雌激素受体β基因沉默对成骨样MG63细胞骨保护素和RANKL表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.41.002

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (41): 7188-7198.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.41.002

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雌激素受体β基因沉默对成骨样MG63细胞骨保护素和RANKL表达的影响

王昱翔，张宏其，郭超峰，唐明星，刘少华，邓盎，高琪乐，邓展生，陈静，刘金洋，吴建煌

中南大学湘雅医院脊柱外科，湖南省长沙市 410008

收稿日期:2013-05-10 修回日期:2013-07-09 出版日期:2013-10-08 发布日期:2013-11-01
通讯作者: 张宏其，博士，教授，主任医师，博导，中南大学湘雅医院脊柱外科，湖南省长沙市 410008 zhq9996@163.com
作者简介:王昱翔☆，男，1982年生，湖南省永州市人，汉族，2011年中南大学毕业，博士，医师，主要从事脊柱外科临床与基础研究。wangyuxiang628@hotmail.com
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81271940)*；湖南省自然科学基金项目(08JJ3057)*；湖南省科技厅科技计划一般项目(08FJ3171)*；中南大学自由探索计划(2012QNZT122)*；湖南省自然科学基金重点项目(12JJ2043)*

Silenced estrogen receptor beta affects the expressions of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand in osteoblastic MG63 cells

Wang Yu-xiang, Zhang Hong-qi, Guo Chao-feng, Tang Ming-xing, Liu Shao-hua, Deng Ang, Gao Qi-le, Deng Zhan-sheng, Chen Jing, Liu Jin-yang, Wu Jian-huang

Department of Spine Surgery, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China

Received:2013-05-10 Revised:2013-07-09 Online:2013-10-08 Published:2013-11-01
Contact: Zhang Hong-qi, M.D., Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Spine Surgery, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China zhq9996@163.com
About author:Wang Yu-xiang☆, M.D., Physician, Department of Spine Surgery, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China wangyuxiang628@hotmail.com
Supported by:
Free Exploration Planning of Central South University, No. 2012QNZT122*; Major Project of Natural Science Foundation of Hunan Province, No. 12JJ2043*; National Natural Science Foundation of China, No. 81271940*; Natural Science Foundation of Hunan Province, No. 08JJ3057*; General Science and Technology Planning Project of Hunan Provincial Science and Technology Department, No. 08FJ3171*

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前对雌激素β受体基因如何参与骨代谢的研究较少。
目的：研究雌激素受体β对人成骨样细胞骨保护素、核因子kB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)表达的影响。
方法：将先前含有最有效干扰序列及非特异性shRNA的反转录病毒分别感染人成骨样MG63细胞株后，筛选稳定克隆并扩大培养，以空白及非特异性shRNA作为对照，检测稳定抑制雌激素受体β的效率。分别向3组细胞即MG63细胞、雌激素受体βshRNA反转录病毒感染的MG63细胞、阴性对照shRNAnc反转录病毒感染的MG63细胞加入17β-雌二醇(E2)干预，检测人成骨样细胞株MG63的骨保护素、RANKL mRNA和蛋白表达情况。
结果与结论：用pRNAT–H1.4/Retro-雌激素受体β-shRNA3进一步稳转人成骨样MG63细胞株，与空白及阴性病毒对照组相比，筛选出雌激素受体β表达稳定抑制的人成骨样细胞株，雌激素受体βmRNA抑制率为(88.17±1.17)%(P < 0.05)，蛋白抑制率为(89.01±1.22)%(P < 0.05)，证实实验成功建立了人成骨样细胞ERβ亚型基因敲低细胞模型。雌激素干预48 h后，显示雌激素受体β稳定抑制的MG63细胞较空白组及阴性对照组骨保护素 mRNA及蛋白表达上调(P < 0.05)，RANKL mRNA和蛋白表达下调(P < 0.05)，骨保护素RANKL表达上调(P < 0.05)，提示雌激素受体β可能通过调节骨保护素/RANKL在骨代谢中发挥作用。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, 雌激素受体β, RNA干扰, 人成骨样细胞, 反转录病毒载体, 骨保护素, RANKL, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies concerning how estrogen receptor β participates in bone metabolism are few now.
OBJECTIVE: To investigate the effect of estrogen receptor β on the expression of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor-κB ligand in human osteblast-like cells.
METHODS: The retrovirus with the most effective interference sequence and non-specific short hairpin RNA was used to transfect human osteoblast-like cell MG63 in order to screen out the stable colon, and then amplified and cultured. The blank control and non-specific short hairpin RNA were used as control, and the stable inhibition rate of estrogen receptor β was detected. The 17β-estradiol was added into the cells in three groups, that were MG63 cells, short hairpin RNA retrovirus estrogen receptor β-mediated MG63 cells and negative control short hairpin RNA retrovirus-medicated MG63 cells, in order to detect the expressions of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor-κB ligand mRNA in human osteoblast-like cells.
RESULTS AND CONCLUSION: The human osteoblast-like MG63 cell line was further stably transfected with pRNAT–H1.4/Retro-estrogen receptor β short hairpin RNA3, and then compared with the blank control and
negative control, and found that estrogen receptor β could express the stable inhibited human osteoblast-like cell line. The inhibition rate of estrogen receptor β mRNA was (88.17±1.17)% (P < 0.05), and the inhibition rate of estrogen receptor β protein was (89.01±1.22)% (P < 0.05), indicating that estrogen receptor β gene knockdown human osteoblast-like cell models were constructed successfully. After estrogen intervention for 48 hours, the inhibition of MG63 cells with estrogen receptor β could up-regulate the osteoprotegerin mRNA and protein expression in the blank control group and the negative control group (P < 0.05), down-regulate the receptor activator of nuclear factor-κB ligand mRNA and protein expression (P < 0.05), and up-regulate the osteoprotegerin receptor activator of nuclear factor-κB ligand expression. The results indicate that estrogen receptor β may play an important role in bone metabolism through regulating osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor-κB ligand ratio.

