控释神经营养因子与细胞移植减少损伤脊髓的胶质瘢痕

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.014

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (42): 7427-7434.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.014

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控释神经营养因子与细胞移植减少损伤脊髓的胶质瘢痕

刘晓刚¹，邓宇斌²，蔡辉¹，张新鹏¹，马郁琳¹，魏可心¹

1北京市垂杨柳医院病理科，北京市 100022
2中山大学中山医学院病理学与病理生理学教研室，广东省广州市 510080

收稿日期:2013-03-19 修回日期:2013-04-12 出版日期:2013-10-15 发布日期:2013-10-31
作者简介:刘晓刚★，男，1978年生，山西省晋中市人，汉族，2005年中山大学毕业，硕士，主治医师，主要从事移植免疫与干细胞应用研究。 chinalark@163.com
基金资助:
北京市垂杨柳医院硕博基金(2010J06)*

Co-transplantation of controlled release glial cell line-derived neurotrophic factor and bone marrow mesenchymal stem cells-derived neuron-like cells reduces glial scars after spinal cord injury

Liu Xiao-gang¹, Deng Yu-bin², Cai Hui¹, Zhang Xin-peng¹, Ma Yu-lin¹, Wei Ke-xin¹

1Department of Pathology, Beijing Chuiyangliu Hospital, Beijing 100022, China
2Department of Pathology and Pathophysiology, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Received:2013-03-19 Revised:2013-04-12 Online:2013-10-15 Published:2013-10-31
About author:Liu Xiao-gang★, Master, Attending physician, Department of Pathology, Beijing Chuiyangliu Hospital, Beijing 100022, China chinalark@163.com
Supported by:
the Master’s and Doctoral Foundation of Beijing Chuiyangliu Hospital, No. 2010J06*

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期研究发现控释胶质细胞源性神经营养因子与骨髓间充质干细胞源神经元样细胞联合移植可有效促进猕猴脊髓损伤后运动功能和感觉功能的恢复。
目的：观察控释胶质细胞源性神经营养因子联合骨髓间充质干细胞源神经元样细胞移植抑制猴脊髓损伤后胶质瘢痕形成的作用是否优于单纯细胞移植。
方法：取12只恒河猴，采用改良Allen氏法制作急性重度脊髓损伤模型，随机数字表法分为3组，实验组以控释胶质细胞源性神经营养因子联合自体骨髓间充质干细胞源神经元样细胞移植修复，对照组以自体骨髓间充质干细胞源神经元样细胞移植修复，空白对照组以磷酸盐缓冲液修复。修复后5个月，取出脊髓组织制成石蜡标本，应用免疫组织化学染色显示胶质瘢痕的形态特征、构成特点及瘢痕中神经纤维的再生情况，检测胶质瘢痕面积及胶质纤维酸性蛋白染色的平均吸光度值。
结果与结论：脊髓损伤部位胶质瘢痕由混合性增生的星形胶质细胞和组织细胞构成。空白对照组脊髓胶质瘢痕累及范围广，星形胶质细胞增生显著，神经丝蛋白免疫组织化学染色阴性，胶质瘢痕面积、胶质纤维酸性蛋白染色平均吸光度值高于实验组与对照组(P < 0.05)；实验组、对照组脊髓胶质瘢痕累及范围较局限，神经丝蛋白免疫组织化学染色显示有少量神经纤维通过瘢痕区，并且实验组胶质瘢痕面积、胶质纤维酸性蛋白染色平均吸光度值低于对照组(P < 0.05)。结果表明，控释胶质细胞源性神经营养因子联合骨髓间充质干细胞源性神经元样细胞移植可更强抑制脊髓损伤后胶质瘢痕的形成。

