同种异体脱钙骨与骨髓间充质干细胞关节腔内共培养：与同腔软骨性状的对比

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.08.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：临床发现膝关节内游离体能长期存在于关节腔内并能保持一定的软骨组织学特性和生理学特性，因此大胆提出假设：关节腔环境可能是软骨细胞生长、发育的较佳环境并提出“腔内培养，腔内移植”的理念。
目的：观察兔骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨基质体外培养或关节腔内培养组织工程软骨与同腔软骨的性状差异。
方法：实验分3组进行，体外培养组将经成软骨诱导的乳兔骨髓间充质干细胞与成年兔脱钙骨基质体外复合培养；腔内培养组将经成软骨诱导的乳兔骨髓间充质干细胞与成年兔脱钙骨基质以筋膜包裹，复合培养于成年新西兰兔膝关节腔内，以同腔内正常软骨为对照。
结果与结论：培养12周后：①体外培养组苏木精-伊红染色见软骨细胞少量增生，胞核蓝染；甲苯胺蓝染色见软骨细胞排列无序，少量周围基质包绕；Masson染色阳性区域小，细胞排列无序；Ⅱ型胶原免疫组织化学见软骨细胞胞浆及胞外基质少量黄色颗粒。②腔内培养组苏木精-伊红染色见软骨细胞增生，胞核蓝染；甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列，软骨陷窝形成，周围基质包绕；Masson染色阳性，软骨细胞多，基质蓝染，按一定应力方向排列；Ⅱ型胶原免疫组织化学见细胞外基质中出现较多棕黄色颗粒，Ⅱ型胶原染色阳性。说明骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质复合物可在体外及膝关节腔内培养出组织工程软骨，关节腔内培养的软骨比体外培养的软骨更接近正常软骨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 骨髓间充质干细胞, 同种异体脱钙骨, 组织工程软骨, 关节腔

Abstract:

BACKGROUND: Loose bodies in the knee are found to survive for a long term and maintain certain histophysiological properties of cartilage tissue. Therefore, a bold hypothesis is proposed that the joint cavity may be a preferred environment for chondrocyte growth and development, supporting the concept of “intracavitary culture and intracavitary transplantation”.
OBJECTIVE: To observe the trait difference of chondrogenic culture with allogenic decalcified bone matrix and bone marrow mesenchymal stem cells in the joint cavity or in vitro versus cartilage in the same cavity.
METHODS: There were three groups in this experiment: in in vitro culture group, bone marrow mesenchymal stem cells from newborn rabbits undergoing chondrogenic culture were co-cultured with decalcified bone matrix from adult rabbits in vitro; in intracavitary culture group, bone marrow mesenchymal stem cells from newborn rabbits undergoing chondrogenic culture were co-cultured with decalcified bone matrix from adult rabbits in the joint cavity; normal cartilage in the same cavity served as control group.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After 12 weeks of culture, in the in vitro culture group, hematoxylin-eosin staining showed a small amount of chondrocytes proliferated, with blue-stained nuclei; toluidine blue staining showed chondrocytes arranged disorderly, surrounded by a small amount of matrix; Masson staining showed a small positive area and irregular cell arrangement; type II collagen immunohistochemistry staining showed a few of yellow particles in the cytoplasm and extracellular matrix. (2) After 12 weeks of culture, in the intracavitary culture group, hematoxylin-eosin staining showed proliferation of chondrocytes with blue-stained nuclei; toluidine blue staining showed cluster-shaped arrangement of chondrocytes surrounded by the matrix with lacuna formation; Masson staining showed there were many positive cells with blue-stained matrix that arranged in a certain stress direction; immunohistochemical identification of type II collagen was positive, and brown-yellow stained particles could be discerned in the extracellular matrix. These findings indicate that tissue-engineered cartilage can be generated by co-culture of allogenic decalcified bone matrix and bone marrow mesenchymal stem cells in the joint cavity or in vitro, and the cartilage cultured in the joint cavity is more close to normal cartilage than that cultured in vitro.

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Key words: biocompatible materials, tissue engineering, cartilage, stem cells

中图分类号:

R318

徐斌，周亮，王英明，钱三祥. 同种异体脱钙骨与骨髓间充质干细胞关节腔内共培养：与同腔软骨性状的对比[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(8): 1165-1171.

Xu Bin, Zhou Liang, Wang Ying-ming, Qian San-xiang. Chondrogenic co-culture of allogenic decalcified bone matrix and bone marrow mesenchymal stem cells in the joint cavity: comparison of cartilage traits in the same joint cavity[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(8): 1165-1171.

