磁性壳聚糖微球的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.012

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (42): 7414-7419.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.012

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磁性壳聚糖微球的生物相容性

王子妤¹，董菊¹，张东生²

1南京中医药大学基础医学院，江苏省南京市 210023
2东南大学医学院，江苏省南京市 210009

收稿日期:2013-03-09 修回日期:2013-03-28 出版日期:2013-10-15 发布日期:2013-10-31
作者简介:王子妤☆，女，1979年生，汉族，江苏省无锡市人， 2012年东南大学医学院毕业，讲师，博士，主要从事纳米药物治疗肿瘤方面的研究。 wangziyu717@163.com
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81201187)*，南京中医药大学基础青年科技创新基金资助项目(10JCQN08)*

Biocompatibility of magnetic chitosan microspheres

Wang Zi-yu¹, Dong Ju¹, Zhang Dong-sheng²

1School of Basic Medical Science, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China
2School of Medical Science, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China

Received:2013-03-09 Revised:2013-03-28 Online:2013-10-15 Published:2013-10-31
About author:Wang Zi-yu, M.D., Lecturer, School of Basic Medical Science, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China wangziyu717@163.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81201187*; Basic Youth Science and Technology Innovation Fund Project of Nanjing University of Chinese Medicine, No. 10JCQN08*

摘要/Abstract

摘要：

背景：采用壳聚糖对磁性氧化铁纳米颗粒表面进行改性，一方面可改善磁性纳米氧化铁颗粒的团聚性，增加其稳定性，另一方面将来可用于肿瘤热疗及基因治疗。
目的：制备将来可用于肿瘤热疗及基因治疗的磁性壳聚糖微球，评价其生物相容性。
方法：采用改良的化学沉淀法制备磁性氧化铁纳米颗粒。采用超声乳化法将壳聚糖加入到磁性氧化铁纳米颗粒中制备磁性壳聚糖微球，进行以下实验：①MTT实验检测磁性壳聚糖微球浸提液的细胞毒性：分别以1640培养液、聚丙烯酰胺单体溶液、100%，75%，50%，25%的磁性壳聚糖微球浸提液培养L-929细胞。②溶血实验：在兔抗凝血中分别加入磁性壳聚糖微球浸提液、生理盐水及蒸馏水。③微核实验：在昆明小鼠腹腔分别注射含氧化铁磁流体5，3.75，2.5，1.25 g/kg的磁性壳聚糖微球混悬液、环磷酰胺及生理盐水。
结果与结论：磁性壳聚糖微球粒径200-300 nm，分散效果有所提高。不同浓度的磁性壳聚糖微球浸提液对L-929 细胞毒性为1级，属对细胞无毒性范畴。磁性壳聚糖微球浸提液的溶血率为0.69%，小于5%，符合医用材料的溶血实验要求。磁性壳聚糖微球混悬液未导致细胞DNA断裂和非整倍体化，未导致微核产生的遗传毒理作用，材料无致畸或致突变作用，因此磁性壳聚糖微球具有良好的生物相容性。

关键词: 生物材料, 材料生物相容性, 细胞外基质材料, 磁流体, 壳聚糖, 磁性壳聚糖微球, 生物相容性, L-929细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Chitosan modification for magnetic iron oxide nanoparticles can improve the agglomeration and stability of magnetic iron oxide nanoparticles, and in addition, it can be used for tumor hyperthermia and gene therapy in the future.
OBJECTIVE: To explore the biocompatibility of magnetic chitosan microspheres which have the potential application in tumor hyperthermia and gene therapy.
METHODS: Magnetic iron oxide nanoparticles were prepared using the modified chemical precipitation. Phacoemulsification method was used to add chitosan into magnetic iron oxide nanoparticles in the preparation of magnetic chitosan microspheres. Then, the following tests were performed. (1) Cytotoxicity test: L-929 cells were cultured in 1640 medium, polyacrylamide monomer solution, 100%, 75%, 50%, 25% of magnetic chitosan microsphere extracts. (2) Hemolysis test: Magnetic chitosan microspheres leaching solution, saline and distilled water were added. (3) Micronucleus test: Kunming mice were intraperitoneally injected with magnetic chitosan microspheres suspension containing 5, 3.75, 2.5, 1.25 g/kg iron oxide magnetic fluid, cyclophosphamide and saline, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Magnetic chitosan microspheres of 200-300 nm in diameter had an increased dispersion effect. The result of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay showed that the toxicity of the material on L-929 cell lines belonged to no cytotoxicity. In the hemolysis test, the hemolysis rate of magnetic chitosan microspheres was 0.69% far less than 5%. In the micronucleus test, magnetic chitosan microspheres suspension did not cause DNA fragmentation and aneuploidy, and did not result in genetic toxicological effects produced by micronuclei. The magnetic chitosan microspheres did not appear with cacogenesis and mutagenesis. From the results, magnetic chitosan microspheres are a kind of high biocompatibility material.