关键词: 生物材料, 生物材料基础实验, 胶质瘢痕, 脊髓损伤, 控释胶质细胞源性神经营养因子, 间充质干细胞, 神经营养因子, 猕猴, 胶质纤维酸性蛋白, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have demonstrated that transplantation of controlled release glial cell line-derived neurotrophic factor and bone marrow mesenchymal stem cells-derived neuron-like cells can effectively promote the motor function and sensory function recovery of rhesus monkeys with spinal cord injury.
OBJECTIVE: To validate whether co-transplantation of controlled release glial cell line-derived neurotrophic factor and bone marrow mesenchymal stem cells-derived neuron-like cells exhibits better protective effects on spinal cord glial scar of rhesus monkeys with spinal cord injury than cell transplantation alone.
METHODS: Twelve rhesus monkeys were collected to prepare animal models of acute severe spinal cord injury using modified Allen’s method, and then randomly divided into three groups: experimental group, co-transplantation of controlled release glial cell line-derived neurotrophic factor and bone marrow mesenchymal stem cells-derived neuron-like cells; control group, simple transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells-derived neuron-like cells; blank control group, PBS. After 5 months, paraffin specimens of the spinal cord were made for detection of morphological and compositional characteristics of glial scar, regeneration of nerve fibers in the scar, glial scar area, and average absorbance of glial fibrillary acidic protein.
RESULTS AND CONCLUSION: Glial scar in the injured spinal cord was composed of astrocytes and histocytes. Less spinal cord glial scar area and lower absorbance value could be observed in the experimental and control groups as compared with the blank control group (P < 0.05). In addition, in the blank control group, neurofilament negative fibers could be observed in the glial scar, and astrocytes proliferated obviously. The experimental and control groups showed less fibers passed through the scar area. The glial scar area and average absorbance in the experimental group was lower than that in the control group (P< 0.05). These findings suggest that compared with simple transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells-derived neuron-like cells, co-transplantation of controlled release glial cell line-derived neurotrophic factor and bone marrow mesenchymal stem cells-derived neuron-like cells shows better protective effects spinal tissue structure after spinal cord injury, which may be one of mechanisms by which the number of glial scars is reduced to a greater extent.

Key words: spinal cord injuries, brain-derived neurotrophic factor, glial cell line-derived neurotrophic factor, cell transplantation

中图分类号:

R318

刘晓刚，邓宇斌，蔡辉，张新鹏，马郁琳，魏可心 . 控释神经营养因子与细胞移植减少损伤脊髓的胶质瘢痕[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(42): 7427-7434.

Liu Xiao-gang, Deng Yu-bin, Cai Hui, Zhang Xin-peng, Ma Yu-lin, Wei Ke-xin . Co-transplantation of controlled release glial cell line-derived neurotrophic factor and bone marrow mesenchymal stem cells-derived neuron-like cells reduces glial scars after spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(42): 7427-7434.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年12月在北京市垂杨柳医院病理科完成。

材料：

实验动物：健康3岁龄雄性恒河猴12只，体质量3.0-4.0 kg，由华南灵长类动物研究中心提供，许可证号：SCXK(粤)2004-0010。

控释神经营养因子与骨髓间充质干细胞源神经元样细胞移植可减少脊髓损伤后胶质瘢痕形成实验的主要试剂及仪器：

实验方法：

控释胶质细胞源性神经营养因子的制备：含2 μg胶质细胞源性神经营养因子的单甲氧基聚乙二醇聚乳酸嵌共聚体由中山大学高分子研究所采用双乳化工艺制备完成。

骨髓间充质干细胞的分离培养：将猴用盐酸氯胺酮注射液按10 mg/kg肌注麻醉后，俯卧于手术操作台上，四肢固定。选取髂前上嵴为穿刺部位，然后在该部位剪毛，皮肤消毒，铺无菌洞巾。12号骨穿针穿刺进入骨髓腔，用10 mL注射器抽取内含肝素120 U的生理盐水 1 mL，反复抽吸针管湿润注射器管壁，缓慢抽取骨髓约5 mL，同时适当振荡针管。将获取的骨髓转入离心管，1 000 r/min离心5 min，离心半径13.5 cm，弃上清及脂肪层，细胞沉淀用2倍体积的L-DMEM培养液充分混匀，用吸管轻轻叠加到密度为1.073 g/mL的Ficoll-Paque分离液上(细胞悬液与分离液体积比为2∶3)，2 000 r/min离心25 min，离心半径13.5 cm，小心吸取界面层的单核细胞，然后用L-DMEM培养液洗涤3次。细胞计数，用含体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM完全培养液调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，接种于25 mL培养瓶，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。3 d或4 d首次换液，以后每隔2 d或3 d换液1次。当原代细胞融合度达80%时，用含1 mmol/L EDTA的0.25%胰酶消化液消化，1 000 r/min离心5 min，离心半径 13.5 cm，弃去上清，细胞沉淀按1∶2传代。待第1代细胞融合度达80%时，按上述方法1∶2传代。利用流式细胞仪检测其表型，并对其进行多向分化能力检测，证明其干细胞属性。诱导时去除原培养液，PBS洗2次，加入成神经诱导液(含隐丹参酮20 mg/L的无血清L-DMEM培养基)。

