, Jiamusi 154002, Heilongjiang Province, China; 2Institute of Orthopedics, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China; 3People’s Hospital of Hulunbeier City, Hulunbeier 021008, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2013-12-03 Online:2014-02-19 Published:2014-02-19
Contact: Guo Quan-yi, M.D., Associate chief physician, Institute of Orthopedics, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China
About author:Yang Jian-hua, Master, Chief physician, First Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital, Jiamusi University, Jiamusi 154002, Heilongjiang Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81000810, 81071458; National High-Tech Research and Development Program of China (863 Program), No. 2102AA020502; the National Innovation Experiment Program for University Students

摘要/Abstract

摘要：

背景：软骨细胞外基质具有众多的信号分子蛋白和因子，其成分和特性最接近天然软骨组织，因而其很可能是构建组织工程软骨的最理想原料。
目的：探讨海藻酸钙-软骨细胞外基质混合凝胶微球复合人脐带Wharton胶间充质干细胞在裸鼠皮下异位构建组织工程软骨的可行性。
方法：制备软骨细胞外基质微丝悬液，将人脐带Wharton胶间充质干细胞接种于海藻酸钙-软骨细胞外基质混合凝胶微球中体外培养后植入裸鼠背部皮下(实验组)，以人脐带Wharton胶间充质干细胞混合于单纯藻酸盐凝胶微球作为对照组，于4周后取材进行大体和组织学苏木精-伊红、甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组化观察。
结果与结论：体外培养时微球中干细胞呈球形软骨细胞样形态，生长、增殖情况良好；实验组术后第4周取材可见外形呈类软骨样组织块，甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性，镜下观察可见大量类软骨样细胞及类软骨陷窝样结构，植入的混合凝胶微球周围组织无明显炎症反应；对照组显示微球部分降解，周围仅有少量炎症细胞及淋巴细胞。结果可见海藻酸钙-软骨细胞外基质具有良好的组织相容性，复合干细胞形成的微球植入裸鼠皮下可以构建为类软骨样组织。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 人脐带Wharton胶, 间充质干细胞, 藻酸盐, 软骨细胞外基质, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Cartilage extracellular matrix with a large number of signaling molecule proteins and factors is likely to be an ideal material for tissue engineering cartilage.
OBJECTIVE: To investigate the possibility of calcium alginate and cartilage extracellular matrix combined with microencapsulated stem cells derived from human umbilical cord Wharton’s jelly to construct ectopic tissue-engineered cartilage in nude mice.
METHODS: Microfilament suspension of the cartilage extracellular matrix was prepared. Human stem cells derived from Wharton’s jelly of the umbilical cord were inoculated in to calcium alginate and cartilage extracellular matrix gel microspheres as experimental group. Stem cells derived from human umbilical cord Wharton’s jelly were incubated in simple alginate gel microspheres as control group. After in vitro culture, the microspheres were implanted into the dorsal subcutaneous tissue of nude mice. Samples were taken after 4 weeks, respectively, for gross and histological observation.
RESULTS AND CONCLUSION: The stem cells exhibited parallel-chondrocyte morphology in microspheres, which grew and proliferated quite well during in vitro culture. A new parallel-cartilaginous tissue was found in the subcutaneous tissue 4 weeks after surgery in the experimental group, and the tissue was positive for hematoxylin-eosin, safranine O, toluidine blue and collagen II. A large number of parallel-chondrocytes and cartilage lacuna-like structures were observed under a microscope with no obvious inflammatory reaction around the microspheres. The control group showed the partial degradation of microspheres, surrounded by only a small number of inflammatory cells and lymphocytes. Calcium alginate and cartilage extracellular matrix microspheres have a rather good histocompatibility which can be used to construct parallel-cartilaginous tissues by implanting stem cell-microspheric compound into the subcutaneous tissue of nude mice.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: umbilical cord, mesenchymal stem cells, alginates, cartilage, extracellular matrix, tissue engineering

中图分类号:

R318

杨建华，刘舒云，赵鹏，卢世璧，张莉，黄靖香，赵斌，许文静，郭全义. 微球化人脐带Wharton胶间充质干细胞移植裸鼠皮下构建异位软骨[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(8): 1179-1184.

Yang Jian-hua, Liu Shu-yun, Zhao Peng, Lu Shi-bi, Zhang Li, Huang Jing-xiang, Zhao Bin,Xu Wen-jing, Guo Quan-yi. Cartilage construction in nude mice with microencapsulated stem cells derived from human umbilical cord Wharton’s jelly[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(8): 1179-1184.