图/表（结果） 3

2.1 骨髓间充质干细胞的分离培养及诱导

体外培养：原代培养24 h后少量圆形细胞贴壁，多数细胞仍呈悬浮状态。接种3 d后贴壁细胞增多，其中少数细胞伸出伪足变成纺锤样、长梭形，细胞核较大，呈圆形或椭圆形。4-6 d可见细胞集落形成，以后集落数目渐增多，10 d左右可达约90%融合。增殖传代的细胞贴壁迅速，约3 h大部分细胞贴壁，细胞呈长梭形均匀生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，4-6 d即能达到90%融合，细胞形态均匀，平行排列。呈螺旋状或漩涡状，传至第3代时无明显变化(图1A)。

成软骨诱导：取第3代骨髓间充质干细胞，加入软骨定向诱导液诱导培养14 d后可见细胞周围有基质分泌 (图1B)。

2.2 同种异体脱钙骨的形态观察脱钙骨支架材料维持其原有形态并有一定韧性和强度，可按要求修剪成一定形状，呈蜂窝状多孔的三维立体结构，表面孔隙与深层孔隙相通，表面纤维有少部分断裂(图1C,D)。

2.3 组织标本观察新西兰白兔施行膝关节腔内复合物植入后无明显排异反应，手术切口干燥，无红肿、渗出，膝关节活动无明显受限。取材时见关节液清亮，关节腔无明显粘连、滑膜增生、关节游离体或骨赘形成。饲养过程中未出现动物死亡。

大体形态观察：体外培养组，术后4周时，标本表面凹凸不平明显，内部空隙较多，随着时间延长，至术后12周时，标本表面凹凸不平变平坦，内部空隙逐渐减少，但内部尚有部分空隙(图1E)。腔内培养组，术后4周时，标本表面凹凸不平，内部空隙较多，随着时间延长，标本表面逐渐形成透明软骨样物质，内部孔隙空隙逐渐减少，至12周时，形成类似正常软骨样外观(图1F)。同腔正常软骨表面光滑，呈半透明状(图1G)。

石蜡切片苏木精-伊红染色：体外培养组，术后4周时见细胞核蓝染，软骨细胞少量，无软骨陷窝形成，8周时软骨细胞增多；12周时软骨细胞已大量增殖(图2A)。但各时期软骨细胞排列无序。腔内培养组，术后4周时标本支架内软骨细胞数量明显较多，软骨陷窝形成，陷窝周围基质深染；术后8周时标本支架内软骨细胞数量多，细胞周围分泌着色均一的玻璃样基质，且渗入支架结构内部，脱钙骨支架有部分被吸收，12周时细胞核蓝染，细胞质及软骨基质红染，支架基本被吸收，软骨细胞充分渗透进入支架内，形态变小，呈一定应力方向排列(图2B)。同腔正常软骨细胞核蓝染，细胞质及软骨基质红染，软骨细胞排列致密，按一定方向排列有序(图2C)。

石蜡切片甲苯胺蓝染色：体外培养组，术后4周时软骨细胞少量形成，排列紊乱，周围少量基质包绕；8周时软骨细胞增殖，排列无序；12周时细胞较多，排列无序，细胞周围基质包绕(图2D)。腔内培养组各时间取材标本甲苯胺蓝染色均可见软骨细胞分泌的酸性玻璃样基质被染成红色或紫红色，随时间发展染色增多，支架等结构被染成蓝色(图2E)。同腔正常软骨细胞排列致密，按一定方向排列有序(图2F)。

石蜡切片Masson染色：体外培养组，术后4周时少量细胞外基质包绕；8周时细胞外基质增多，软骨细胞排列无序；至12周时软骨细胞多且排列紊乱，基质蓝染(图2G)。腔内培养组各时间取材标本染色均可见胶原染色阳性，后期较早期染色更明显，至12周时软骨基质蓝染，软骨细胞多，按一定应力方向排列(图2H)。同腔正常软骨软骨基质蓝染，软骨细胞排列致密，按一定方向排列有序(图2I)。

