聚羟基烷酸酯聚合物负载软骨细胞修复同种异体喉软骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.41.001

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (41): 7181-7187.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.41.001

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聚羟基烷酸酯聚合物负载软骨细胞修复同种异体喉软骨缺损

孙安科，李万同，刘松波，张贺，孙伟，陈伟，史春海，唐维维

解放军沈阳军区总医院耳鼻咽喉科，辽宁省沈阳市 110016

收稿日期:2013-04-13 修回日期:2013-05-26 出版日期:2013-10-08 发布日期:2013-11-01
作者简介:孙安科☆，男，1962年生，河南省南阳市人，汉族，1985年解放军解放军第二军医大学毕业，博士后，主任医师，主要从事软骨组织工程与喉软骨功能重建研究。 sak00161@126.com
基金资助:
沈阳军区总医院院级重点基金课题(zy2009z0019)

Repairing allogenic thyroid cartilage defects using poly(3-hydroxybutyrate-co- 3-hydroxyhexanoate) seeded with chondrocytes

Sun An-ke, Li Wan-tong, Liu Song-bo, Zhang He, Sun Wei, Chen Wei, Shi Chun-hai, Tang Wei-wei

Department of Otolaryngology, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China

Received:2013-04-13 Revised:2013-05-26 Online:2013-10-08 Published:2013-11-01
About author:Sun An-ke☆, M.D., Chief physician, Department of Otolaryngology, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China sak00161@126.com
Supported by:
Key Project of General Hospital of Shenyang Military Region, No. zy2009z0019

摘要/Abstract

摘要：

背景：软骨组织工程基础研究相当深入，但在耳鼻咽喉科实际应用研究颇少，探索组织工程技术简便实用的喉软骨修复方法是值得研究的课题。
目的：比较多孔海绵状聚羟基丁酸酯与聚羟基己酸酯共聚物生物材料负载软骨细胞体外培养形成的初期组织工程软骨组织与体内植入一定时期形成的较成熟组织工程软骨组织修复同种异体甲状软骨缺损的效果。
方法：收集体外培养第3代乳兔(3 d龄)软骨细胞，以多孔海绵状聚羟基丁酸酯与聚羟基己酸酯共聚物生物材料为细胞外基质，采用组织工程技术制备细胞-材料复合物，共同体外培养形成初级组织工程软骨组织后直接应用于成兔甲状软骨缺损的修复(实验组A，n=5)或将初级组织工程软骨组织体内植入一定时期形成较成熟组织工程软骨再应用于甲状软骨缺损的修复(实验组B，n=5)。设单纯聚羟基丁酸酯与聚羟基己酸酯共聚物材料修复组(对照A组，n=4)和单纯软骨细胞修复组(对照B组，n=4)作为对照。分别于术后4周(实验B组)和8周(实验A组、对照A组、对照B组)取材，对甲状软骨缺损修复效果进行大体和组织学评价。
结果与结论：两者大体支架形态基本一致，修复区与原有软骨均相续平坦，无凹陷及缺损。但实验A组存在界面无细胞区，修复区基质分泌不丰富；实验B组界面区有细胞生长，基质分泌良好。两者炎细胞浸润均不明显。对照组修复区凹陷，呈暗红色软组织充填，组织学及特殊染色检查未发现软骨样结构及其分泌的基质成分。结果表明在有免疫力的动物体内，初级组织工程软骨组织直接应用与体内植入后再应用均能有效修复同种异体甲状软骨缺损，无明显免疫反应；相同时期内，应用较成熟组织工程软骨组织修复效果优于应用初级组织工程软骨组织。然而，直接应用初级组织工程软骨组织可节省时间、成本、工作量及操作环节，避免二次皮下手术的痛苦，是比较实用的方法之一。