图/表（结果） 1

2.1 软骨细胞外基质的成分表征显微镜下软骨外基质悬液成微丝状，扫描电镜显示悬液微丝为三维螺旋胶原结构(图1A)。阿尔辛蓝染色和Ⅱ型胶原染色均阳性(图1B，C)。Hochest33258染色荧光显微镜观察示无细胞及核物质残留，表明软骨脱细胞完全且保留了软骨细胞外基质的大部分成分(图1D)。

2.2 人脐带Wharton胶间充质干细胞体外培养形态学观察组织块接种24 h后细胞开始从组织块中爬出，分散贴壁生长，72 h后，贴壁细胞增多，生长活跃，细胞呈不规则星形或多角形，可见多处有圆形、哑铃形细胞分裂像，呈聚集性生长，可见细胞增殖较快(图2A)。原代细胞培养15 d左右爬满培养瓶，传代后生长速度明显加快。传到第3代时，可见细胞生长状态良好，多呈多角形和梭形，分散均匀生长增殖活跃(图2B)。

2.3 微球化干细胞的形态学观察干细胞接种到微球，实验组倒置显微镜下示细胞分布均匀，生长活跃(图2C)。环境扫描电镜示混合凝胶材料呈三维网状多孔结构(图2D)，包裹内的细胞生长状态良好，像软骨细胞样呈圆形或椭圆形，分泌外基质，周围形成软骨陷窝样结构。

2.4 微球体内移植后的大体和组织学观察裸鼠饲养4周过程中无死亡，伤口愈合良好，没有感染迹象，包埋凝胶微球材料位于皮下，形成皮丘，位置较固定，过量麻醉处死取材，4周时，外观乳白色类软骨样(图3A)，略缩小有少量降解，质较硬，基本保持球形，周围被透明筋膜组织包裹，与周围组织有粘连且少量血管浸润。标本行苏木精-伊红染色，可见微球周围没有/轻微炎症反应，细胞显示圆形，周围基质着色明显，分泌大量基质，分化为类软骨样形态(图3B)；甲苯胺蓝染色阳性，细胞周围有明显的蓝色(图3C)。番红O染色阳性，细胞周围有明显的红色包裹细胞，可见细胞分泌了丰富的聚糖类的软骨细胞外基质物质(图3D)；Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性，显示细胞核深棕色，周围基质呈棕黄色，可见干细胞在凝胶中可合成、分泌Ⅱ型胶原等基质(图3E)，材料上形成了明显的软骨陷窝样结构。对照组显示微球部分降解，周围仅有少量炎症细胞及淋巴细胞。

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引言

材料方法

设计：随机分组对照动物实验。

时间及地点：实验于2011年11月至2012年2月在解放军总医院骨科研究所完成。

材料：

实验动物：成年裸鼠6只，体质量250 g左右，雌雄不限，由解放军总医院动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置符合科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》^[4]。

新鲜猪关节软骨：购于北京猪肉市场。

实验方法：

软骨外基质微丝悬液的制备：参考文献[5-6]中软骨细胞外基质的制备方法，在无菌条件下，取新鲜猪膝、髋关节处软骨，经灭菌、蒸馏水漂洗、低温湿润下粉碎机粉碎、反复低渗冻融破细胞膜、离心机差速离心，获取50-200 nm软骨外基质微丝悬液。悬液再经 1% Triton X-100、 10 mmol/L Tris-HCl溶液，4 ℃、24 h再破细胞，蒸馏水漂洗离心，在37 ℃下加入50 U/mL DNase和1 U/mL RNase消化过夜，充分洗去细胞碎片和残留核物质，离心收集沉淀并调配成浓度为3%。用前用15 kGy ⁶⁰Co辐射灭菌。制备的软骨外基质微丝悬液涂片室温晾干，体积分数为95%乙醇固定10 min，用等渗PBS漂洗3次，行阿尔新蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、Hochest33258染色和环境扫描电镜观察。

主要试剂和仪器：
试剂及仪器	来源
海藻酸钠、DMEM/F12培养基、氯化钙、胰蛋白酶	美国Sigma 公司
标准胎牛血清	美国 Hyclone公司
Ⅱ型胶原鼠抗人单克隆抗体	福州迈新生物技术开发有限公司
CO₂恒温培养箱Hereus BB5060型	德国 Hereus 公司
Olympus IX70型倒置显微镜	日本Olympus公司
数控恒温水浴箱	德国Julabo公司
双人水平层流型超净工作台	北京半导体元件一厂
85-2 恒温磁力搅拌器	江苏常州国华仪器公司