石蜡切片Ⅱ型胶原免疫组织化学(SP法)染色：体外培养组，术后4周时可见少量的Ⅱ型胶原表达；8周时胞周可见棕黄色反应物颗粒, 周边的少量零散细胞多呈阴性反应；12周时Ⅱ型胶原免疫组织化学反应呈强阳性，软骨细胞胞浆及胞外基质少量黄色颗粒(图2J)。腔内培养组，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性，胞浆和基质呈棕黄色，且随时间后延，细胞外基质中棕黄色颗粒越多，表现也越明显(图2K)。同腔正常软骨细胞外基质中出现大量棕黄色颗粒，Ⅱ型胶原染色强阳性(图2L)。

每组免疫组织化学切片均随机选取10个不重叠视野，利用荧光显微镜及摄像系统×200倍视野分组别摄片。再将图片传输录入捷达801D形态学分析系统软件中，通过软件分析计算出平均吸光度(A)值、积分吸光度等。吸光度值越大，则光线被吸收程度就越大，免疫复合物的颜色就越深，溶质含量就越高；反之吸光度值越小则颜色越浅。

将两组测得的A值输入SPSS 17.0统计学软件计算每组的x(_)±s，再进行重复测量方差分析和组间t 检验，检验标准P < 0.05判定差异有显著性意义。

第4周起腔内培养组Ⅱ型胶原免疫组织化学的A值上升，与体外培养组相比差异有显著性意义(t=22.294 6， P < 0.05)；随着时间的推移，腔内培养组Ⅱ型胶原免疫组织化学的A值逐渐升高，体外培养组无明显变化，至12周时腔内培养组与体外培养组相比差异有显著性意义(t=7.840 3，P < 0.05)，与同腔正常软骨组相比差异无显著性意义，见表1。

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引言

材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：于2010年1月至2011年1月在安徽医科第一附属医院实验中心完成。

材料：

实验动物：4-6周龄新西兰新生白兔，体质量 0.5-1.0 kg；新西兰成年白兔，体质量2.5-3.5 kg，由安徽医科大学实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准^[5]。

PBS的配制：取1袋PBS粉溶解于200 mL 蒸馏水中，混匀，用过滤器过滤除去杂质，用蒸馏水稀释至 2 000 mL (浓度为10%)分装于玻璃瓶中，于高压蒸汽灭菌锅里消毒，4 ℃冰箱保存备用。

双抗的配制：将青霉素80×10⁴ U溶于16 mL超纯水制成浓度为5×10⁴ U/mL，将链霉素100×10⁴ U溶于20 mL超纯水制成浓度为5×10⁴ U/mL，过滤灭菌后分装并于-20 ℃冰箱保存，备用。

完全培养基的配制：90 mL DMEM/F-12 基础培养基+上述配置好的双抗各200 µL+优等胎牛血清10 mL，配置成胎牛血清终浓度为10%，双抗终浓度为100 U/mL的完全培养基，分装后4 ℃冰箱保存备用。

成软骨诱导液的配制：将维生素C用5 mL灭菌的PBS溶解(5 mL∶1 g)配成0.2 g/mL，将20 µg胰岛素样生长因子1用5 mL灭菌的PBS溶解配成4 mg/L，将1 µg转化生长因子β1用1 mL灭菌的PBS溶解配成1 mg/L。完全培养基 100 mL+维生素C 25 µL+0.5 mL胰岛素样生长因子1+1 mL转化生长因子β1，配置成转化生长因子β1 10 µg/L、胰岛素样生长因子1 20 µg/L、维生素C 50 µg/L，分装后4 ℃冰箱保存备用。

同种异体脱钙骨复合骨髓间充质干细胞关节腔内培养软骨实验的主要试剂及仪器：
试剂与仪器	来源
PBS、柠檬酸盐缓冲液、乙烯二胺四乙酸、免疫组化染色试剂盒(SP-9000)、过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒、浓缩型 DAB 试剂盒、多聚赖氨酸	北京中杉金桥生物技术有限公司
红细胞裂解液、胰酶细胞消化液(含 0.25%胰酶和0.02%EDTA)	江苏碧云天生物技术研究所
青霉素针剂、链霉素针剂	华北制药有限公司
DMEM/F-12 基础培养基、优等胎牛血清	美国 Hyclone 公司
谷氨酰胺	C5H10N2O3，Sigma，常温保存
锥虫蓝、苏木精	上海捷瑞生物工程有限公司
重组人TGF-β1、IGF-I	PEPROTECH，USA
伊红	上海三爱思试剂有限公司
甲苯胺蓝：C15H16C1N3	美国 BIOFER 公司
Masson三色染色试剂盒	福州迈新生物技术开发有限公司
兔抗 collagen-Ⅱ一抗	北京博奥森生物技术有限公司
低速自动平衡离心机	LDZ5-2，北京医用离心机厂
二氧化碳培养箱	HEPACLASS 100，USA
倒置相差显微镜	Olympus CX21，Japan
荧光显微镜及摄像系统	Nikon ECLIPSE 80i, Japan
普通光学显微镜	JNOEC XS-212-201