实验分组与脊髓损伤模型制备^[11-12]：将12只恒河猴按随机数字表法分为3组，每组4只，实验组脊髓损伤后给予控释神经营养因子+骨髓间充质干细胞源性神经元样细胞联合移植，对照组脊髓损伤后给予骨髓间充质干细胞源性神经元样细胞移植，空白对照组脊髓损伤后给予磷酸盐缓冲液。

所有实验动物按照改良Allen氏法造成急性重度脊髓损伤模型：盐酸氯胺酮注射液10 mg/kg与安定注射液0.5 mg/kg复合麻醉，肌肉注射，实验动物采用俯卧位，进行常规消毒铺巾后，手术切除实验动物T₈棘突及椎板，对椎板修剪进行修剪，充分暴露脊髓的硬膜，然后安装脊髓致伤器，玻璃套管下端呈圆弧形，与脊髓表面吻合良好，金属棒作自由落体运动时与套管间无摩擦，致伤能量500 g×12 cm。术后给予头孢拉定预防感染，50 mg/kg肌注，2次/d。脊髓休克期间(持续约1周)给予人工排尿、排便，2次/d。电生理检测显示动物双下肢运动与感觉功能消失为造模成功。

分组给药：脊髓损伤后第10天，重新打开原有伤口，暴露损伤的脊髓，消化计数用隐丹参酮预诱导1.5 h的猴自体骨髓间充质干细胞。实验组将3.0×10⁶/kg自体骨髓间充质干细胞与含2 μg胶质细胞源性神经营养因子的单甲氧基聚乙二醇聚乳酸嵌共聚体用200 μL磷酸盐缓冲液制成悬液，局部注射到脊髓损伤部位；对照组给予同等细胞量的磷酸盐缓冲液悬液；空白对照组给予同等剂量的磷酸盐缓冲溶液。

免疫组织化学染色：修复后5个月，处死动物，暴露脊髓，将脊髓损伤节段及远近端正常脊髓组织取出，体积分数10%中性甲醛固定12 h，切成厚2 mm组织块制成石蜡标本。每个石蜡标本连续制片5张，切片厚4 μm，每张切片均进入实验分析。采用Strept-Avidin-Biotin标记方法，分别进行胶质纤维酸性蛋白(1∶400)、巨噬细胞(CD68，工作液)、少突胶质细胞转录因子2、CD11b(1∶200)、神经丝蛋白(1∶200)染色。阳性对照分别选用病理科存档的阳性对照组脑组织标本，阴性对照以PBS代替一抗。染色操作过程及注意事项严格参照试剂盒说明书。切片脱蜡入水，PBS冲洗3次，每次 3 min。CD68、少突胶质细胞转录因子2抗原高压修复 2 min。每张切片滴加1滴过氧化物酶阻断溶液(试剂1)，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次5 min。除去PBS，每张切片加1滴正常非免疫动物血清(试剂2)，室温下孵育10 min。除去血清，每张切片滴加1滴第一抗体胶质纤维酸性蛋白/ CD68/少突胶质细胞转录因子2/CD11b/神经丝蛋白，室温下孵育60 min。PBS冲洗3次，每次5 min。冲去PBS，每张切片加1滴生物素标记的第二抗体(试剂3)，室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次5 min。(胶质纤维酸性蛋白/少突胶质细胞转录因子2/CD11b染色)除去PBS，每张切片加1滴链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂7)，室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次5 min。除去PBS，每张切片加2滴新鲜配制的AEC溶液，显微镜下观察5-10 min，阳性染色为红色(AEC染色液配制方法：于试管中滴加0.85 mL蒸馏水，加试剂8A、8B、8C各50 μL充分混合，即可用)。PBS冲洗，苏木精(试剂9)复染，PBS冲洗返蓝。直接用水性封固剂(试剂10)封固。(CD68/神经丝蛋白染色)除去PBS，每张切片加1滴链霉菌抗生物素-碱性磷酸酶溶液(试剂4)，室温下孵育10 min。PBS洗3次，每次5 min。除去PBS，每张切片加2滴BCIP/NBT显色液(试剂5)，显微镜下观察10- 30 min，阳性显色为蓝黑色。PBS冲洗，苏木精(试剂9)复染，PBS冲液返蓝。直接用水性封片剂(试剂10)封固。