中图分类号:

R318

王昱翔，张宏其，郭超峰，唐明星，刘少华，邓盎，高琪乐，邓展生，陈静，刘金洋，吴建煌. 雌激素受体β基因沉默对成骨样MG63细胞骨保护素和RANKL表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(41): 7188-7198.

Wang Yu-xiang, Zhang Hong-qi, Guo Chao-feng, Tang Ming-xing, Liu Shao-hua, Deng Ang, Gao Qi-le, Deng Zhan-sheng, Chen Jing, Liu Jin-yang, Wu Jian-huang. Silenced estrogen receptor beta affects the expressions of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand in osteoblastic MG63 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(41): 7188-7198.

图/表（结果） 10

2.1 雌激素受体β-shRNA反转录病毒稳定感染后对MG63中雌激素受体βmRNA的沉默效果 经过阳性克隆筛选后，五六个克隆干扰效率无显著性差异，选其中一个阳性克隆做半定量RT-PCR，PCR产物经凝胶电泳，UVP凝胶成像系统拍摄成图像(其结果见图1)，感染48 h时实验组雌激素受体β-shRNA3反转录病毒载体的条带表达明显弱于阴性对照组及空白对照组，阴性对照组与空白对照组之间未见明显不同。半定量RT-PCR检测MG63细胞稳定感染后雌激素受体β mRNA的表达情况，空白对照组为1.317 4± 0.057 9，阴性对照组为1.274 1±0.029 3，雌激素受体β-shRNA-3为0.155 4±0.009 2。采用Quantity One软件进行资料分析的各组数据，经LSD检验，雌激素受体β-shRNA3干扰组中雌激素受体β基因mRNA的表达显著低于阴性对照组及空白对照组(P < 0.05)，抑制率为(88.17±1.17)%，阴性对照组与空白对照组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，见图1。

2.2 雌激素受体β-shRNA反转录病毒稳定感染后对雌激素受体β蛋白表达的沉默效果 各组细胞的雌激素受体β、β-actin Western-blot检测产物经数码相机拍摄成像，见图2，结果显示感染48 h时雌激素受体β-shRNA-3反转录病毒载体实验组条带明显弱于阴性对照组及空白对照组，阴性对照组与空白对照组之间未见明显不同。 Western-blot检测hMG63细胞稳定感染后雌激素受体β蛋白的表达情况：空白对照组为0.938 3± 0.029 8，阴性对照组为0.912 0±0.037 9，雌激素受体β-shRNA3为0.103 4±0.014 9。采用Quantity One软件进行资料分析的各组数据，经LSD检验，雌激素受体β-shRNA-3干扰组中雌激素受体β蛋白表达显著低于阴性对照组及空白对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，抑制率为(89.01±1.22)%。阴性对照组与空白对照组相比，差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.3 雌激素受体βshRNA对人成骨样细胞MG63增殖的影响 MTT法检测不同细胞生长曲线，见图3。