关键词: 组织构建, 软骨组织构建, 同种异体, 组织工程, 软骨, 软骨细胞, 甲状软骨, 聚羟基丁酸酯与聚羟基己酸酯共聚物材料, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: A great development has been achieved in essential research on tissue engineered cartilage. However, its real application in otolaryngology has been rarely reported. It is faced with the topic to explore the simple and convenient method of repairing laryngeal cartilage by tissue engineering technique.
OBJECTIVE: To compare the effect of porous spongy poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) seeded with chondrocytes or using senior tissue engineered cartilage in repairing allogenic thyroid cartilage defects.
METHODS: Chondrocytes at passage 3 were harvested from infant rabbits within 3 days. Porous spongy poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) seeded with chondrocytes composites were made by tissue engineering technique. The chondrocyte-poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) composites were co-cultured in vitro to form junior tissue engineered cartilage. And then respectively used for repairing the thyroid cartilage defects and directly transplanted with junior tissue engineered cartilage (experimental group A, n=5), or firstly the junior tissue engineered cartilage to be implanted subcutaneously for a period of time to further maturity for relative senior tissue engineered cartilage and secondly to be transplanted (experimental group B, n=5) into adult New Zealand white rabbits. Simple poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) sponge scaffold (control group A, n=4) and chondrocyte suspensions(control group B, n=4) were used as reparative materials in defect areas as control groups. Finally, the reparative effect was respectively studied grossly and histologically at 4 weeks (experimental group B) and 8 weeks (experimental group A, control group A and control group B) after transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: The cartilage defects were well repaired in the experimental groups. It was smooth between the reparative area and original cartilage without dents and defects. Both were similar grossly. But few chondrocytes at interfacial region between the reparative area and original cartilage and poor matrices were observed in the experimental group A. A Few chondrocytes and more matrices were observed in the experimental group B. Inflammatory cell infiltration was not obvious in two experimental groups. Control groups showed soft tissue of dark-red color accompanied with local concave in gross specimens. Histological examination and special staining showed there were no cartilage-like structure and secretion of matrix components. The results showed that it is possible to repair thyroid cartilage defect using junior tissue engineered cartilage directly or junior tissue engineered cartilage after in vitro implantation in allograft rabbits with immunity, and the immunoreaction is not obvious; in the same period, the repairing effect of mature tissue engineered cartilage is better than that of junior tissue engineered cartilage. However, application of junior tissue engineered cartilage directly can save time, costs, workload and operational link, and avoid the pain from secondary skin surgery, which is one of the more practical approaches.

Key words: tissue engineering, chondrocytes, thyroid cartilage, polymers

中图分类号:

R318

孙安科，李万同，刘松波，张贺，孙伟，陈伟，史春海，唐维维. 聚羟基烷酸酯聚合物负载软骨细胞修复同种异体喉软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(41): 7181-7187.

Sun An-ke, Li Wan-tong, Liu Song-bo, Zhang He, Sun Wei, Chen Wei, Shi Chun-hai, Tang Wei-wei. Repairing allogenic thyroid cartilage defects using poly(3-hydroxybutyrate-co- 3-hydroxyhexanoate) seeded with chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(41): 7181-7187.

图/表（结果） 6

2.1 初级与较成熟组织工程软骨组织形成情况 初级组织工程软骨电镜扫描观察见软骨细胞呈串珠或群落状黏附于PHBHH海绵状空隙间，培养4周时倒置显微镜下见材料周围呈现大量胶冻样基质，见图1，扫描电子显微镜可见细胞密布PHBHH材料表面及其海绵状空隙中，细胞周围黏液状的基质物质相互间有粘连，细胞表面呈现多个类圆形小突起，可能为软骨细胞分泌的尚未融合的基质成分，见图2。

大体测试负载软骨细胞的PHBHH有一定硬度。皮下植入4周获取的较成熟组织工程软骨呈白色片状，有一定的弹性，见图3。

2.2 实验动物术后表现 所有动物术后无明显呼吸困难，进食不受影响；实验A组有1只动物术后出现短暂喘鸣；实验B组1只动物术后2周死于腹泻，其余均成活良好；伤口均Ⅰ期愈合。

2.3 甲状软骨缺损修复效果比较

大体观察：术后4周(实验B组)与术后8周(实验A组)，两组修复区与原有软骨间相续均光滑平坦，但修复区表面色泽与对侧正常甲状软骨相比发黄，见图4。对照A组和B组修复区均凹陷，仅见结缔组织。

苏木精-伊红染色：术后4周(实验B组)与术后8周(实验A组)，实验A组与正常软骨间可见界面无细胞区，见图5；实验B组界面区少量软骨细胞生长, 但形态较小，陷窝不明显。对照A组和B组修复区未见软骨细胞生长。

Masson三色染色：术后4周(实验B组)与术后8周(实验A组)，实验A组染色浅，B组较深，说明基质胶原含量有差异；实验B组修复区与正常软骨间可见少量软骨细胞生长，修复区软骨细胞较多，但细胞数量和形态上仍不及正常软骨区，见图6。