脊髓胶质瘢痕面积及免疫组织化学染色吸光度值的测算：应用全自动图像分析系统对切片脊髓损伤部位胶质瘢痕面积、胶质纤维酸性蛋白免疫组化阳性面积及其平均吸光度值进行测算，以5张切片胶质瘢痕面积的均值及胶质纤维酸性蛋白阳性面积的均值作为该标本的比较值；胶质纤维酸性蛋白平均吸光度值：每张切片选取5个非重叠视野的均值作为该标本胶质纤维酸性蛋白的平均吸光度值, 观察倍数10×10，视野面积 177 655.5 μm²。

主要观察指标：①各组实验动物脊髓损伤部位胶质瘢痕构成的特点。②各组胶质瘢痕面积的测量与比较。③各组胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学染色结果平均各组值的测量与比较。

统计学分析：由第四作者应用SPSS 11.0软件进行统计处理，脊髓损伤部位胶质瘢痕面积、胶质纤维酸性蛋白阳性面积以及胶质纤维酸性蛋白平均各组值组间比较行单因素方差分析，两组间比较采用单因素分析的两两比较。结果以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脊髓损伤后，由于原发性及继发性损伤，局部组织发生变性、坏死，胶质瘢痕形成是其修复的重要表现形式。胶质瘢痕的形成是多种细胞参与的在复杂信号传导通路调控下过度激活、增殖的病理过程，星形胶质细胞增生是胶质瘢痕形成的细胞基础，而胶质纤维酸性蛋白表达上调是胶质瘢痕形成的重要物质表现形式^[16-20]。星形胶质细胞在中枢神经系统内数量众多，具有合成和分泌多种神经营养因子和细胞因子的功能，对神经元及轴突具有支持和营养作用，对神经系统的稳定性也具有一定的调节作用^[21-25]。当脊髓受到损伤时，静止期的星形胶质细胞发生活化，表现为细胞体积肥大，细胞数量增加，细胞间互相连接、融合，形成致密的网状结构，并伴有胶质纤维酸性蛋白表达上调。胶质纤维酸性蛋白是星形胶质细胞表达的中间丝蛋白，能够反映星形胶质细胞的增生状态。

胶质瘢痕有利于保持脊髓形态的完整性，然而却改变了脊髓正常的生理解剖结构，并且能够产生一系列抑制因子，其所产生的物理性及化学性屏障严重影响神经元活性、轴突再生及髓鞘再生，从而严重影响到神经传导通路的正常功能^[26-29]，是脊髓损伤后神经功能难以恢复的重要原因之一。因此，如何有效地拮抗星形胶质细胞的过度增生，下调胶质纤维酸性蛋白的表达是当前促进脊髓功能重建的一个研究热点。