结果表明，与空白组及阴性对照组细胞比较，雌激素受体βshRNA干扰组MG63细胞的增殖情况差异无显著性意义(LSD检验，P > 0.05)。表明雌激素受体β稳定抑制后对人成骨样细胞MG63的增殖没有明显影响，见表1。

2.4 RNAi基因敲低雌激素受体β亚型后对骨保护素和RANKL mRNA表达的影响 采用Quantity One软件进行资料分析的各组数据，经LSD检验，雌激素受体βshRNA3干扰组MG63细胞中骨保护素基因mRNA的表达相对于阴性对照组及空白对照组上调，其上调率(15.51±1.72)%(P < 0.05)，阴性对照组与空白对照组相比，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

同法，结果显示雌激素受体β shRNA3干扰组MG63细胞中RANKL基因mRNA的表达相对于阴性对照组及空白对照组下调，其下调率为(22.17±0.94)% (P < 0.05)。阴性对照组与空白对照组相比，差异无显著性意义(P > 0.05)；雌激素受体βshRNA3干扰组中MG63细胞骨保护素/RANKL表达比率相对于阴性对照组及空白对照组升高(LSD检验，P < 0.05) 阴性对照组与空白对照组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 RNAi基因敲低雌激素受体β亚型后对骨保护素和RANKL蛋白表达的影响 实验用10^-8 mol/L的17β-雌二醇(E2)干预48 h后，各组细胞的骨保护素、RANKL、β-actin Western-blot检测产物经数码相机拍摄成像，结果显示雌激素受体βshRNA3干扰组雌激素受体βshRNA MG63细胞骨保护素基因的条带强于阴性对照组及空白对照组，见图9，10。雌激素受体βshRNA3反转录病毒稳定感染的MG63细胞RANKL基因的条带弱于阴性对照组及空白对照组，而阴性对照组与空白对照组之间均未见明显不同，见图11，12。

采用Quantity One软件进行资料分析的各组数据，经LSD检验，雌激素受体βshRNA3干扰组MG63细胞中骨保护素基因蛋白表达相比于阴性对照组及空白对照组上调，其上调率为(20.35±1.15)%(P < 0.05)，雌激素受体βshRNA3干扰组MG63细胞中RANKL基因蛋白表达相比于阴性对照组及空白对照组下调，其下调率为(27.22±1.48)%(P < 0.05)。阴性对照组与空白对照组相比，差异无显著性意义(LSD检验，P > 0.05)；雌激素受体βshRNA3干扰组MG63细胞中骨保护素/RANKL表达比率相比于阴性对照组及空白对照组升高了(LSD检验，P < 0.05)，见表3，图13。

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引言

目前认为，两种雌激素受体亚型即雌激素受体α和雌激素受体β具有各自独特的转录激活区域及不同的组织分布，可能是靶组织对雌激素呈现不同反应的关键。成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞，是参与骨的生长、重建和修复的关键细胞。体外实验发现雌激素受体α和雌激素受体β在成骨细胞内均有表达。雌激素等配体通过与雌激素受体α及雌激素受体β相互作用对成骨细胞发挥生物学效应。在雌激素-雌激素受体作用机制中，雌激素受体似乎起到了比雌激素更重要的作用。目前关于雌激素α受体基因如何参与骨代谢的研究已有较多，而对雌激素β受体基因如何参与骨代谢的研究则相对较少。部分学者选择采用基因敲除鼠模型来研究雌激素β受体亚型在骨代谢中的调控作用^[1-2]。然而这些动物模型均未能显示出雌激素受体β是通过怎样的途径来调节骨代谢的，因此构建雌激素受体β敲除/敲低的成骨细胞模型，对于研究雌激素受体在成骨细胞信号传导中的作用机制是迫切需要的。为此，作者在先前已构建的3条雌激素受体βshRNA的基础上^[3]，选出一条最佳干扰序列雌激素受体βshRNA3构建人成骨样细胞雌激素受体β亚型基因敲低的细胞模型，为研究雌激素受体β在骨代谢中如何发挥作用打下实验基础。骨是动态的组织，骨骼不断地进行新陈代谢，骨形成与骨吸收贯穿于骨代谢的全过程，二者的平衡维持着骨质及骨量的稳定。成骨细胞与破骨细胞是骨形成与骨吸收的执行体，受循环激素及细胞因子的调控。而骨保护素、核因素子KB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor• [Kappa]B RANK)、核因子KB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor• [Kappa]B ligand RANKL)系统即骨保护素/RANK/RANKL系统，表达于成骨细胞和破骨细胞表面，直接参与破骨细胞的活性及功能调节，是调控破骨细胞成熟分化的关键系统，该系统的紊乱将直接引起骨代谢和骨生长平衡受破坏，从而导致骨量的异常变化及其相关疾病。多个研究小组对骨保护素/RANKL在血清、骨髓间充质干细胞、成骨细胞中的作用进行了研究，结果表明RANKL和骨保护素的失衡可能是青少年特发性脊柱侧凸患者骨量减低的重要原因之一^[4-6]。此外，动物实验结果证实：骨保护素基因敲除的小鼠有严重的骨质疏松症，过度表达骨保护素的转基因小鼠则表现为严重的石骨症^[7]。刘继中等^[8]研究发现，RANKL基因敲除的小鼠破骨细胞发育障碍，破骨细胞形成减少，导致严重的骨质硬化，而注射外源性的RANKL后，出现破骨细胞形成，骨骼畸形减轻。实验探讨在雌激素干预下沉默雌激素受体β基因对成骨样细胞MG63中骨保护素和RANKL表达的变化情况，为进一步探讨雌激素受体β在骨代谢中的作用机制奠定基础。

