以关节不稳建立的大鼠骨关节炎模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.37.014

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (37): 6628-6635.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.37.014

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以关节不稳建立的大鼠骨关节炎模型

张荣凯¹，杨禄坤²，叶志强³，吴兆亚¹，赵庆¹，蔡道章⁴

中山大学附属第五医院，¹骨外科， ²麻醉科，广东省珠海市 519000；³中山大学附属第三医院急诊科，广东省广州市 510630；4南方医科大学附属第三医院关节外科，广东省广州市 510630

收稿日期:2013-03-09 修回日期:2013-07-15 出版日期:2013-09-10 发布日期:2013-09-10
通讯作者: 蔡道章，博士，博士生导师，主任医师，南方医科大学附属第三医院关节外科，广东省广州市 510630 caidaozhang@gmail.com
作者简介:张荣凯☆，男，1977年生，广东省开平市人，汉族，中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事关节疾病方面的研究。 kaican@163.com
基金资助:
国家863高技术研究发展计划资助项目(2008AA02Z437)*；中山大学附属第五医院青年医师科研启动基金(201203)*；珠海市医学科研项目(2013D0401990009)*

Establishing a rat osteoarthritis model based on knee joint instability

Zhang Rong-Kai¹, Yang Lu-kun², Ye Zhi-qiang³, Wu Zhao-ya¹, Zhao Qing¹, Cai Dao-zhang⁴

¹Department of Orthopedics, ²Department of Anesthesiology, the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Zhuhai 519000, Guangdong Province, China; ³Department of Emergency, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China; 4Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China

Received:2013-03-09 Revised:2013-07-15 Online:2013-09-10 Published:2013-09-10
Contact: Cai Dao-zhang, M.D., Doctoral supervisor, Chief physician, Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China caidaozhang@gmail.com
About author:Zhang Rong-kai☆, M.D., Attending physician, Department of Orthopedics, the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Zhuhai 519000, Guangdong Province, China kaican@163.com
Supported by:
National High-Tech Research and Development Plan of China (863 Program), No. 2008AA02Z437*; Young Doctor Initial Foundation of the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, No. 201203*; Medical Research Project of Zhuhai City, No.2013D0401990009*

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨性关节炎是一种复杂的多病因退变性关节疾病。早期进行骨性关节炎的防治尤其重要。但获取足量的适合研究的早期骨性关节炎的人类骨标本十分困难。
目的：观察关节不稳方法建立骨关节炎模型大鼠的关节软骨组织学变化。
方法：10周龄雄性SD大鼠随机分为2组：实验组切除右膝内侧半月板及内侧副韧带，对照组仅切开关节囊。于术后1，2，4，6，8周取右膝关节标本，行病理组织学检查分析大鼠骨关节炎病程的变化情况。
结果与结论：①术后2，4，6，8周，实验组关节软骨退变程度呈现轻度糜烂、溃疡磨损、严重磨损、骨赘形成等病理变化。②术后1，2，4，6，8周，实验组关节软骨评分均明显高于对照组(P < 0.05)。结果显示该实验采用内侧副韧带切断+内侧半月板切除方法成功建立了大鼠膝关节骨关节炎模型，且造模后4周内的病理、形态学改变类似于人类早期膝关节骨关节炎表现，是研究早期骨关节炎的理想模型。

关键词: 组织构建, 组织构建实验造模, 骨性关节炎, 关节软骨退变, 骨关节炎, 动物模型, 关节不稳, 膝关节, 软骨评分, 863项目

Abstract:

BACKGROUND: Osteoarthritis is a kind of complex multi-cause degenerative joint diseases. It is important to prevent and treat osteoarthritis in the early stage. But it is difficult to obtain the sufficient amount of human bone specimens with early osteoarthritis which are suitable for the research.
OBJECTIVE: To observe the pathological changes of articular cartilage in the rat osteoarthritis model established with joint instability.
METHODS: The 10-week-old male Sprague Dawley rats were randomly divided into two groups: the experimental group and the control group. Rats in the experimental group underwent open surgery, involving both medial meniscectomy and medial collateral ligament transection. The rats in the control group only received capsular incision. The rats were sacrificed at 1, 2, 4, 6 and 8 weeks after operation to obtain the right knee joint specimens, and then histopathological examination was performed to analyze the changes of rat osteoarthritis disease.
RESULTS AND CONCLUSION: The mild erosion, ulcers wear, severe wear, osteophyte formation and other pathological changes were observed during articular cartilage degeneration in the experimental group at 2, 4, 6 and 8 weeks after operation. The articular cartilage score at 2, 4, 6 and 8 weeks after operation in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). The results showed that medial meniscectomy and medial collateral ligament transection can effectively establish the rat knee osteoarthritis model, and the pathological and morphological changes at 4 weeks after modeling are similar to the
performance of early human knee osteoarthritis, so the model is the ideal model to research the early osteoarthritis.

