局部注射辛伐他汀对骨质疏松大鼠股骨髁骨小梁的改建效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.46.003

摘要/Abstract

摘要：

背景：局部注射具有成骨作用的辛伐他汀，可显著增加骨质疏松大鼠股骨颈及股骨髁部的骨密度及力学强度，分析局部注射辛伐他汀对股骨髁骨小梁的影响。
目的：进一步研究骨质疏松大鼠股骨内局部注射辛伐他汀对股骨髁骨小梁的影响。为将辛伐他汀应用于临床骨质疏松局部治疗提供实验基础。
方法：18只雌性SD大鼠双侧卵巢切除后3个月，制备大鼠骨质疏松模型。实验大鼠随机数字表法均分为3组，分别在实验大鼠的右侧股骨髓腔内单次注射辛伐他汀溶液5 mg、10 mg，对照组单纯注射空白载体。分别在注射后1个月处死大鼠并取材。Micro-CT扫描并定量分析骨组织形态变化。
结果与结论：给药后1个月，Micro-CT扫描结果显示，辛伐他汀治疗组的骨微结构参数如骨皮质厚度、骨小梁密度及连接率明显优于对照组。说明疏松骨骼单次注射小剂量辛伐他汀可显著促进股骨髁部骨小梁改建，改善骨骼微结构，可为强化局部、防治骨质疏松骨折的新选择进一步提供实验基础。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, 辛伐他汀, 骨质疏松, 卵巢切除, 局部注射, 股骨髁, 骨形成, 骨皮质, 骨小梁

Abstract:

BACKGROUND: Local injection with simvastatin can induce osteogenesis, significantly increase the bone mineral density and mechanical strength of femoral neck and femoral condyle of rats with osteoporosis and analyze effects of local injection of simvastatin on trabecular bone of the femoral condyle.
OBJECTIVE: To explore the effects of local injection of simvastatin on trabecular bone of the femoral condyle of osteoporotic rats and provide experimental basis for the application of simvastatin in clinical topical treatment of osteoporosis.
METHODS: Eighteen female Sprague-Dawley rats received bilateral ovariotomy at 3 months, and were used to produce rat models of osteoporosis. They were assigned into three groups. Experimental rats received 5 and 10 mg simvastatin by single injection into right femoral cavity. Control rats received blank vector. The rat models were sacrificed at 1 month after injection and specimens were collected. Right femoral condyles were taken out for bone histomorphometric analysis by Micro-CT.
RESULTS AND CONCLUSION: One month post-injection, Micro-CT scanning results revealed that cortical bone thickness, trabecular bone density and connection rate were significantly better in the simvastatin group than those in the control group. Results indicated that single injection of small-dose simvastatin obviously promoted rebuilding of trabecular bone of condyles of femur, improved microstructure of skeleton, strengthened local skeleton, prevented and treated osteoporosis, and provided a further basis for the prevention and treatment of osteoporosis, especially for osteoporotic fractures.

Key words: osteoporosis, ovariectomy, femur, femoral neck fractures, imaging, three-dimensional

中图分类号:

R318

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Li Yang, Feng Shi-qing, Yang Ning. Local injection of simvastatin affected reconstruction of trabecular bone of condyles of femur of osteoporotic rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(46): 7994-7999.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

设计：动物实验，对照观察。

时间及地点：于2013年1至6月在天津医科大学实验动物科学部实验完成。

材料：

实验动物：健康3月龄雌性SD大鼠18只，体质量260-280 g，购自天津医科大学实验动物科学部，许可证号：SYXK(津)2009-0001。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

实验方法：

辛伐他汀注射液的配置：辛伐他汀标准品溶于PBS(内含2%DMSO与0.1%BSA)^[4]，辛伐他汀的浓度分别为 50 g/L与100 g/L，同时配置1 mL空白载体作为对照，⁶⁰Co辐照灭菌备用^[4]。

大鼠骨质疏松模型的建立及其分组：10%水合氯醛 (3.3 mL/kg)腹腔内注射麻醉后，俯卧位固定、常规消毒后经腰背侧肋脊角切口进入腹膜外，切除双侧卵巢。低钙饮食3个月后18只大鼠随机均分为3组(n=6)：注射辛伐他汀5 mg组，10 mg组及对照组。骨质疏松造模为标准的造模实验，成功的指标比较造模前后体质量和骨密度的改变^[5-6]，3个月大鼠均造模成功。