材料方法

设计：基因学体外实验。

时间及地点：于2009年10月至2011年2 月在中南大学国家重点遗传实验室完成。

材料：

病毒及细胞株来源：绿色荧光蛋白标记的质粒购于南京金斯瑞生物科技有限公司；含无义序列的反转录病毒(nc)购于南京金斯瑞生物科技有限公司；人成骨样细胞MG63由中南大学肿瘤研究所惠赠。

主要材料与试剂：

实验方法：

人成骨样细胞雌激素受体β亚型基因敲低细胞模型的建立：

细胞培养和传代：37 ℃水浴中快速复苏冷存的人成骨样细胞株MG63，缓慢加入盛有约5 mL含体积分数10%胎牛血清RPMI-1640培养液的25×25培养瓶中，第2天换液1次以除去已经死去而未贴壁的细胞。以后每 2 d换液1次，于37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养，待细胞生长融合达90%-95%后进行下列实验。当培养瓶中的MG63细胞汇合度达到80%时，小心倒掉培养基；吸取5 mL PBS小心加入培养瓶内，并左右轻轻晃动，以清洗已死亡的细胞和旧培养基，共清洗2次；向培养瓶内加入0.5 mL 0.25% Trypsin-EDTA消化液并轻轻混匀，使胰酶和细胞充分接触，放置37 ℃，体积分数5%CO₂的温箱孵育2-5 min；倒置显微镜下观察细胞消化情况，可以轻拍培养瓶两侧，有利于细胞脱落，当瓶内细胞绝大部分处于漂浮状态时，立即加入5 mL含体积分数10%胎牛血清RPMI-1640完全培养基终止消化。将瓶内含细胞的培养基以1∶3传代至数个新的25 cm²培养瓶，轻轻摇晃培养瓶，以保证瓶内细胞分散均匀，放置37 ℃，体积分数5%CO₂的温箱培养。

人成骨样MG63细胞的稳定感染：取对数期生长的待感染人成骨样细胞hMG63，消化计数，制备细胞悬液。以2×10⁵/孔的密度，将细胞种于12孔板，移入37 ℃、含体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养12 h；将先前收集的含反转录病毒pRNAT-H1.4/Retro雌激素受体β-RNAi3及含无义序列的阴性对照反转录病毒的上清加polybrene至5 mg/L，0.45 μm微型滤器过滤，加入上述细胞中；24 h后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜完全培养基；病毒感染后换正常培养基恢复培养 24 h后，观察荧光表达情况。