阿丽辛蓝过碘酸雪夫反应(AB/PAS)染色：术后4周(实验B组)和术后8周(实验A组)，实验A组淡蓝色，实验B组淡紫蓝色，见图7，说明基质黏多糖含量有差异。

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引言

材料方法

设计：对比观察动物实验。

时间及地点：实验于2011年5月至2012年3月在解放军沈阳军区总医院医学实验科及实验动物中心完成。

材料：

实验动物：3 d龄新西兰白兔乳兔；6月左右龄雄性新西兰白兔18只，体质量(2.5±0.5) kg，均由解放军沈阳军区总医院实验动物中心提供。

聚羟基烷酸酯聚合物负载软骨细胞修复同种异体喉软骨缺损实验所用试剂和材料、仪器：

实验方法：

软骨细胞获取：3 d龄新西兰乳兔，无菌条件下取其肋软骨和关节软骨，去净软骨膜，0.1 mol/L灭菌磷酸缓冲液(0.1 mol/L PBS，含青、链霉素各200 U/mL)冲洗2遍，0.25%胰蛋白酶先消化2 min，PBS冲洗3遍；然后剪切成1.0-2.0 mm³碎块，PBS再浸洗1遍；置50 mL小烧杯中，加0.3%Ⅱ型胶原酶，37 ℃搅拌消化，自1 h起，每半小时收集细胞1次，直到全部固体物消失。所获细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀用PBS洗2遍；DMEM/Ham-F12(1∶1)混合培养液(含体积分数为20%胎牛血清)重悬细胞，锥虫蓝染色，细胞计数板(血球计数板)法计数(染色细胞判为失活力细胞，拒染细胞为活力细胞)。以2×10⁸ L^-1细胞浓度接种于100 mL培养瓶内，48 h换液1次，细胞贴满壁后传代。收集第3代培养软骨细胞，离心后制成细胞悬液备用。

初级与较成熟组织工程软骨组织的构建与界定：调整细胞悬液浓度为5×10¹⁰ L^-1，采用多点播散方法将细胞悬液接种于经培养液预湿后约七成干燥的PHBHH材料上，接种时每次少量吸取细胞悬液，均匀点播，尽可能使细胞有一致的密度分布，细胞与材料复合后置于 37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度培养箱，24-48 h更换大部分培养液1次，培养7-10d彻底更换培养液1次，体外培养4周，负载软骨细胞PHBHH材料具有一定硬度时界定为初级组织工程软骨组织形成。初级组织工程软骨组织部分直接应用于修复同种异体甲状软骨实验，部分种植于成兔侧背部皮下进一步成熟，获取4周形成的软骨组织界定为较成熟组织工程软骨组织。

同种异体甲状软骨修复实验动物模型：6月左右龄雄性新西兰白兔18只，随机分成实验A组(5只)、实验B组(5只)、对照A组(4只)和对照B组(4只)。颈前正中切口，暴露甲状软骨，去除一侧甲状软骨板及其软骨膜，保留喉黏膜。分别以初级组织工程软骨组织(实验A组)、较成熟组织工程软骨组织(实验B组)、单纯PHBHH生物材料(对照A组)和缺损区植入500 μL(约7×10^{10软骨细胞悬液(对照B组)为修复材料建立同种异体甲状软骨修复实验动物模型。} L^-1)

主要观察指标：通过以下观察指标分别比较评估实验动物术后4周(实验B组)和8周(实验A组、对照A组、对照B组)甲状软骨缺损的修复情况，比较其修复效果。

初级组织工程软骨显微与超微镜下观察：倒置显微镜与扫描电镜下观察种子细胞的形态、及其在生物材料上的分布、黏附与基质分泌情况。

较成熟组织工程软骨大体形态：4周时形成的较成熟组织工程软骨形态及其质地。

修复术后大体标本表现：同种异体甲状软骨缺损修复术区状态及其与周边大体相续情况。

苏木精-伊红染色：常规的细胞染色技术，主要用于观察细胞的显微状态。染色结果为细胞核呈蓝黑色，细胞浆呈淡红色。

Masson三色染色：主要观察软骨基质中胶原纤维，染色结果为胶原纤维呈绿色。

阿丽辛蓝过碘酸雪夫反应染色(AB/PAS)：主要观察软骨基质中黏多糖，染色结果为酸性黏多糖呈蓝色，中性黏多糖呈红色，两者混合呈紫红色。

免疫组织化学染色：本文应用ABC技术、二氨基联苯胺(DAB)显色，主要用于检测软骨基质Ⅱ型胶原。Ⅱ型胶原是透明软骨基质的特异性标志，在软骨基质检出Ⅱ型胶原的存在，说明软骨为透明软骨。检测结果为Ⅱ型胶原所在部位呈黄褐色。