股骨髓腔内注射辛伐他汀：10%水合氯醛(3.3 mL/kg)腹腔内注射麻醉后，钝性分离股外侧肌显露近端外侧股骨，骨科减压钻(φ=1 mm)在大转子下0.5 cm处沿股骨颈纵轴方向钻入，显露骨髓腔, 辛伐他汀组微量注射器分别注射辛伐他汀5 mg, 10 mg后骨蜡封闭^[7]，注射后肌注青霉素10×10⁴ U/d，连续3 d以预防感染。对照组不注射辛伐他汀。

主要观察指标：给药后1个月处死动物，取右侧股骨标本，-20 ℃冰箱储存。

Micro-CT扫描与重建分析：应用小动物Micro-CT，在相同条件下对近端股骨进行三维CT扫描重建，扫描的各项参数设置如下：空间分辨率18 µm，电压600 kV，电流300 µA，扫描时间900 ms。将股骨髁内的所有松质骨设置为感兴趣区域(ROI)，ROI边界紧靠股骨髁皮质骨内侧，形状不规则，长度设为2 mm，见图1。扫描结束后，应用Inveon research workplace 分析软件，根据文献介绍的方法对骨微结构进行分析^[8]。分析参数包括相对骨体积(bone volume/tissue volume, BV/TV)、骨小梁厚度 (trabecular thickness, TbTh)、骨小梁数量 (trabecular number, TbN ) 、骨小梁间隙(trabecular spacing, TbSp)及骨皮质厚度(cortical wall thickness, CWT)。骨皮质厚度的测定根据文献报道的方法^[9-10]，在股骨髁部位取8个不同的位置，然后取这8个位置的平均值作为骨皮质的厚度。