骨髓间充质干细胞是骨髓中存在的一类非造血成体干细胞，其生理作用可能主要是维持造血微环境的稳定性和调节造血功能。骨髓间充质干细胞的分离与鉴定技术已相当成熟，其获得相对容易、增殖能力强、遗传稳定性好、免疫原性弱^[30-35]，并且可塑性强，可以根据需要被诱导分化为多种细胞类型^[36-42]。骨髓间充质干细胞已被证明可以分化为神经细胞^[43-48]，并且具有分泌多种细胞因子及神经营养因子的功能^[49-51]，与生物材料也具有良好的相容性^[52-53]。研究表明，骨髓间充质干细胞移植能有效促进损伤脊髓功能的恢复^[54-58]。因而，骨髓间充质干细胞在神经系统损伤性疾病治疗领域是一种理想的种子细胞。前期研究表明，猴骨髓间充质干细胞可被中药成分隐丹参酮有效诱导分化为神经前体细胞，并且可以保持较高的活性。在实验采用诱导后的细胞进行移植，既可以避免骨髓间充质干细胞植入体内分化方向的不确定性，以及形成肿瘤的风险性，而且有利于移植的细胞在体内继续分化为治疗所需要的神经细胞，从而保证更好地促进损伤脊髓组织结构的修复。

胶质细胞源性神经营养因子是一种具有广谱生物学活性的神经营养因子，属转化生长因子β超家族成员，对多巴胺能神经元、运动神经元、感觉神经元等多种神经元均具有强大的营养作用，因此有希望对中枢神经系统损伤性疾病的治疗发挥作用。研究表明，胶质细胞源性神经营养因子具有促进受损神经元存活、促进轴突生长、修复神经传导通路等功能，在神经修复过程中发挥了重要的作用^[59-61]。虽然胶质细胞源性神经营养因子受体在中枢神经系统内分布广泛，但胶质细胞源性神经营养因子作为一种大分子蛋白质，不易通过血脑屏障，使其在临床的应用受到明显的限制，因而如何有效利用胶质细胞源性神经营养因子值得进一步研究。组织内直接注射法，浓度不易控制，而且不易维持；利用外源性病毒基因导入受体细胞再行移植，可能存在的长期风险性不易评估，而且外源基因的靶向性等问题尚需解决。

有研究探讨骨髓间质干细胞源性神经元样细胞与胶质细胞源性神经营养因子控释生物材料联合移植治疗猴急性脊髓损伤过程中，对后索结构修复与功能恢复的影响。实验选择雄性恒河猴8只，随机分为2组，每组4只。制作猴脊髓损伤模型后损伤治疗组植入3.0×10⁶/kg神经元样细胞与含2 μg胶质细胞源性神经营养因子的单甲氧基聚乙二醇聚乳酸嵌共聚体用200μL磷酸盐缓冲液制成悬液，损伤对照组给予等体积磷酸盐缓冲液；各组动物分别于术前和治疗后四五个月进行皮质体感诱发电位检测；处死动物前3周将True Blue注射到脊髓损伤部位下界下部后索部位，制备石蜡切片应用苏木精-伊红染色观察脊髓损伤处脊髓后角的组织形态学改变，应用甘氨酸银浸镀法染色观察后索结构。结果显示：①两组动物皮质体感诱发电位结果：脊髓损伤后，皮质体感诱发电位信号消失，治疗后四五个月与治疗前比较，损伤治疗组潜伏期无明显延长。损伤治疗组波幅降低度明显低于损伤对照组[(3.78±1.32)，(9.85±0.84) μV，t=-11.194，P < 0.01]。②病理结果表明，损伤治疗组后角轻度胶质增生；损伤对照组后角神经元少见，胶质浸润。③脊髓后索神经纤维密度和积分吸光度值：损伤治疗组后索神经纤维密度明显高于损伤对照组 [(1 338±276)，(574±168)个/视野，t=4.734，P < 0.01]；积分吸光度值高于损伤对照组(9 966.73±3 753.78， 4 323.25±1 040.92，t=2.897，P < 0.05)。④荧光显微镜下，损伤治疗组大脑皮质躯体感觉区(对侧)存在蓝色荧光阳性细胞，损伤对照组无此现象。结果说明：①注射骨髓间充质神经元样细胞与控释胶质细胞源性神经营养因子的恒河猴皮质体感诱发电位的潜伏期基本正常，波幅降低，表明其本体感觉获得了一定程度恢复，同时说明波幅的变化在判断脊髓损伤方面比潜伏期更敏感。②后角神经元明显增多，说明骨髓间充质神经元样细胞与控释胶质细胞源性神经营养因子可以促进脊髓损伤猕猴后索组织结构的修复。