环境扫描电镜观察：软骨微丝悬液凃于盖玻片上，用锋利刀片切取混合体样本，PBS清洗，依次进行2.5%戊二醛及1%锇酸固定，缓冲液清洗，乙醇梯度脱水，醋酸戊酯置换40 min，冷冻干燥机进行干燥，黏托、喷金，扫描电镜观察。

细胞分离及培养：无菌收集足月或剖腹产婴儿脐带，生理盐水清洗脐带血污，解剖刀在脐带一端划开外表皮，镊子用力撕下脐带外表皮，再分离两根动脉，最后将静脉内皮剔除，剥离Wharton胶，剪碎成1 mm³左右，加入

Ⅰ型胶原酶在磁力搅拌器的作用下消化10-14 h，用D-Hank’s液清洗，1 500 r/min离心3次，10 min/次。收集细胞种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱培养，每天倒置显微镜下观察细胞贴壁生长情况，细胞多数贴壁后全量换液，除去未贴壁细胞和杂质，以后每3 d或4 d半量换液。原代细胞汇合达80%-90%时传代，倒置显微镜观察细胞形态。

微球复合干细胞制备：首先将3%的软骨外基质悬液与2.4%的藻酸盐1∶1加入在一离心管中用漩涡振荡器充分混合均匀。取生长旺盛的第3代干细胞，用胰蛋白酶消化、收集、计数，行FDA/PI荧光染色观察细胞存活情况，再将混匀好的溶液加入收集细胞的离心管中，调整细胞浓度为5×10⁹ L^-1，充分吹打混匀，用1 mL的注射器配带16 G注射器针头吸取混匀好的复合体，距离氯化钙溶液界面上方2 cm处匀速滴入102 mmol/L的氯化钙溶液中形成包含软骨细胞外基质和间充质干细胞的藻酸钙凝胶球，静置20 min，用D-Hank’s液冲洗3次，收集微球置于含有体积分数为20%胎牛血清的软骨细胞培养液中培养，倒置显微镜和环境扫描电镜观察细胞在复合体中的形态。

动物实验：

动物分组：健康成年裸鼠6只，雌雄不限，背部两侧均用于实验，每只裸鼠右侧为实验组：人脐带Wharton胶间充质干细胞+脱细胞软骨细胞外基质+藻酸钙；左侧为对照组：人脐带Wharton胶间充质干细胞+藻酸钙。

手术过程：裸鼠用1%的水合氯醛1 mL腹腔注射麻醉，麻醉起效后，置裸鼠于俯卧位，背部皮肤用碘伏、乙醇消毒，铺无菌单，用眼科剪刀在背部做一小切口，把复合人脐带Wharton胶间充质干细胞的软骨细胞外基质-藻酸盐混合凝胶微球埋入皮下并远离切口，缝合切口，碘伏、乙醇再消毒切口处，待醒后放回笼中继续饲养；对照组皮下埋入复合脐带Wharton胶间充质干细胞的单纯藻酸盐凝胶微球。术后4周过量麻醉处死裸鼠取材。

术后一般情况观察：术后1周内观察每只裸鼠的精神状态，饮食情况，查看术区皮肤有无红肿、切口愈合情况。

植入组织的取材：第4周处死裸鼠取材，观察手术区有无炎症，红肿及异常分泌物，标本与周围组织有无粘连。标本经体积分数为10%甲醛溶液固定、梯度乙醇脱水、石蜡包埋处理、5 μm组织切片、逐步脱蜡，进行苏木精-伊红、甲苯胺蓝、番红O染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，光镜下观察。

主要观察指标：组织学和环境扫描电镜观察脱细胞软骨细胞外基质的特性，倒置显微镜和扫描电镜观察细胞在复合体中的形态，病理组织学观察微球复合体皮下异位软骨情况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

近年来软骨组织工程的兴起给软骨损伤的修复带来了新希望^[7-14]，其关键和核心是细胞和承载细胞的支架。在种子细胞方面研究和应用最多是自体软骨细胞，然而由于自体软骨细胞受到来源和增殖的限制，且长期多代二维培养细胞容易去分化，合成分泌外基质的能力逐渐下降，当细胞量少于1×10¹⁰ L^-1时不易形成软骨或形成很少^[15]，所以应用自体软骨细胞在科研和临床都受到限制，因而干细胞的研究受到亲睐。对软骨组织工程中细胞支架的要求：软骨组织无血管、无神经等的支配下支架载体不但要提供一个稳定的三维空间结构，有孔隙率，更重要的是其能有效维持表型，促进细胞增殖及向软骨方向分化^[16]。近年来有学者从刚分娩后的脐带组织中分离培养出了具有多向分化功能的间充质干细胞，其来源广，增殖快，免疫原性低，研