统计学分析：测定数据采用x(_)±s表示，采用 SPSS16.0进行数据处理，组间比较采用方差分析(ANOVA)和 LSD检验，设P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨质疏松症是一种以骨量减少和骨强度降低为表现的代谢性疾病，其病程隐袭，最终结局为局部的脆性骨折，其一旦发生，治疗非常棘手，也会造成沉重的家庭和社会负担。据统计，仅在中国每年就有约130万人发生骨质疏松性骨折^[11-12] 。骨质疏松性骨折后其他部位的骨折风险也将明显增加。40%的50岁以上妇女至少经历过一次脆性骨折，骨质疏松性髋部骨折第1年的死亡率高达20%-40%，50%的生存者留有残疾^[13-14] 。随着中国老龄化社会的到来，由骨质疏松症所带来的健康问题日益严重。
骨质疏松的病理改变包括“质”和“量”两个方面，质变主要表现在骨小梁的微观三维结构，如骨小梁的密度、连接率等^[15] 。因此，本研究还采用了Micro-CT对股骨髁部位的骨小梁进行了分析，以进一步评估辛伐他汀对骨小梁微观结构的影响。实验结果表明，手术后1个月，对照组骨小梁的微结构紊乱，彼此断裂、分离，数量减少，连接性差。实验组辛伐他汀5 mg组和辛伐他汀10 mg组，无论在骨密度还是骨小梁三维结构方面均明显优于对照组。这充分说明了局部注射小剂量辛伐他汀可显著促进骨小梁改建，改善骨微结构。
杨宁等^[4]在以往的研究中发现骨质疏松大鼠股骨髓腔内局部注射小剂量辛伐他汀可显著提高疏松股骨股骨髁部位的力学性能，但其仅分析了股骨髁上骨微结构，而没有分析股骨髁部骨微结构，作者这次实验弥补了这个缺憾，并进一步支持了以往的研究结果。有研究证实系统应用辛伐他汀可以促进去卵巢骨质疏松大鼠皮质骨的骨形成，增加皮质骨的骨量^[16-17] ，部分治疗去卵巢大鼠的骨质疏松。本实验中通过对股骨髁部骨皮质的测定证实了髓腔内注射辛伐他汀对疏松的皮质骨具有强烈的成骨作用。实验组辛伐他汀5 mg组和辛伐他汀10 mg组髓腔内给药后1个月比对照组骨皮质厚度分别增加了12.1%和13.0%，骨质疏松大鼠股骨髓腔内单次注射小剂量辛伐他汀后强效而持久的促进皮质骨合成的作用十分明显。这也与杨宁等的研究相吻合。
骨质疏松症治疗的最终目的是防止脆性骨折发生。目前临床上常用的治疗骨质疏松症的一线药物如双膦酸盐、雌激素、降钙素等均为骨吸收抑制剂，不能刺激成骨而只能延缓骨量的丢失且具有服药周期长、见效慢、不良反应大及服药依从性低等缺点，难以在短期内迅速提高骨密度^[18-19] 。有文献报道口服双膦酸盐3个月后内固定周围的骨丢失才逐步减少^[20] ，且只有不到50%的病人能坚持服用双膦酸盐1年以上^[21] 。因骨质疏松性骨折的好发部位非常集中(46%发生于脊柱且大多在T₁₂ 、L₁椎体，约30%发生于髋部)，且系统药物治疗达到局部的药物浓度很低，因此将药物应用于临床上易发生骨质疏松性骨折部位的局部治疗成为目前研究的热点^[22] 。
Peter等研究发现将内植物的羟基磷灰石涂层浸入含不同浓度的Zoledronate (0，0.2，2.1，8.5，16.0 mg/内植物)悬液中，然后植入骨质疏松大鼠的股骨髁，其中浓度为 0.2-8.5 mg Zoledronate/内植物的组显著提高了内植物的稳定性^[23] 。吴子祥等^[24]将bBMP(Bovine BMP)与纤维蛋白凝胶复合物注射至骨质疏松绵羊椎体内3个月可显著改善骨小梁的三维结构，增加椎体的骨密度和力学强度。Tanaka等^[25]研究发现，在骨质疏松大鼠的股骨内注射磷酸钙骨水泥可有效提高疏松股骨的骨强度达6个月之久。但双膦酸盐类药物为骨吸收抑制剂，只能延缓骨量的丢失而无刺激成骨的作用；骨形态发生蛋白作为生物制品，价格昂贵，限制了其临床应用；骨水泥类材料只能物理性地提高骨骼力学强度且具有吸收降解缓慢、与周围骨骼的生物相容性差、不良反应大等缺点。因此，为了避免这些缺点，具有成骨作用的辛伐他汀成为研究热点。宋纯理等^[26]研究发现辛伐他汀能上调骨形态发生蛋白2及雌激素受体α的表达，促进骨髓基质细胞的成骨分化，也可以治疗去卵巢大鼠的骨质疏松^[27] 。但他汀类药物系统应用后肝脏代谢的首过效应明显，仅有不到5%的药物能够进入血液循环，骨骼中的浓度则更低，因此改变给药途径，或许可以提高其生物利用度^[28-30] 。杨宁等^[4]采用局部注射具有成骨作用的辛伐他汀，发现髓腔内局部注射仅1个月，便可显著增加骨质疏松大鼠股骨颈及股骨髁部的骨密度及力学强度，并且这种效果可持续至少5个月之久。但其并没有分析局部注射辛伐他汀对股骨髁骨小梁改建的影响，本实验是在以往实验基础上，进一步分析局部注射辛伐他汀对股骨髁骨小梁的影响，为将辛伐他汀应用于临床骨质疏松局部治疗进一步提供实验基础。实验研究结果表明，骨质疏松大鼠股骨髓腔内单次注射小剂量辛伐他汀(5 mg或10 mg)促进骨小梁改建，改善骨小梁三维结构，从而增加股骨骨密度及骨强度，有效预防骨质疏松骨折的发生。
作者这次实验研究结果表明，骨质疏松大鼠股骨髓腔内单次注射小剂量辛伐他汀(5 mg或10 mg)促进骨小梁改建，改善骨小梁三维结构，从而增加股骨骨密度及骨强度，有效预防骨质疏松骨折的发生。但仍有一些有意义的问题，如局部注射后最短起效时间是多少？最适剂量是多少？注射一次可以维持多久的疗效？在整体的骨质疏松环境中局部高骨量的远期转归如何等，这些问题正在进一步研究。总之，对易发生脆性骨折的疏松骨骼进行局部强化为治疗骨质疏松、预防脆性骨折提供了新的治疗策略，而辛伐他汀为此治疗提供了一种良好选择。