Mahoney等^[62]利用可降解生物材料聚乙二醇聚乳酸发展了一项应用神经营养因子的新技术，并证实了其有效性。单甲氧基聚乙二醇聚乳酸嵌共聚体是一种与组织相容性较好的复合生物材料，由于其能形成胶束状结构的微球，使得其在更为温和的条件下比聚乳酸和聚乙二醇聚乳酸更容易形成粒径更小的微球。实验将这种材料作为胶质细胞源性神经营养因子的载体移植到脊髓局部，发现其也能获得很好降解。单甲氧基聚乙二醇聚乳酸嵌共聚体在体内的降解是个复杂过程，当单甲氧基聚乙二醇聚乳酸嵌共聚体植入脊髓后，首先发生的是材料吸水，吸水过程同时有利于缓解脊髓损伤区域的水肿程度，渗入材料的水分会在材料表面和内部之间形成一个梯度，由于水分子的扩散速度比酯键断裂速度快得多，因而这种梯度会在一定时间内消失。随着生物材料的降解，胶质细胞源性神经营养因子可以持续的释放入损伤部位微环境中，为脊髓损伤修复提供支持作用。在实验中实验组与对照组比较能够更加有效减少脊髓损伤后胶质瘢痕胶质纤维酸性蛋白阳性面积，下调胶质纤维酸性蛋白的表达水平，结果表明控释胶质细胞源性神经营养因子与细胞联合移植修复脊髓损伤具有良好的协同效应。关于微粒在体内降解的速率及胶质细胞源性神经营养因子活性等相关问题的精确控制值得进一步深入研究。

在实验中免疫组织化学染色显示胶质瘢痕胶质纤维酸性蛋白及CD68阳性，Oligo-2及CD11b阴性，表明胶质瘢痕主要由星形胶质细胞和组织细胞构成，而不含有少突胶质细胞及小胶质细胞成分，后者有可能在胶质瘢痕形成的早期阶段发挥作用，而与后期稳定性胶质瘢痕的形成无关。空白对照组瘢痕面积大，胶质纤维酸性蛋白阳性面积大、吸光度值高，瘢痕区无神经纤维通过；两干预组胶质瘢痕面积明显缩小，胶质纤维酸性蛋白阳性面积及吸光度值也明显缩小，瘢痕区可见少量神经丝蛋白阳性神经纤维通过。实验结果表明干预可有效抑制星形胶质细胞的过度增生，下调胶质纤维酸性蛋白的表达，并且可以促进轴突再生，其机制可能与移植体可以填充损伤缺损，压缩星形胶质细胞增生空间、抑制星形胶质细胞相互接触产生的级联反应有关，在分子机制上可能与P21蛋白的调节作用有关^[63]；并且联合干预效果更好，表明神经营养因子在抑制神经胶质瘢痕形成方面具有良好的协同效应，各组标本病理形态特点与脊髓功能恢复的程度具有一致性。

实验中所采用的实验动物为遗传背景与人类较为接近恒河猴，其脊髓损伤后的病理变化过程及接受干预治疗过程更接近人类的变化过程，因而具有很高程度的模拟性，具有较高的研究意义。

总之，能够抑制胶质瘢痕形成的干预措施对于脊髓神经功能康复是大有益处的，随着研究深入，组织工程与干细胞技术在这一领域有可能获得新的突破，从而为中枢神经系统损伤性疾病的康复带来希望。

控释神经营养因子与细胞移植减少损伤脊髓的胶质瘢痕

Co-transplantation of controlled release glial cell line-derived neurotrophic factor and bone marrow mesenchymal stem cells-derived neuron-like cells reduces glial scars after spinal cord injury

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