细胞筛选和克隆挑取、扩大及传代：病毒感染后换正常培养基恢复培养24 h后，以2×10⁵细胞/皿转入内径 60 mm培养皿，移入37 ℃、含体积分数5% CO₂、饱和湿度的培养箱中培养48 h。加入潮霉素进行筛选，筛选终浓度为100 mg/L，每3 d换液，直至未感染细胞全部死亡，继续培养至14 d。24孔板中加入维持培养基(潮霉素较原筛选浓度减半，50 mg /L)，每孔0.5 mL。然后将培养皿随机放于倒置显微镜下，选取待挑克隆，克隆被选取的条件为在4倍目镜下大于半个显微镜视野，随机的方法为镜下观察培养皿后见到的第一个克隆，在镜下直接用灭菌中Tip小心撮取细胞克隆，边撮边吸，将吸取的细胞吹打到24孔板中，注意Tip头要完全在克隆内部操作，不要接触与吸到其它克隆。因反转录病毒载体感染的高效和稳定性，抗性克隆数目很多，每个培养皿按上述步骤挑取五六个克隆。24孔板中的单克隆细胞在24 h后换维持培养基。克隆长至满孔需3-10 d时间，每个克隆在24孔板培养孔中100%汇合后，消化传代至两个12孔板培养孔中，其中一孔传5/6的细胞，用于RNA和蛋白抽提，另一孔传1/6的细胞，用于保种、扩增。在半定量RT-PCR和Western blot鉴定出阳性感染克隆后，将克隆传代扩大培养2个月(扩大培养中及时冻存部分细胞)，以用于后续的研究。

实验分组：细胞的分组为：人成骨样细胞MG63、雌激素受体βshRNA反转录病毒感染的MG63细胞、阴性对照shRNAnc反转录病毒感染的MG63细胞。将3组细胞分别接种于6孔培养板中，然后用10^-8 mol/L的17β-雌二醇(E2)干预48 h。

半定量RT-PCR检测雌激素受体β、骨保护素、RANKL mRNA的表达：

引物设计：根据 GenBank 数据库中的基因序列设计引物，引物合成上海生物工程技术有限公司完成，序列如下：①雌激素受体β：上游引物：5’-TCC TTT AGT GGT CCA TCG C-3’；下游引物：5’-CGC AGA AGT GAG CAT CCC-3’。②骨保护素：上游引物：5’-TTG CCC TGA CCA CTA C-3’；下游引物：5’-TTT GAG AAG AAC CCA TC-3’。③RANKL：上游引物：5’-CAG CGT CGC CCT GTT CTT CTA-3’；下游引物：5’-GAT GGG ATG TCG GTG GCA TTA-3’。④β-actin (作为内对照)：上游引物：5’-TGA AGT GTG ACG TGG ACA TC-3’；下游引物：5’- GGA GGA GCA ATG ATC TTG AT-3’。

总RNA提取与cDNA合成：选择培养感染4 h后的细胞处理组和对照组，用 Invitrogen 公司的Trizol reagent 提取细胞样品总RNA，利用紫外分光光度仪测定总RNA的A_{260 nm}，A_{280 nm}。选择A_{260 nm/280 nm}为1.8-2.0的总RNA进行反转录，反转录反应按cDNA合成试剂盒(TaKaRa公司)说明书进行。

半定量RT-PCR：取上述反转录产物2 μL，分别加入雌激素β受体正向引物0.5 μL(10 μmol/L)，反向引物 0.5 μL (10 μmol/L)，dNTP 0.5 μL，2×GCbuffer 10 μL，LATaq 酶0.2 μL，加灭菌H₂O补足至20 μL。反应条件为95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性30 s，退火至60 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃充分延伸 10 min。通过扩增β-actin基因片段，调整cDNA 加入量使各样本的模板浓度一致。采用上述体系扩增相关功能基因的表达情况，以β-actin基因片段为内标，在目标 PCR 产物长度位置出现条带为相关酶基因有表达。以凝胶成像仪上扫描的各目标基因与β-actin的光吸收比值差异来表示目标基因的表达量。

Western blot 检测雌激素β受体、骨保护素、RANKL蛋白的表达：反转录病毒感染48 h后，提取各组细胞的总蛋白，取等量蛋白上样，10%聚丙烯酰胺凝胶，转移至硝酸纤维素膜。用0.05 g/L牛奶封闭1 h，加入雌激素β受体、骨保护素、RANKL一抗(1∶500)，4 ℃孵育过夜；洗膜，加入稀释的二抗(1∶5 000)，室温1 h；再次洗膜，DAB显色。同时检测β-actin蛋白表达。

四唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖：四唑盐比色法的原理：四唑盐(MTT)商品名为噻唑蓝，活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物(formazan)并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定A值。