Key words: cartilage, joints, osteoarthritis, knee, joint instability, models, animal

中图分类号:

R318

张荣凯，杨禄坤，叶志强，吴兆亚，赵庆，蔡道章 . 以关节不稳建立的大鼠骨关节炎模型[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(37): 6628-6635.

Zhang Rong-Kai, Yang Lu-kun, Ye Zhi-qiang, Wu Zhao-ya, Zhao Qing, Cai Dao-zhang. Establishing a rat osteoarthritis model based on knee joint instability[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(37): 6628-6635.

图/表（结果） 9

2.1 造模后SD大鼠的基本情况 造模后0.5-1 h，所有大鼠苏醒，能自由活动右下肢，大鼠的饮食、活动、体质量增长等指标正常。所有大鼠造模后未见伤口感染及关节肿胀、步态不对称等异常状况。实验大鼠均无死亡。

2.2 造模后膝关节大体标本观察结果 对照组在造模后各时间点可见关节软骨面光滑如常，见图2。

实验组：术后1周，股骨髁及胫骨平台软骨面光滑如常，关节面无破损，见图3。术后2周，内侧股骨髁与内侧胫骨平台软骨表面稍显粗糙，极少部分关节面见轻微糜烂，外侧股骨髁与外侧胫骨平台光滑如常，见图4。术后4周，内侧股骨髁均见明显的软骨面轻度糜烂，少部分关节溃疡磨损，外侧股骨髁软骨面稍粗糙，外侧胫骨平台光滑如常，无骨赘形成，见图5。术后6周，内侧股骨前髁、后髁均见软骨面轻度糜烂，少部分关节面溃疡磨损，外侧股骨前髁见软骨面轻度糜烂，内侧胫骨平台明显关节面溃疡磨损，见图6。术后8周，内侧股骨前髁、后髁均见明显的软骨面糜烂、溃疡、磨损，外侧股骨前髁见软骨面明显糜烂，内侧胫骨平台关节面磨损严重，见骨赘形成，见图7。

2.3 术后膝关节病理切片观察结果

对照组：在术后各时间点见关节软骨表面光滑平整，细胞数目和软骨细胞排列正常,番红O-固绿染色均匀，见图8。

实验组：术后1周，软骨表面光滑平整，细胞数目和软骨细胞排列无明显差异,番红O-固绿染色不均匀，特别是表层软骨染色稍减退，但潮线尚完整，见图9。

术后2周，软骨表面见较多裂隙，有的甚至伸入辐射层，软骨细胞数量明显增多，结构开始有点紊乱，可见软骨细胞簇集，表层细胞变圆及其片状剥脱现象，浅层软骨面轻度破坏，见表层软骨变薄，部分关节面纤维组织覆盖，潮线部分断裂完整，见图10。

术后4周，看见局部关节表面软骨破坏至中层软骨，部分关节面软骨细胞脱落消失，直到钙化层和软骨下骨交界处，关节破坏区表层覆盖大量的纤维素，细胞数目整体明显增多，细胞簇集现象明显，潮线模糊断裂，见图11。

术后6周，见关节软骨破坏至钙化层和软骨下骨交界处，关节破坏区表层覆盖大量的纤维素，细胞数目减少，细胞簇集现象明显，潮线断裂，见图12；术后8周，见关节软骨破坏至软骨下骨层，软骨下骨外露，关节破坏区见纤维覆盖，极少软骨细胞残留，无潮线，见图13。