甲苯胺蓝染液的配制：将0.8 g甲苯胺蓝用280 mL超纯水溶解后过滤使用，过滤后的染液加入120 mL的无水乙醇即可使用。

实验方法：

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养及向软骨诱导：选同源新西兰新生白兔3只，耳缘静脉注射空气处死后，体积分数75%乙醇浸泡消毒15 min，于无菌手术台上完整取出双侧股骨、胫骨、肱骨及髂骨，剔除附着的软组织及骨膜，将两侧干骺端剪断，用无菌的PBS冲洗髓腔，得冲洗液 10 mL并置入离心管中；将离心管置于离心机中800 r/min离心5 min，离心半径为270 mm，弃上清。加入1 mL红细胞裂解液，作用约3 min，加入5倍体积PBS，800 r/min离心5 min，离心半径为270 mm，洗涤2次；4 g/L锥虫染色计数活细胞比例90%以上后，将分离出的细胞悬液细胞计数后以2×10⁷ L^-1的细胞浓度接种培养瓶中，每瓶加入含体积分数10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM/F-12培养基约5 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养箱内培养，8 h后观察其贴壁情况，接种后2 d首次换液，弃去未贴壁细胞及死细胞，以后每隔2-4 d换液 1次，每日倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长情况。

取第3代骨髓间充质干细胞生长至铺满瓶底70%-80%时，用含软骨细胞诱导液的培养基培养，诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。诱导2周后的骨髓间充质干细胞形态已经发生明显变化，用0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液，调整细胞浓度为2×10⁹ L^-1，此为实验所用种子细胞。

脱钙骨的制备：将1只成年雄性新西兰白兔耳缘静脉注射空气处死后，取其髂骨及椎体骨，剔除软组织及骨膜，蒸馏水洗净骨髓及残血等，多次漂洗至水澄清，过滤后吹干，置-20 ℃保存3 d，再依次行：无水乙醇脱水2 h，风干；氯仿/甲醇(1∶1，体积分数)脱脂4 h，风干；0.6 mol/L盐酸分别脱钙12 h(盐酸/松质骨为20 mL/1 g)，风干；将其制成直径3.3 mm，高3 mm圆柱状标本；无水乙醇脱水2 h，风干；氯仿/甲醇脱脂4 h，风干；以蒸馏水反复漂洗； 10%PBS(pH 7.4)37 ℃浸泡72 h，风干；分成小包装环氧乙烷灭菌，置4 ℃冰箱保存；随机抽检灭菌效果，培养3次均无细菌生长，-20 ℃冰箱贮存备用。

细胞-载体复合物的构建：随机抽取已消毒备用的较完整脱钙骨支架30块，分别浸入两个16孔培养板内的种子细胞悬液中，确保骨块被细胞悬液完全浸透，依靠松质骨块多孔隙结构的自身吸附作用吸收细胞悬液，其中15块作为体外培养组；将16孔板置于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养箱内培养约6 h，期间间隔观察，防止复合物在培养箱内过于干燥；共培养6 h后加入含体积分数10%FBS及双抗的完全培养基继续培养。

细胞-载体复合物筋膜包裹和腔内培养：耳缘静脉注射空气处死成年雄性新西兰白兔1只，碘伏消毒，剥去其背部皮毛，取腰背筋膜及背部肌肉筋膜剪裁为数个直径 1.0-1.5 cm大小膜片，作包裹细胞-载体复合物用；将16孔板内制备好的另外细胞-载体复合物15个分别取出用膜片包绕，“0”号线缝合筋膜，将复合物完整包绕在其中，两端各留数厘米缝合线留做标记，此15个细胞-载体复合物作为腔内培养组，预备植入15只新西兰白兔的左侧膝关节腔内。