步骤：①取对数期生长的待测人成骨样细胞(MG63、稳定感染雌激素受体βshRNA3反转录病毒的MG63及稳定感染shRNAnc反转录病毒的MG63)，消化计数，制备细胞悬液。②以1 000细胞/孔接种于96孔培养板中，因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀1次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。每组设3复孔，孔板移入37 ℃、含积分数5% CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。③分别培养1，2，3，4，5，6，7 d进行检测。每孔加入5 g/L四氮唑蓝盐(MTT) 20 µL，37 ℃、体积分数体积分数5% CO₂继续培养4 h。④小心吸弃孔内培养基，加二甲亚砜(DMSO)150 µL，室温振荡10 min，使结晶物充分溶解，酶标仪上490 nm测定各孔吸光度值A(490)值，以吸光度值表示细胞增殖能力大小，各组取3孔平均值，相同条件下实验重复3次，绘制生长曲线。

主要观察指标：①pRNAT-H1.4/Retro–雌激素受体β-shRNA反转录病毒载体的构建。②半定量RT-PCR检测稳定转染成骨样细胞MG63后雌激素β受体、骨保护素、RANKLmRNA的表达。③Western-blot检测稳定转染成骨样细胞MG63后雌激素β受体、骨保护素、RANKL蛋白的表达。

统计学分析：全部数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析。计量资料采用x(_)±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析(ANOVA)，方差齐性时采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett’C检验；以α=0.05为显著性检验水准，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

雌激素通过雌激素受体介导参与人体骨骼生理和病理的相关过程，对骨的生长发育、成熟以及骨量骨质维持有重要意义。两种雌激素受体亚型即雌激素受体α和雌激素受体β虽在功能区域上存在着高度同源性，但许多学者认为两者在介导雌激素参与骨代谢过程中可能起到了不同的作用^[9-11]。Wiren等^[12]研究发现大鼠颅盖骨中成骨细胞雌激素受体α的表达水平在基质成熟期升高，在矿物质形成期下降，而雌激素受体β在整个分化过程中表达稳定，认为雌激素受体α、雌激素受体β在骨代谢中作用不同。一项针对不同年龄段人群的正常骨骼、骨折愈合处、骨赘以及继发性甲状旁腺亢进性患者的骨组织进行的雌激素受体β蛋白定位和表达研究显示老年人骨组织中及骨转换高的部位存在着雌激素受体β的高表达，并说明了雌激素受体β可能在机体低雌激素水平时上调表达来介导雌激素调节骨代谢^[13]。Windah等^[14]在实验中发现在生长板的软骨细胞和成骨细胞中雌激素受体β有表达，从而提示雌激素受体β影响长骨的生长和成年人的骨代谢。Vidal等^[15]发现雌激素受体β沉默表达的细胞中，雌激素效应很低，因而认为雌激素受体β参与了骨形成与骨吸收。

雌激素基因敲除(ERKO)小鼠模型的建立对雌激素受体β在骨代谢的作用研究有很大的推动作用。Lindberg等^[16]研究发现雌激素受体α基因敲除(ERKO)小鼠和雌激素受体β基因敲除(BERKO)小鼠仍保持着较高的松质骨骨密度，而两者均敲除的小鼠(DERKO)的松质骨骨密度明显减少，似乎说明在骨保护效应中雌激素受体α和雌激素受体β可能存在相互竞争又相互补充的关系。与此同时Sims等^[17]也证实了这一点。Sims 等^[17]后来又发现雌激素对去势后的 BERKO 小鼠骨保护的效应低于野生型小鼠，而对去势后ERKO雌性小鼠，雌激素骨保护的效应非常低。推测雌激素的骨保护效应可能以雌激素受体α为主，雌激素受体β为辅的，而雌激素受体β在雌激素受体α表达受影响时自动上调来弥补其不足。Ke等^[18]发现雌激素受体β基因敲除鼠模型的股骨远端干骺端相比野生型小鼠具有更低的骨吸收作用，从而认为雌激素受体β在鼠生长过程中能促进骨皮质及骨松质骨吸收、骨代谢、及骨量丢失。Ke等^[19]后来通过将6，13，21个月的BERKO 小鼠与野生型小鼠比较发现雌激素受体β能刺激松质骨及内皮质骨表面的骨吸收、骨代谢及骨量丢失。尽管如此，这些研究均未能显示出雌激素受体β是如何调节骨代谢的。因此构建雌激素受体β敲除/敲低的成骨细胞模型，对于研究雌激素受体β在成骨细胞信号传导中的作用机制是迫切需要的。