2.4 组织切片关节软骨Chambers评分 术后1，2，4，6，8周，实验组关节软骨评分为为0.481±0.279， 1.490± 0.968，2.433±1.559，3.625±1.787，4.096±1.785，对照组关节软骨评分为0.048±0.149，0.067±0.172， 0.067±0.172，0.202±0.248，0.250±0.252，实验组均明显高于对照组(P < 0.05)。

结果表明，关节软骨破坏程度随时间加长而趋向加重，见图14。

参考文献

引言

材料方法

设计：随机对照动物实验观察。

时间及地点：于2011年6月至2012年12月在中山大学动物实验中心、中山大学附属第五医院病理科完成。

材料：

实验动物和饲养条件：SPF级雄性SD大鼠购买于中山大学北校区，并饲养于中山大学北校区实验动物中心SPF级屏蔽环境中，饲养环境的温度(25±1) ℃，相对湿度(70±4)%，垫料为干木屑，每周平均更换2次。自由取食和饮水，昼夜节律按照12∶12进行。

建立大鼠骨关节炎模型所用主要材料、试剂与仪器：

实验方法：

造模方法：选取大小、体质量相似(8周龄，体质量200-250 g)雄性SD大鼠50只，分笼饲养2周，使其达到10周龄。术前1 d按体质量分层后随机分为实验组、对照组，每组25只。按3 mL/kg水合氯醛腹腔内注射麻醉，选取右膝关节，用刀沿髌韧带内侧缘切开皮肤，切口大约0.5 cm。切开关节囊，将髌骨向外侧脱位，用尖刀将内侧副韧带切断，并切除内侧半月板。用5-0可吸收线单独缝合关节囊，以5-0丝线间断缝合皮肤，见图1。对照组以同样的方法打开关节囊，但不行内侧副韧带切断及内侧半月板的切除，髌骨复位及生理盐水清洗伤口后关闭关节囊，缝合手术切口。术后肌注1次青霉素 (4×10⁷ U/L)1 mL抗感染，待SD大鼠清醒后曲马多 (10 mg/kg)止痛，分笼饲养，让其自由活动及进食。

取材：分别于造模手术后1，2，4，6，8周5个时间点处死10只大鼠(实验组、对照组各5只)，手术取右下肢，清除右膝关节周围的软组织及韧带等，取关节上下各 1 cm，并将股骨和胫骨分离，获取膝关节组织标本进行右膝关节的病理检查。

大体观察：病理取材后，在手术显微镜下进行大体观察，并用数码照相机记录。大体观察的主要内容有：关节面的光滑度及色泽，表面是否有裂隙，是否有软化、溃疡，软骨的缺损程度及软骨下骨是否裸露。

病理切片的制作、染色及观察：

标本的处理：大体观察结束后，将膝关节标本置于100 g/L多聚甲醛4 ℃固定48 h后，放入20%EDTA液于 4 ℃冰箱内脱钙4周，每3 d换脱钙液1次。常规脱水、浸蜡后包埋，沿膝关节矢状面切片，于每个关节内、外侧股骨髁与内、外侧胫骨平台4个部分每隔100 μm切片2次，各切取5 μm厚的病理切片(间隔100 μm)24张切片，其中每个平面的2张切片分别用于行苏木精-伊红及番红O-固绿组织学染色进行组织学观察。

组织切片关节软骨评分：每个关节取内、外侧股骨髁与内、外侧胫骨平台4个部分各12张切片，标本切片经番红O-固绿染色后，将病理切片置光镜下对其组织结构进行详细的观察，按Chambers评分标准进行评分^[13]：0分：正常软骨；0.5分：软骨正常，但软骨染色减弱。1分：关节表面平整，有少量纤维覆盖；2分：关节软骨浅层纤维组织覆盖，并且可见薄层软骨剥脱。3分：软骨层轻度磨损(小于20%全层软骨)；5分：软骨层中度磨损(20%-80%全层软骨)；6分：软骨层严重磨损(大于80%全层软骨)。

统计学分析：采用SPSS 16.0统计软件进行两组资料t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨性关节炎是一种复杂的多病因退变性关节疾病，对骨性关节炎的早期防治尤其重要^[14-18]。目前有关骨关节炎的研究常常采用培养细胞进行，但研究晚期人类骨标本常常难以阐述早期疾病所涉及的分子生物学机制，而且培养的细胞容易受培养环境影响，并不能真正的反映活体组织细胞功能改变，此外，获取足量的适合研究的早期骨关节炎的人类软骨下骨标本十分困难^[19-20]。因此，有关骨性关节炎早期疾病进程的相关研究多采用动物模型^[21-25]。