讨论

将软骨细胞植入缺损部位修复关节软骨早在20世纪60年代就有学者尝试^[12]，结果在缺损区仅有一些软骨结节形成，认为与软骨细胞流失有关。以后有人将软骨细胞接种在脱钙骨支架，然后再移植到软骨缺损部位，企图再生软骨修复缺损，虽未获得理想效果，但认识到软骨细胞与合适生物材料复合修复缺损关节软骨的可行性^[13]。组织工程技术为实现软骨缺损的理想修复带来了希望。但是组织工程软骨的形成，首先需要大量种子细胞，虽然目前骨髓基质干细胞、软骨膜间充质干细胞、肌肉源性和脂肪源性干细胞、胚胎干细胞等向软骨细胞转化的研究有较多报道^[14-16]。但诱导这些“干细胞”转化条件及其扩增技术的研究远未达到成熟的程度，形成的所谓软骨细胞不但数量有限，而且存在致瘤性、安全性和伦理性等问题。因此目前大量获取“干细胞”来源的软骨种子细胞仍无法实现。自体和同种异体软骨细胞仍是目前乃至今后相当长时期软骨组织工程主要的种子细胞来源。自体软骨数量有限，培养扩增易“去分化”^[17]。相比之下，同种异体软骨来源广、易获取、抗原性弱，一般不引起或仅有极低的免疫原性，不易受免疫排斥。应用同种异体软骨细胞在具有免疫力动物体内已成功形成组织工程软骨并修复软骨缺损，未发现明显免疫排斥反应^[18-21]，提示同种异体软骨细胞作为组织工程种子细胞的可行性。

目前软骨组织工程生物材料主要有4大类：天然材料(胶原、纤维蛋白、脱细胞基质和壳聚糖等)^[22]、人工合成材料(聚羟基乙酸与聚乳酸)等^[23]、微生物合成的新型材料(聚羟基烷酸酯类生物材料及其共聚物)^[24]和复合材料(聚乳酸-胶原和纤维蛋白-聚氨酯等)^[25]。这些材料，在生物相容性、降解性、细胞黏附性、内部微结构、代谢微环境、机械强度及塑形灵活性等方面各有优缺点，迄今还没有一种生物材料能完全符合组织工程软骨组织构建与应用的要求，但研究显示，聚羟基烷酸酯类材料呈现较好的应用前景^{[11, 26]}。聚羟基烷酸酯类材料是微生物合成的天然物质，不含合成材料可能残留的有害物质，是较洁净的生物材料之一。具有高熔点、高结晶度、高相对分子质量、耐拉伸和生物相容性良好、无致炎性、无排斥性和易降解等特点，而且与聚羟基乙酸和聚羟基丙酸相比，聚羟基烷酸酯类材料酸性较弱，因此降解产物的酸性反应明显低于聚羟基乙酸和聚羟基丙酸^[27-28]。研究表明，聚羟基烷酸酯类系列聚合物中，随着单体碳数的增加，力学性能存在着从脆性到黏性的转变^[29-30]。由于该系列聚合物的种类较多，且聚合物之间有较好的相容性，通过对不同聚合物的优势组合，可以得到具有更佳强度、韧性、更好生物相容性和可控降解性的组织工程支架材料^[31-32]。由聚羟基丁酸酯[poly (3-hydroxybutyrate)，PHB]与聚羟基已酸酯[poly (3-hydroxyhexanoate)，PHH]共聚而成的优化聚羟基烷酸酯类材料PHBHH，不但具有聚羟基烷酸酯类材料的优点，而且价格低廉、来源充裕，是值得关注与研究的组织工程生物材料之一^[33-38]。

实验以PHBHH为生物材料，以组织工程技术制备初级与较成熟组织工程软骨，分别用于修复同种异体甲状软骨缺损，并比较体内外不同时期组织工程软骨修复同种异体甲状软骨缺损的效果。结果显示，自PHBHH负载软骨细胞共同体外培养起相同时期，在有免疫力的动物体内，用初级组织工程软骨与经体内4周植入形成的较成熟组织工程软骨均能有效地修复喉甲状软骨缺损，但是初级组织工程软骨组织在修复区形成的软骨，其细胞数量、形态和基质分泌均不及较成熟组织工程软骨组织。