RNA干扰是一种转录后基因沉默机制，因具有高特异性、高效、持久的特点^[20]。因此，RNA干扰已经成为继同源重组介导的基因敲除、反义核酸和核酶之后人们分析目的基因功能和研究人体细胞信号通路十分有效的技术手段。并且已广泛应用于探索哺乳动物基因功能的研究之中^[21]。Liang等^[22]通过RNA干扰技术沉默了具有成骨细胞特点并可分化为成骨细胞的牙周膜成纤维细胞中雌激素受体β的表达，用雌激素干预雌激素受体β抑制的和未抑制的牙周膜成纤维细胞来研究细胞中骨保护素/核因子κB受体活化因子配体表达情况。并认为雌激素可能通过雌激素受体β介导来调节牙周膜成纤维细胞中骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的表达，从而参与牙槽骨的抗骨吸收作用。

正常的骨吸收和骨重建处于动态平衡之中，而这一平衡又分别与破骨细胞和成骨细胞的功能密切相关。近年来发现骨保护素/核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体系统是在破骨细胞分化过程中的一个重要信号传导通路^[23]。成骨细胞核因子κB受体活化因子与破骨细胞前体细胞或破骨细胞表面的核因子κB受体活化因子结合后，促进破骨细胞的分化和激活，并抑制破骨细胞的凋亡。成骨细胞还分泌表达骨保护素，与核因子κB受体活化因子配体竞争性结合，阻止核因子κB受体活化因子配体与核因子κB受体活化因子之间的结合。目前认为骨保护素/核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体系统已经成为调控骨代谢的核心环节^[24]。

骨保护素为一种分泌型糖蛋白，它是肿瘤坏死因子受体家族成员，有单体和二聚体2种形式。人类骨保护素是位于8q23-24上的单拷贝基因，由401个氨基酸组成。在骨骼，骨保护素主要由骨骼中成骨细胞系的各种细胞产生，并随细胞的分化而增加，是目前发现的破骨细胞惟一的负向调节因子。体外实验证实，骨保护素抑制破骨细胞前体细胞的分化以及成熟破骨细胞形成骨吸收陷窝，并诱导破骨细胞凋亡。其最终结果是骨保护素能抑制破骨细胞介导的骨吸收，增加皮质骨和松质骨密度、面积和骨强度^[25]。付应霄等^[26]采用小鼠原代破骨细胞模型，在体外培养的基础上添加不同浓度骨保护素，通过TRAP阳性细胞计数、细胞骨架F-actin染色、骨吸收功能检测等手段，观察骨保护素对体外培养破骨细胞的作用。实验结果显示，骨保护素能够直接作用于破骨细胞，减少其数量，破坏其F-actin环，减弱其骨吸收活性，且随骨保护素浓度的增加，对破骨细胞的影响更加明显。Yasuda等^[27]通过动物实验发现骨保护素基因敲除的小鼠出现严重的骨质疏松症，过度表达骨保护素的转基因小鼠表现为严重的石骨症。因此，骨保护素被认为是破骨细胞分化和成熟的生理性抑制因子，在维持骨吸收和骨形成的平衡方面起着重要的调节作用。

人的核因子κB受体活化因子配体是一种多肽，由317个氨基酸组成的。它是一种由两部分即40 000- 45 000长的细胞内和细胞膜黏附部分，以及从全长裂解下来的长约31 000的可溶性部分组成且缺乏信号肽的Ⅱ型跨膜蛋白。两部分都是以三聚体形式存在。核因子κB受体活化因子配体mRNA在骨组织和淋巴组织中含量高。在骨髓基质细胞和成骨细胞均可检测到核因子κB受体活化因子配体mRNA。核因子κB受体活化因子配体是目前发现的惟一具有诱导破骨细胞分化、发育、成熟及其发挥功能的因子^[28]。此外，核因子κB受体活化因子配体不仅促进破骨细胞的分化，而且呈剂量依赖性地激活成熟的破骨细胞、延长其存活时间、提高运动和形成骨吸收陷窝的能力^[29]。可见，核因子κB受体活化因子配体是调节骨吸收的关键因子。