Key words: microspheres, chitosan, biocompatible materials, bone matrix

中图分类号:

R318

王子妤，董菊，张东生 . 磁性壳聚糖微球的生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(42): 7414-7419.

Wang Zi-yu, Dong Ju, Zhang Dong-sheng . Biocompatibility of magnetic chitosan microspheres[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(42): 7414-7419.

图/表（结果） 4

参考文献

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引言

材料方法

设计：完全随机分组实验。

时间及地点：于2010年3月至2011年12月在南京中医药大学病理教研室实验室、东南大学电镜室、东南大学江苏省生物材料和器件重点实验室完成。

材料：

实验动物：4-6周龄昆明小鼠，普通级，雌雄不拘，体质量25-30 g，购自南京中医药大学实验动物中心。

磁性壳聚糖微球生物相容性实验的细胞株、试剂及仪器：

实验方法：

磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法：磁性氧化铁纳米颗粒(Fe₃O₄)的制备参照文献[6]采用改良化学共沉淀法得到的。其基本反应原理为：Fe²⁺+2Fe³⁺+8OH^–→Fe₃O₄+ 4H₂O，步骤如下：按Fe³⁺︰Fe²⁺=5︰3的比例分别加入100 mL 0.1 mol/L的FeCl₃和60 mL 0.1 mol/L的FeCl₂ 溶液于烧瓶中，在N₂保护和磁力搅拌下滴加1.5 mol/L 的NH₄OH，至反应液的pH值为9，沉淀物由红褐色逐渐转变为黑色，继续搅拌30 min后停止。于80 ℃水浴恒温30 min进行熟化，然后用强磁铁吸住烧瓶底部，倾去上层废液，用去离子水反复冲洗至溶液pH值为7。取出少量Fe₃O₄纳米磁性粒子，制得电镜样品，在H-600型透射电子显微镜下观察，其余样品真空干燥后备用。

Fe₃O₄磁性纳米粒表面修饰壳聚糖：参考文献[7-8]采用超声乳化法制备，将 0.2 g壳聚糖加入到 1%乙酸水溶液中，制成质量分数为1%的壳聚糖溶液，充分溶解后加入一定量的经超声分散的Fe₃O₄磁流体中。室温下搅拌4 h，超声分散10 min，磁分离法洗涤四五遍，得到包覆改性后的磁性壳聚糖纳米微球。取少量样品于透射电子显微镜下观察，其余样品4 ℃保存。

MTT法检测材料浸提液的细胞毒性：磁性壳聚糖微球经低温间歇灭菌法(60 ℃10 h，37 ℃12 h，连续3次)处理后，按 0.1 g/mL的比例用RPMI1640培养基浸提，浸提条件为37 ℃，72 h，以1 200 r/ min离心5 min，吸取上清，微孔滤膜过滤，即得100%浸提液，实验时以RPMI1640培养基稀释至所需浓度。

常规培养L-929细胞，按6×10⁷ L^-1细胞浓度接种于96孔培养板，培养24 h后弃去原液，分别加入终浓度分别为100%，75%，50%，25%的材料浸提液，阴性对照为1640培养液，阳性对照为0.7%的聚丙烯酰胺单体溶液，每组设复孔8个，培养72 h后，每孔加入20 μL MTT，继续培养4 h，弃去各孔内液体，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min后，在免疫酶标仪上测定492 nm处的吸光度(A)值。按公式计算细胞相对增殖率：