这次实验自PHBHH负载软骨细胞到初级组织工程软骨组织形成的4周时间，实验组及对照组所处体外环境及条件完全相同，只是以不同的技术方法实现同种异体甲状软骨修复的体内植入8周时间，各组所处环境与条件有异。分析两者差异的原因，可能与以下因素有关，首先，用于修复软骨缺损的初级组织工程软骨组织营养来源可能不如植入皮下的丰富；其次，动物术后因觅食或进食颈部频繁活动，可能会使初级组织工程软骨组织的软骨细胞出现脱落和丢失，进而影响到其成软骨能力；再者，支架材料的降解性和生长因子的量效、时效关系在不同部位可能存在差异。有学者进行了聚羟基丁酸及其共聚物体内降解实验^[39]，认为体内植入8周其共聚物绝大部分降解吸收，10周完全降解。本实验体内植入8周组织学未发现明显PHBHH材料残留迹象，一方面可能与PHBHH已基本降解吸收有关；另一方面也可能因为PHBHH为多孔海绵状材料，8周后少量残留降解物稀化分散在软骨细胞及其基质中，组织学染色难以区分有关。本实验结果提示以PHBHH为生物材料软骨组织工程实际应用时，体内植入时间应不少于8周，不同部位环境因素对组织工程软骨形成的影响应予重视。

虽然文章结果提示以较成熟组织工程软骨组织修复甲状软骨缺损在组织学层面优于应用初级组织工程软骨组织，但是，纵观实验过程，应用较成熟组织工程软骨组织，存在二次创伤、工作量加大，操作环节多及修复等待时间长等不利因素，实际应用有诸多不便。而直接应用初级组织工程软骨组织不仅节省时间、成本、工作量及操作环节，也避免二次皮下手术的痛苦，是比较实用的方法之一。

聚羟基烷酸酯聚合物负载软骨细胞修复同种异体喉软骨缺损

Repairing allogenic thyroid cartilage defects using poly(3-hydroxybutyrate-co- 3-hydroxyhexanoate) seeded with chondrocytes

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[1]	谭新访, 郭艳幸, 秦晓飞, 张斌清, 赵东亮, 潘琨琨, 李瑜卓, 陈皓宇. 顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.
[2]	姚晓玲, 彭建城, 许岳荣, 杨志东, 张顺聪. 可变角度零切迹前路椎间融合内固定系统治疗脊髓型颈椎病：30个月随访[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1377-1382.
[3]	吴聪, 贾全忠, 刘伦. 成年关节软骨碎块化后转化生长因子β1表达与软骨细胞迁移的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1167-1172.
[4]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[5]	张璟琳, 冷敏, 朱博恒, 汪虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.
[6]	许磊, 韩晓强, 张锦涛, 孙海飚. 关节软骨细胞周围透明质酸产生、转化和功能特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 768-773.
[7]	林旭晨, 祝海年, 王增顺, 祁腾民, 刘立民, 索南昂秀. 黄腐酚对骨关节炎模型小鼠炎性因子及关节软骨的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 676-681.
[8]	何云影, 李玲婕, 张舒淇, 李雨舟, 杨生, 季平. 聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 553-559.
[9]	何冠宇, 徐宝山, 杜立龙, 张同星, 霍振鑫, 申力. 天然丝素蛋白构建仿生取向微通道纤维环支架[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 560-566.
[10]	陈晓旭, 罗雅馨, 毕浩然, 杨琨. 脱细胞支架制备及其在组织工程和再生医学中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 591-596.
[11]	康坤龙, 王新涛. 生物支架材料促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 597-603.
[12]	沈佳华, 付勇. 基于石墨烯的纳米材料可否在干细胞领域应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 604-609.
[13]	张通, 蔡金池, 袁志发, 赵海燕, 韩兴文, 王文己. 基于透明质酸的复合水凝胶修复骨关节炎软骨损伤：应用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 617-625.
[14]	李辉, 陈良龙. 植骨材料在脊柱结核治疗中的应用与特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 626-630.
[15]	高仓健, 杨振, 刘舒云, 李浩, 付力伟, 赵天元, 陈威, 廖志垚, 李品学, 眭翔, 郭全义. 静电纺丝技术在肩袖损伤修复中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 637-642.