取成年雄性新西兰白兔15只，称质量后2%戊巴比妥钠按0.1 mL/kg耳缘静脉麻醉后固定于手术台上，左侧膝关节剪毛、碘伏消毒；取膝外侧髌骨下缘切口约1.5 cm，逐层切开皮肤、皮下组织，暴露髌韧带外侧缘，从髌韧带下方切开关节囊，暴露膝关节腔；将上述带缝线的组织块植入兔左侧膝关节髌韧带下间隙内，将标记缝线打结固定于皮下，逐层缝合关节囊和皮肤；待兔麻醉清醒后肌肉注射青霉素3 d，预防切口及关节腔内感染。术后笼养，不限制其活动，并被动活动其膝关节0.5 h/次，2 次/d。于术后第4，8，12周分别处死动物并取材，与体外培养组一起进行标本观察。

主要观察指标：体外培养组与腔内培养组标本苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、Masson三色染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学观察结果。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计学软件对实验数据进行统计学分析，实验数据用x(_)±s表示，对进行比较的两组资料行方差分析、t 检验，检验标准P < 0.05判定差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

关节软骨无血管，损伤后难以自行修复，而传统组织重建有以下缺点和不足：缺乏一定质量和数量的自体同源移植物、异体移植物免疫原性等问题^[6]。因此这些方法临床应用前景并不乐观。软骨组织工程的建立和发展，为软骨缺损的治疗和修复提出了一条新的思路和方案，可望克服这些缺点。而软骨组织工程的关键因素主要有3个，即种子细胞的获得，支架材料及其构建，种子细胞增殖及与环境的相互作用^[7]。

3.1 种子细胞的选择间充质干细胞来源于骨髓、骨膜、软骨膜和肌腱等，具有多向分化潜能，根据诱导环境的不同可分化为软骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞、心肌细胞等多种细胞^[8]。它们传代繁殖能力强，连续多次传代仍可保持良好的增殖分化活性。骨髓间充质干细胞便是其中一种，它是来源于骨髓的一群非造血干细胞，来源易得，取材方便，分离和培养简单，增殖能力强，可在体外大规模扩增而不丢失多方向分化潜能，并且异体移植时排斥反应小^[9-10]，在适当的生长因子调控下可向成软骨细胞方向分化并具有良好的生物学活性。因此，骨髓间充质干细胞被认为是软骨组

织工程最有希望的种子细胞来源之一。

鉴于以上原因，实验选择研究相对成熟且应用广泛的骨髓间充质干细胞作为种子细胞，通过培养发现所获细胞形态典型均一，原代培养约10 d、传代培养约5 d就可进行传代，表现出快速的增殖速度；同批培养瓶中细胞形态相似、生长速度接近，传代时间统一，说明其生长性状稳定，这表明实验的培养体系有利于兔骨髓间充质干细胞的生长。通过细胞形态及表型鉴定证实获取的是骨髓间充质干细胞。

3.2 支架材料的选择在软骨组织工程中，支架材料占据着非常重要的地位^[11]。其在软骨组织工程中充当作临时细胞外基质的作用，三维支架为软骨细胞提供附着、增殖、分化和代谢的场所。随着软骨细胞分泌细胞外基质成分的增多，可吸收性三维支架逐渐被降解、吸收，最后完全被细胞分泌的细胞外基质替代，形成软骨组织^[12-14]。实验采用兔同种异体脱钙骨作为支架，其制备工艺简单成熟，具有良好的可塑性和材料-细胞界面，以及一定的机械强度，制备成功后呈疏松多孔的三维立体网状结构，可长期保存，与骨髓间充质干细胞复合后，植入兔关节腔内无明显炎症反应，生物相容性好，其在体内降解时间为8-12周，而一般软骨形成需8周左右，二者契合良好。从实验看来，术后4周腔内培养组Ⅱ型胶原免疫组织化学的A值上升，术后8周的A值逐渐升高，至术后12周时与正常软骨无统计学差异，体外培养组A值升高不明显，说明软骨渗入支架时间与支架降解时间契合良好。因此从实验看来，脱钙骨是一种良好的软骨组织工程支架材料。

3.3 种子细胞的增殖及与环境的相互作用骨髓间充质干细胞在体内的含量极少，即使在分布较多的骨髓组织中，仅约占骨髓中单个核细胞的0.000 1%-0.01%^[15]，因此，对骨髓间充质干细胞的分离纯化和体外扩增就显得非常重要了。目前用于骨髓间充质干细胞培养的营养液配方有多种，实验采用的是DMEM/F-12培养基，有研究显示其含有更丰富的营养物质和微量元素，更能促进细胞的增殖，较适合于培养骨髓间充质干细胞。