将细胞相对增殖率值转换成6级，实验结果为0或1级则为合格，实验结果为2级结合细胞形态综合评价，实验结果为3-5级则为不合格。

细胞相对增殖率与毒性分级转换：

溶血实验：抽取新西兰兔(南京金陵种兔场)血10 mL，加入20 g/L草酸钾0.5 mL，按每8 mL加入10 mL生理盐水得到稀释的新鲜抗凝兔血；将0.2 mL兔血稀释液加入10 mL蒸馏水中。将磁性壳聚糖纳米微球用蒸馏水洗涤2遍，烘干，按0.1 g/mL用生理盐水浸提；生理盐水作为阴性对照，蒸馏水作为阳性对照；每组3支试管。将装有待测材料浸提液、生理盐水及蒸馏水各10 mL的所有试管放入37 ℃水浴中，30 min后取出，加入稀释抗凝兔血0.2 mL，轻轻摇匀，再放入37 ℃水浴中继续保温 60 min，将各管溶液置于干燥的离心管中离心，自每管取上清液移入比色皿内，在分光光度计上测取各自在540 nm处的A值。计算溶血率，若溶血率<5%，说明材料无溶血作用，符合医用材料的溶血实验要求。

微核实验：取昆明小鼠60只，分为6组，每组10只，将实验用磁性壳聚糖纳米微球经低温间歇灭菌后用无菌生理盐水配成混悬液，其中含Fe₃O₄磁流体浓度分为5，3.75，2.5，1.25 g/kg，阳性对照采用环磷酰胺 40 mg/kg腹腔注射，阴性对照采用生理盐水腹腔注射。共注射2次，其中间隔24 h，第2次给受试物后6 h，处死动物，取股骨骨髓液涂片，晾干后甲醇固定，Giemsa染液染色后观察。每只小鼠共计数10 000个嗜多染红细胞，并统计有微核的嗜多染红细胞，结果以‰表示，用泊松分布检测各组间有无统计学差异。

主要观察指标：①磁性壳聚糖微球表面形貌。②磁性壳聚糖微球的细胞毒性、溶血率及骨髓微核形成率。

统计学分析：所有资料采用SPSS 11.0 软件分析。

讨论

磁性氧化铁(Fe₃O₄，γ-Fe₂O₃)纳米粒子目前在生物分离分析、分子影像、肿瘤热疗及抗肿瘤靶向药物载体等各个方面的应用均可见大量文献报道，显示出良好的前景^[9]。但由于氧化铁纳米颗粒非常细小，具有很大的比表面积和大量的悬空键，同时颗粒之间由于磁性吸引力和范德华力分散在载液中非常容易产生团聚而出现沉降现象，因此研究者们均致力于研究如何提高改进制备技术，减少磁性纳米颗粒的团聚性，增加其稳定性。有研究发现用壳聚糖对γ-Fe₂O₃颗粒表面进行改性，将其制备成磁性壳聚糖复合微球则能有效减少聚集，形成稳定分散的磁流体^[7]。壳聚糖在γ-Fe₂O₃上修饰后，此材料在双蒸馏水和含体积分数10% 新生牛血清的RPMI1640 细胞培养液中具有良好的稳定性，适合下一步生物医学应用的应用要求。季业等^[8]实验结果同样证实壳聚糖分子进行表面改性后的Fe₃O₄颗粒可有效减少颗粒团聚现象。此外，由于壳聚糖上游离氨基质子化使得壳聚糖分子带正电荷，可以与带负电荷的DNA以静电作用结合在一起形成壳聚糖-DNA复合物，并使得DNA不易被核酸酶降解，可以与带负电荷的细胞表面相结合，从而有效地被细胞摄取，介导基因转移，而以纳米颗粒为基因转移载体的研究也是近年来的热门课题，故磁性壳聚糖微球成为极具应用前景的新型基因载体系统^[10-11]。例如有研究探讨磁性壳聚糖纳米载体对血管平滑肌细胞的毒性及介导内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因对受损血管平滑肌细胞的转染效率、表达及对细胞增生的影响，实验采用原位共沉淀法制备磁性壳聚糖并耦合内皮型一氧化氮合酶质粒，MTT法检测磁聚糖对血管平滑肌细胞生长的毒性；分别以重组腺病毒表达载体(AdCMV-eNOS)、磁性壳聚糖-内皮型一氧化氮合酶和磁性壳聚糖空载体在外加磁场下转染受损血管平滑肌细胞，免疫荧光染色及RT-PCR测定内皮型一氧化氮合酶表达，流式细胞术检测转染效率及血管平滑肌细胞周期和凋亡情况。结果显示在质量浓度低于20 g/L时，磁性壳聚糖对血管平滑肌细胞的生长无明显毒副作用；磁性壳聚糖-内皮型一氧化氮合酶组转染效率(58.7±3.6)%较AdCMV-eNOS组(78.1±2.5)%低，但两组均检测到内皮型一氧化氮合酶 mRNA和蛋白表达，且两组受损血管平滑肌细胞G₀/G₁期细胞较磁性壳聚糖空载体组明显增多(P < 0.01)，S/G₂-M期细胞减少(P < 0.01)，3组的细胞凋亡差异无显著性意义(P > 0.05)，表明正常浓度的磁性壳聚糖对血管平滑肌细胞生长无抑制作用，该载体能成功介导内皮型一氧化氮合酶基因的转染，延缓受损后血管平滑肌细胞增生周期。