国内外很多学者在构建骨性关节炎的动物模型中作了很多的研究并取得可喜的成绩。利用狗、兔、大鼠、马、羊等动物通过手术、关节内注射等方法构建的骨性关节炎动物模型为人类研究骨性关节炎提供了重要的研究手段^[26-32]。动物模型具有同质性，其诱发骨性关节炎开始的时间点和疾病起因清楚，非实验影响容易控制，使研究更加地标准化随着骨性关节炎病程的进展，可以从放射学、组织学和分子改变上来研究疾病进程不同时间点的分子生物学变化，进而分析骨关节炎的分子机制，同时它还可以用于骨性关节炎干预治疗^[33-36]。

大鼠膝关节骨性关节炎模型最常使用，其具有体积小、价廉、易饲养、解剖及生理学特点与人类相似的特点，而且大鼠的基因组已明确并且与人类相似^[37-38]，可以利用该动物模型从基因水平研究入手研究骨关节炎疾病进程的不同时间点的分子机制变化^[39-41]。有研究表明，使用“内侧副韧带切断+内侧半月板切除”建立的膝关节骨关节炎模型在术后4周与人类的早期膝关节骨关节炎在病理、病生以及形态学改变等方面极为相似，而且诱导时间较短，且效果确实，成功率高^[42-43]。已有大量关于骨关节炎发病机制及病程干预研究中使用了该动物模型，Hayami等^[44]利用该动物模型发现二膦酸盐能通过影响软骨下骨延缓骨性关节炎的疾病进程。Stoop等^[45]利用前交叉韧带切断建立大鼠膝关节骨性关节炎模型，发现关节早期软骨破坏从关节软骨浅层开始，软骨Ⅱ型胶原降解产物明显增多。本方法是通过关节内手术途径，造成大鼠膝关节不稳定，导致关节生物力学紊乱，特别是软骨接触面显著异常，软骨接触面应力的异常增加和剪切力以及摩擦力异常造成软骨细胞磨损最终启动软骨的不可逆退变^[42,46-47]。有学者利用基因芯片研究了该动物模型的软骨、软骨下骨的基因改变，并发现了一系列与骨关节炎密切相关的基因表达及信号通路变化，揭示了该动物模型在骨性关节炎分子生物学研究领域的广泛应用前景^{[39, 48-49]}。

在实验中，尽管实验组术后1周大体标本关节面光滑如常，无破损，但病理组织检查以番红O-固绿染色方法显示关节软骨染色不均匀，特别是表层软骨染色减退，提示软骨细胞出现了极早期的改变。术后2周，实验组大体标本观察可见少部分关节面轻微糜烂，软骨细胞簇集，表层细胞变圆及其片状剥脱现象。到术后4周，关节软骨破坏慢慢加重。这样病理变化，显示出早期骨关节炎的典型病理表现。术后6，8周，关节软骨破坏明显加重，甚至软骨下骨外露，关节间隙变窄，显示出较晚期骨关节炎的典型病理表现。其骨性关节炎的表现及进程与前人的研究相符，而且随着造模时间延长，关节软骨退变程度呈现出从正常、轻度、加重的趋势，说明实验建立的模型很好地建立了关节软骨退变的病理变化过程^[42,50]。

实验研究使用的是大鼠骨性关节炎模型，其膝关节在生物力学上与人类有很大的差异，所以不能将动物模型研究情况完全等同于对骨性关节炎患者的研究^[38]。此外，实验造模方法本身所造成的创伤性滑膜炎及关节积血等均可能对研究骨性关节炎的病理进程、组织病理特征或软骨生化代谢的变化等造成一定的影响，而且，此模型更类似于人类创伤后(半月板损伤、交叉韧带损伤等)骨关节炎，并不是原发性骨关节炎最理想的动物模型^[39]。然而，相对于在研究人类标本中所涉及的伦理问题、样品量缺乏、标本的明显异质性、特殊部位的标本难以获取等诸多缺点，动物模型是很理想的研究工具。

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