究和应用均不受伦理学限制^[17-19]。侯克东等^[20]更证明其具有天然向软骨方向分化的特性，与其他干细胞源相比，更适合用于构建组织工程软骨。

近几年，利用藻酸三维凝胶微球包裹干细胞的各项研究逐渐开展^[21-24]。藻酸盐是来源于海洋褐色藻类的多糖聚合物^[25]，价格便宜，来源广，无毒无害，分子表面有大量羟基，与钙离子交联可形成凝胶聚合物，凝胶球保水和吸水性好，细胞在凝胶内呈圆形或椭圆形类软骨样形态^[26]。Guo等^[27]首次报道了用藻酸钙凝胶培养软骨细胞的方法，能有效维持软骨细胞的表型和促进细胞增殖，并且该凝胶能够促进透明软骨细胞分泌糖胺聚糖和Ⅱ型胶原的聚集^[28]，海藻酸盐凝胶立体培养软骨细胞能相对完整的保持细胞的性质、表型、结构和功能，三维空间非常适合细胞增殖和保持良好表型，防止去分化，甚至在一定程度上可以逆转软骨细胞老化^[29]，藻酸钙微囊是理想的细胞生存和基质分泌的载体。Ma等^[22]将藻酸钙微囊包裹骨髓基质干细胞观察到有向软骨分化的趋势，藻酸凝胶微球类软骨特性和封闭的微环境有利于干细胞向软骨方向分化^[30]。

天然的软骨细胞外基质，是由体内软骨细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面及细胞之间的大分子物质。这些大分子形成了软骨细胞的胞外生长环境，其具有促进干细胞向软骨方向分化的作用^[31-32]，有效维持软骨样表型，其对细胞增殖、细胞间的信号传导、细胞迁移、软骨组织的力学承载有重要的作用^[33]，更重要的是软骨基质中有调控软骨细胞生长、黏附、增殖、迁移和分泌基质的受体信号和众多生长因子，包括转化生长因子β、胰岛素样生长因子1、骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子等^[34-38]，对去分化的软骨细胞可逆转为原有表型^[39]。天然的软骨细胞外基质，在软骨组织工程生物材料方面有广泛前景和优势。为此，本实验将两者混合构建新型凝胶体包裹干细胞共同培养观察其功能作用。

在体外培养时，干细胞可以通过微球空隙获得营养，代谢产物又可以通过多空隙排到凝胶外，复合细胞的混合凝胶微球扫描电镜示细胞在载体上成圆形或椭圆形类软骨样黏附，周围分泌基质，说明该微球能够为细胞提供类软骨样微环境维持细胞的表型及促进干细胞向软骨方向分化，细胞被微球包裹扩大了细胞与载体材料内的接触面积，这种模拟体内软骨细胞表型的球形形态，对刺激细胞持续合成和分泌软骨基质非常重要。Paige等^[40]利用海藻酸钠作为载体包裹软骨细胞，用微创注射性的方法注入裸鼠皮下，6周后发现有新鲜软骨样组织形成，另有学者发现将诱导的脂肪基质干细胞-藻酸盐凝胶植入裸鼠皮下，4，8周时标本均形成明显的软骨样组织^[41]。实验以混合凝胶微球复合人脐带Whartor胶间质干细胞植入裸鼠皮下，观察发现伤口不发生炎症反应，标本降解速度中等，植入第2周时，干细胞增殖明显，细胞聚集密度增加，在标本周围有少量血管形成，可见微球植入体内后可以通过周围血运获得营养，4周后取材外观乳白色，质较硬非常像软骨组织，标本行甲苯胺蓝、番红O和Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性，表明已异位成软骨样组织，但硬度与正常软骨相距还较远。

缺点与不足：实验仅在体外对混合凝胶微球进行了表征，并植入裸鼠皮下观察组织类软骨形成情况，结果表明该材料符合组织工程化软骨的要求，未在动物体内进行关节软骨缺损修复效果的验证，还需进一步观察研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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微球化人脐带Wharton胶间充质干细胞移植裸鼠皮下构建异位软骨

Cartilage construction in nude mice with microencapsulated stem cells derived from human umbilical cord Wharton’s jelly

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