生物相容性是指任何一种外源性物质，包括天然材料、治疗用的外源性细胞、植入的器官、人工材料的植入体或纳米粒子，为治疗目的植入或通过某种方式进入生物体，或与生物组织共存时，对生物体和生物组织造成损伤，或引起生物体、生物组织发生反应的能力和性质，和(或)生物体容许这种材料在体内存在及与这种材料的相互作用的能力和性质。磁性氧化铁纳米粒子及其生物相容性已有多篇文献报道，均认为其是一种基本无毒，具备良好生物相容性的材料^[12-15]。颜士岩等^[12]研究将要用于肿瘤细胞内热疗的自制纳米级Fe₂O₃磁性粒子的生物相容性。实验采用MTT法评价其体外细胞毒性，溶血试验评价其有无溶血作用，小鼠腹腔注射其无菌生理盐水混悬液以测定其LD50，微核试验评价其有无致畸、致突变作用等。结果显示该材料对L929细胞毒性为0或1级；无溶血作用；昆明小鼠腹腔注射该材料混悬液1 mL，其LD50为5.45 g/kg；微核实验结果表明无致畸、致突变作用。结果说明就目前所取得的实验结果来看可认为该材料是一种具有良好生物相容性的材料，对于肿瘤热疗可能具有广阔的应用前景。然而用壳聚糖对磁性氧化铁纳米颗粒表面进行改性，将其制备成磁性壳聚糖复合微球后是否会改变其生物相容性，实验从材料的细胞相容性、血液相容性和组织相容性3个方面，运用MTT实验、溶血实验和微核实验3种实验方法来评价壳磁性聚糖纳米微球的生物相容性。

MTT实验是大部分磁性介质生物相容性评价工作采用的基本实验项目。它是一种比较准确、快速和简便、可作定量评价的常用方法，现已被广泛应用于医用材料的生物学评价^[16]。实验将磁性壳聚糖微球浸提液作了MTT实验，结果显示不同浓度的磁性壳聚糖微球浸提液对于细胞增殖均无明显影响，细胞毒性分级为1级，阴性对照组和阳性对照组对细胞的毒性分别为0级和4级，说明实验体系稳定，这种评价方法是较合理可靠的，从而认为磁性壳聚糖微球体外实验无细胞毒性作用。

磁性壳聚糖复合微球将来若用于肿瘤治疗时，将被注射到患者体内，则不可避免地会接触到血液成分，尤其是在肿瘤内部，血管的畸形发育将增加材料进入血管的机会，因此有必要对其血液相容性进行评价。体外溶血实验是鉴定血液相容性最基本方法之一，它不仅可以评价样品的体外溶血性，还可以敏感地提示样品的毒性。实验通过体外溶血实验发现壳聚糖磁性纳米微球的溶血率为0.69%，小于医用材料无溶血性所要求的5 %，该结果说明壳聚糖磁性纳米微球不会导致溶血，有较高的生物安全性。