如何促进骨髓间充质干细胞增殖并诱导其向成软骨分化是实验的重要步骤之一。多种生长因子对骨髓间充质干细胞的增殖分化起调节作用，如转化生长因子β1、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1等。

转化生长因子β1是软骨组织工程学首选的生长因子，其具有多种生物学效应：促进软骨前体细胞趋化到骨软骨损伤部位，诱导未分化的骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞；促进软骨基质的合成^[16]；抑制软骨分解代谢。而关节软骨缺损修复远期疗效不佳的一个重要原因，是在关节软骨损伤的病理过程中多种炎症递质参与软骨基质的降解，如白细胞介素、肿瘤坏死因子、干扰素等，转化生长因子β1能抑制这些炎症递质的活性，但其具有潜在的成骨活性。另外，关节内注射或通过基质材料控释转化生长因子β1，可促进关节软骨缺损修复，但大剂量反复应用则可引起滑膜增生和骨赘形成^[17]。因此，单独应用转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向成软骨方向分化存在一定的缺陷。胰岛素样生长因子1是一种强有力的合成代谢刺激因子，可以促进软骨细胞的增殖和成熟，合成软骨基质蛋白多糖。研究表明，胰岛素样生长因子1可促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化^[18]，还可抑制转化生长因子β1引起的细胞外焦磷酸盐积聚，防止焦磷酸盐结晶的形成和进一步成骨^[19]。维生素C本身虽并不能使骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化，但其可使细胞分泌基质和胶原纤维有机的组成和排列，构成一个特殊环境，有利于细胞发生自分泌与旁分泌作用，保证内外源性因子的传输，在局部贮存和清除重要的活性物质，具有非特异的促进细胞增殖与转化作用。因此，实验选择用转化生长因子β1为主要的诱导因子，加上胰岛素样生长因子1与维生素C以协同，诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。加上Ⅱ型胶原是软骨细胞的基因表达产物，可用来确定软骨细胞的表型^[20]。实验通过诱导前后的细胞爬片Ⅱ型胶原免疫组织化学显示诱导后为阳性，而诱导前为阴性，由此证实了成功将骨髓间充质干细胞向软骨方向诱导。

另外，软骨细胞在体内受多种生长因子及理化环境、力学因素刺激的作用，因而有学者提出要充分利用体内局部的血运、理化因子刺激种子细胞以更高的速度和更好的质量形成新的组织工程软骨。Smith等^[21]采用周期性压力对软骨细胞进行加压，结果发现实验组软骨细胞生长活跃，I型胶原mRNA的表达比对照组增加9倍，蛋白聚糖增加20倍。王刚等^[22]探讨不同应力环境对骨髓间充质干细胞修复关节软骨缺损的影响，发现只有在正常应力状态下软骨缺损的修复效果最佳，提示维持负重关节正常的应力刺激对组织工程软骨修复组织的形成和维持必不可少。体外单层培养的软骨细胞将逐渐发生去分化，形态上转变为扁平、梭形的成纤维细胞样外观，难以维持其细胞表型，Ⅱ型胶原和软骨蛋白合成的降低则说明了其生化和遗传特性的改变，原因可能是体外培养的力学、营养微环境和受其影响的细胞间及细胞-基质间的相互作用与体内条件迥异。体外培养组织工程软骨则缺乏这一系列因素的作用，因此体外骨髓间充质干细胞和脱钙骨支架复合体向软骨组织转化需要准确模拟膝关节腔内的环境。

如何模拟软骨细胞接近人体生理成长环境就是一个需要深入研究的课题。临床医生经常发现这样一种现象，即膝关节内游离体能长期的存在于关节腔内并能保持一定的软骨组织学特性和生理学特性，受此临床现象的启发，作者大胆提出假设：关节腔环境可能是软骨细胞生长、发育的较佳环境，并提出“腔内培养，腔内移植”的理念。故实验尝试在兔膝关节腔内进行细胞-支架复合体工程软骨的培养，力求最大程度还原正常软骨细胞增殖、分化所需的环境；同时采用国内外通用成熟的筋膜包裹技术防止细胞外漏，利用固定筋膜片的半透膜作用，允许营养物质进入和新陈代谢产物的排出^[23]。实验结果证实腔内培养的软骨比体外培养的软骨更接近正常软骨，更符合需要的组织工程软骨。

经向软骨方向诱导的兔骨髓间充质干细胞与脱钙骨支架构成的复合物可在体外及膝关节腔内培养出组织工程软骨，关节腔内培养的软骨比体外培养的软骨更接近正常软骨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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