干燥脱水保存鸵鸟脱细胞角膜基质载体材料的细胞毒性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.015

中国组织工程研究

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

干燥脱水保存鸵鸟脱细胞角膜基质载体材料的细胞毒性

刘先宁¹，朱秀萍¹，吴洁¹，王莉芳²，银勇¹

1陕西省眼科研究所，陕西省西安市 710002；2陕西省食品药品检验所，陕西省西安市 710002

收稿日期:2013-01-03 修回日期:2013-01-23 出版日期:2013-08-13 发布日期:2013-08-13
作者简介:刘先宁，女，1965年生，陕西省蓝田县人，汉族，2005年西安交通大学医学检验专业毕业，研究员，主要从事角膜干细胞及组织工程角膜的基础研究工作。 Lxn65@sina.com
基金资助:
陕西省科技统筹创新工程计划项目(2012KTCQ03-11)。

Cytotoxicity of dehydrated ostrich acellular corneal stroma as a carrier material

Liu Xian-ning¹, Zhu Xiu-ping¹, Wu Jie¹, Wang Li-fang², Yin Yong¹

1Shaanxi Institute of Ophthalmology, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China; 2Shaanxi Institute for Food and Drug Control, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China

Received:2013-01-03 Revised:2013-01-23 Online:2013-08-13 Published:2013-08-13
About author:Liu Xian-ning, Researcher, Shaanxi Institute of Ophthalmology, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China Lxn65@sina.com
Supported by:
Innovation Co-ordinator Project of Shaanxi Province, No. 2012KTCQ03-11*

摘要/Abstract

摘要：

背景：陕西省眼科研究所通过前期研究发现鸵鸟角膜具有开发成为人角膜材料替代品的优势。
目的：判断鸵鸟角膜基质支架材料对细胞的潜在毒性作用。
方法：采用细胞培养方法，将干燥脱水法保存的鸵鸟脱细胞角膜基质载体支架制备成浸提液与L-929细胞共同培养，采用MTT比色法评价其作用1，2，3 d，对细胞生长和增殖的影响。
结果与结论：干燥脱水法保存的鸵鸟脱细胞角膜基质载体支架浸提液组培养1，3，5 d，对实验细胞毒性反应级别均为1级。参照《中华人民共和国国家标准GB/T16886.5-2003》进行细胞毒性试验，供试品组见少量细胞呈圆形，疏松贴壁，无胞浆内颗粒，偶见细胞溶解。结合MTT法分析结果表明，采用干燥脱水法保存鸵鸟脱细胞角膜基质载体材料，细胞毒性为1级，为合格材料。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, 组织工程角膜, 角膜, 鸵鸟, 脱细胞角膜基质, 支架, 干燥脱水, 保存, 细胞毒性试验, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies from Shaanxi Institute of Ophthalmology have shown that ostrich cornea has the advantages to be developed into the alternatives of human corneal material.
OBJECTIVE: To determine the potential toxic effects of ostrich corneal stromal scaffold on cells.
METHODS: Cell culture methods were used to culture L-929 cells in the extracts of ostrich acellular corneal stroma which was dried and dehydrated. 3-(4,5)-Dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide assay was used to evaluate the growth and proliferation of cells after cultured for 1, 2 and 3 days.
RESULTS AND CONCLUSION: After the cells were cultured in the extracts of ostrich acellular corneal stroma subjected to dryness and dehydration for 1, 3 and 5 days, and the toxicity level of cultured cells was graded as level 1. The cytotoxicity test was conducted according to the “National Standard of the People's Republic of China GB/T16886.5-2003”. After cultured in the extracts of ostrich acellular corneal stroma, a small number of cells were round in shape and loosely adherent without intracytoplasmic granules, and cell lysis could be observed occasionally. The results of 3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide assay showed that the ostrich acellular corneal stromal scaffold which was dried and dehydrated had level 1 of cytotoxicity and could be considered as a qualified material.

Key words: tissue construction, cytology experiment in tissue construction, tissue-engineered cornea, cornea, ostrich, acellular corneal stroma, scaffold, dehydration, preservation, cytotoxicity test, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

刘先宁，朱秀萍，吴洁，王莉芳，银勇. 干燥脱水保存鸵鸟脱细胞角膜基质载体材料的细胞毒性[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.015.

Liu Xian-ning, Zhu Xiu-ping, Wu Jie, Wang Li-fang, Yin Yong . Cytotoxicity of dehydrated ostrich acellular corneal stroma as a carrier material[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.015.