遗传毒性和致癌试验是生物材料中最复杂和最麻烦的问题，其中微核实验是反映染色体损伤的重要实验方法之一，是一种检测材料致畸致突变作用的方法，能够简便、快速地检测样品的短期遗传毒性。微核是指细胞浆中独立于细胞核的核小体，主要由外界损害因素作用细胞后，导致细胞染色体丢失或断裂，从而在胞浆中形成1个或数个小核。实验结果示各组材料对小鼠骨髓微核形成率与阴性对照组相比差异无显著性意义 (P > 0.05)，但与采用环磷酰胺腹腔注射的阳性对照组微核发生率相比较差异有显著性意义(P < 0.05)，证明其没有导致细胞DNA断裂和非整倍体化从而导致微核产生的遗传毒理作用，故可认为该材料无致畸或致突变作用。

近年来，多种纳米磁性材料生物相容性均接受了不同程度的评价研究，有了更多新的实验方法和检测指标，使生物相容性研究不断深入。从实验结果来看，壳聚糖磁性微球是一种基本无毒，具有良好的生物相容性的材料，适合将来进一步的肿瘤热疗及基因治疗等应用。但是，应用纳米材料治疗肿瘤还是一种崭新的方法，材料的制备仍然不是很完善，存在一定的问题，例如磁性纳米材料的团聚问题、纯度问题、粒径分布不均匀问题等，这些也都会影响到生物相容性的研究结果，这些问题还有待解决^[17-18]。此外目前所有的评价尚缺乏一个统一的标准，不同方法之间的结果不具有可比性，这些都还需要科研工作者继续进行大量的系统研究，为其将来的临床应用提供更加详尽的实验依据。

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磁性氧化铁（Fe₃O₄，γ-Fe₂O₃）纳米粒子目前在生物分离分析、分子影像、肿瘤热疗及抗肿瘤靶向药物载体等各个方面的应用均可见大量文献报道，显示出良好的前景。但由于氧化铁纳米颗粒非常细小，具有很大的比表面积和大量的悬空键，同时颗粒之间由于磁性吸引力和范德华力分散在载液中非常容易产生团聚而出现沉降现象，因此研究者们均致力于研究如何提高改进制备技术，减少磁性纳米颗粒的团聚性，增加其稳定性。有研究发现用壳聚糖对γ-Fe₂O₃颗粒表面进行改性，将其制备成磁性壳聚糖复合微球则能有效减少聚集，形成稳定分散的磁流体。壳聚糖在γ-Fe₂O₃上修饰后，此材料在双蒸馏水和含体积分数10% 新生牛血清的RPMI1640 细胞培养液中具有良好的稳定性，适合下一步生物医学应用的应用要求。季业等实验结果同样证实壳聚糖分子进行表面改性后的Fe₃O₄颗粒可有效减少颗粒团聚现象。此外，由于壳聚糖上游离氨基质子化使得壳聚糖分子带正电荷，可以与带负电荷的DNA以静电作用结合在一起形成壳聚糖-DNA复合物，并使得DNA不易被核酸酶降解，可以与带负电荷的细胞表面相结合，从而有效地被细胞摄取，介导基因转移，而以纳米颗粒为基因转移载体的研究也是近年来的热门课题，故磁性壳聚糖微球成为极具应用前景的新型基因载体系统。

近年来，多种纳米磁性材料生物相容性均接受了不同程度的评价研究，有了更多新的实验方法和检测指标，使生物相容性研究不断深入。从实验结果来看，壳聚糖磁性微球是一种基本无毒，具有良好的生物相容性的材料，适合将来进一步的肿瘤热疗及基因治疗等应用。但是，应用纳米材料治疗肿瘤还是一种崭新的方法，材料的制备仍然不是很完善，存在一定的问题，例如磁性纳米材料的团聚问题、纯度问题、粒径分布不均匀问题等，这些也都会影响到生物相容性的研究结果，这些问题还有待解决。此外目前所有的评价尚缺乏一个统一的标准，不同方法之间的结果不具有可比性，这些都还需要科研工作者继续进行大量的系统研究，为其将来的临床应用提供更加详尽的实验依据。

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