核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体/骨保护素骨调节轴信号通路是近些年来骨代谢领域的重大发现。许多激素、细胞因子、生长因子通过作用于核因子κB受体活化因子配体，骨保护素影响骨代谢，而导致骨代谢疾病如骨质疏松，溶骨性骨肿瘤及恶性肿瘤骨转移等^[30-31]；也是影响破骨细胞分化、发育、调节其功能唯一的、最终的途径^[32]。诸多研究发现骨保护素/核因子κB受体活化因子配体系统在阐明骨代谢发生机制方面具有重要意义，特别是股保护素/核因子κB受体活化因子比率的改变可以直接影响破骨细胞的发育，从而影响骨代谢^[33]。Pivonka等^[34]研究证明成骨细胞通过细胞间接触，通过自身分泌的核因子κB受体活化因子配体与破骨细胞分泌的核因子κB受体活化因子结合，促进破骨细胞的成熟与分化，但同时成骨细胞也可以分泌骨保护素，它可以与核因子κB受体活化因子配体结合，进而抑制核因子κB受体活化因子配体与核因子κB受体活化因子的结合，抑制破骨细胞的成熟与分化, 骨保护素/核因子κB受体活化因子配体比值大，抑制骨吸收；反之，促进破骨细胞分化，促进骨吸收。由此可见成骨细胞可以通过骨保护素与核因子κB受体活化因子配体表达比值的变化影响破骨细胞，进而调节骨吸收和骨重建^[35]。

实验将收集的含反转录病毒pRNAT-H1.4/Retro雌激素受体β-RNAi3及含无义序列的阴性对照反转录病毒稳定感染人成骨样细胞株MG63从而观察雌激素受体β表达的情况。实验选择MG63作为雌激素受体β敲低的成骨细胞模型是由于其可作为具有成骨细胞表型特征的成骨细胞模型^[36-37]。且具有成骨细胞的大部分特征。采用半定量RT-PCR和Western blot法鉴定了RNA干扰对MG63细胞内雌激素受体β的表达水平。检测结果显示稳定转染含反转录病毒pRNAT-H1.4/ Retro-雌激素受体β-RNAi3的人成骨样细胞株MG63中雌激素受体β的mRNA和蛋白表达较阴性对照组及空白组显著下降，但MTT法测定的3组细胞生长情况显示RNA干扰雌激素受体β对MG63细胞的生长没有明显的影响。这表明实验成功地建立了雌激素受体βshRNA人成骨样细胞模型，这为进一步研究雌激素受体β介导下雌激素调节骨代谢的相关机制打下了基础。

然后将细胞分为3组即稳定转染的MG63-雌激素受体βshRNA3细胞、MG63-sh RNAnc细胞、MG63细胞，用10^-8 mol/L的17β-雌二醇(E2)干预48 h，提取各组细胞RNA进行半定量RT-PCR，检测骨保护素和核因子κB受体活化因子配体的mRNA表达水平的变化，结果显示稳定转染的MG63-雌激素受体βshRNA细胞骨保护素mRNA表达较MG63-shRNAnc细胞和MG63细胞增加，核因子κB受体活化因子配体mRNA表达较MG63-shRNAnc细胞和MG63细胞减少，使得骨保护素/核因子κB受体活化因子配体比值上调。Western Blot结果显示，与MG63-雌激素受体βshRNAnc细胞和MG63细胞相比较，稳定转染的MG63-雌激素受体β-shRNA3细胞中骨保护素蛋白表达水平增加，核因子κB受体活化因子配体蛋白表达水平降低，骨保护素/核因子κB受体活化因子配体表达上调，与基因水平鉴定结果一致。这提示沉默雌激素受体β基因可以上调人成骨样细胞中骨保护素的表达，同时降低核因子κB受体活化因子配体的表达,提高骨保护素/核因子κB受体活化因子配体表达比率。这为进一步研究雌激素受体β如何调节骨代谢具有一定的指导意义。然而，雌激素受体β调节骨保护素/核因子κB受体活化因子配体表达比率的具体分子信号通路尚不完全清楚，并且由于雌激素受体β参与骨代谢作用是个复杂的过程，其还通过其他哪些作用途径调节骨代谢这都有待于进一步去研究与探索。

总之，实验成功建立了人成骨样细胞雌激素受体β亚型基因敲低细胞模型。发现在雌激素干预下，利用RNA干扰沉默雌激素受体β后可以上调人成骨样细胞中骨保护素的表达，同时降低核因子κB受体活化因子配体的表达,提高骨保护素/核因子κB受体活化因子配体表达比率，提示雌激素受体β可能通过调节骨保护素/核因子κB受体活化因子配体在骨代谢中发挥作用。

雌激素受体β基因沉默对成骨样MG63细胞骨保护素和RANKL表达的影响

Silenced estrogen receptor beta affects the expressions of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand in osteoblastic MG63 cells

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