图/表（结果） 3

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引言

角膜盲是世界主要的致盲眼病之一，角膜移植手术是治疗该病的惟一手段。据1991年WHO统计，世界上约有角膜病和眼外伤角膜致盲者1 000万人，每年新增病例约150万到200万。在中国角膜盲约占双眼盲患者的15.38%，共有约400万人^[1]。角膜移植术有两种，一种为全层角膜移植，另一种为板层角膜移植，相比较，板层移植植片存活率更高。并且多数情况下，患者的角膜内皮细胞完好，仅需要做板层角膜移植。但由于角膜供体材料匮乏，目前，中国每年仅能完成约3 000例角膜移植手术。因此，如何获取适用的角膜移植材料已成为眼科界亟待解决的关键问题。

近年来，国内外学者不断进行着对组织工程角膜材料的研究与探索^[2-8]。曾有学者试用胶原^[9-10]、人工合成材料和羊膜^[11]，但都因其本身固有的缺点，比如羊膜，虽具有半透明性、无抗原性, 可促使上皮黏附、生长、分化，抑制炎症、新生血管、纤维化等特性，曾被认为是工程化角膜上皮的最佳载体，但研究发现，羊膜本身的厚度较薄，极易降解无法适应于复杂的角膜移植如穿透性移植和眼压较高的病例，因而逐渐失去其在本领域的研究价值。在探索中发现，异种角膜基质作为组织工程角膜的载体，具有很多优点，为国内外尤其是国内近年来眼科组织工程材料研究的热点^[12-18]。

角膜基质层是构成角膜的主要成分，占角膜厚度的90%，它主要由纤细的胶原纤维、角膜细胞及细胞外基质所组成。角膜蛋白中，70%以上为胶原蛋白，国内王智崇等^[19]研究结果显示角膜三层结构中基质层免疫原性最低。经脱细胞及去除免疫原性物质后，保留了胶原纤维及弹力纤维，有助于角膜透明性状的保持和承受一定的眼内压，大体观察与正常角膜植片相似，苏木精-伊红染色观察处理后的角膜基质材料由许多胶原纤维结合而成。纤维均一、细小且排列整齐，纤维网隙明显增大，利于细胞的爬入生长和改建重塑。体外成功接种细胞后，细胞的增殖无明显变化，表明该材料的细胞相容性好，异种角膜材料来源广泛，生物相关性好，具有可降解性，良好的细胞生长界面，一定的可塑性和较佳的机械强度，角膜基质层缺损的修复主要由角膜基质细胞的增殖并分泌细胞外基质完成，因此构建生物工程活性角膜基质对角膜损伤的修复具有重要意义。

由于异种角膜基质具有免疫原性低、天然而整齐排列的胶原纤维，有望成为直接应用或构建生物角膜理想的载体材料之一，陕西省眼科研究所通过前期研究发现鸵鸟角膜具有开发成为人角膜材料替代品的优势。为了进一步了解材料的生物性，实验采用细胞培养的方法，将干燥脱水法保存的鸵鸟脱细胞角膜基质支架制备成浸提液与培养细胞共同培养，评价其对细胞生长和增殖的影响，以判断该种角膜基质支架材料对细胞的潜在毒性作用。

材料方法

设计：体外细胞毒性实验，采用MTT比色法评定。

时间及地点：于2010年3至6月在陕西省药检所药理实验室完成。

材料：

鸵鸟眼球: 陕西英考驼鸟股份有限公司提供。

细胞株：L-929细胞，购自解放军第四军医大学口腔生物室。

干燥脱水法保存鸵鸟脱细胞角膜基质的细胞毒性实验所用主要试剂及仪器：

实验方法：

鸵鸟角膜基质载体准备与保存：以无菌操作取出鸵鸟眼球，用1/10 000升汞溶液，生理盐水，2 000 U /mL庆大霉素液交替冲洗，刮除角膜上皮，剖切获取驼鸟角膜基质层，厚为200-400 μm，将角膜置于-80 ℃冰箱中，24 h后取出，室温下缓慢融解，待角膜完全融解后，再次置于-80 ℃冰箱，此冻融过程共重复3次；4 ℃下，无菌去离子水中充分溶胀角膜12 h；用含2.5 g/L胰蛋白酶、0. 2 g/LEDTA的Hank’s液37 ℃消化60 min去除残余的上皮及基质游离细胞。将处理好的角膜基质片放在一无菌平皿中，置于干燥器内，干燥器盖边缘涂凡士林悬紧密封，置室温干燥脱水，48 h后取出，在无菌条件下置于准备好的保存瓶内，加盖密封，用⁶⁰Co照射消毒。

供试品浸提液的制备：取上述采用胰蛋白酶联合干燥脱水法制备、并经⁶⁰Co照射消毒的鸵鸟角膜基质片 9 cm²，加入含有体积分数10%胎牛血清的1640培养 3 mL，于37 ℃培养箱中浸提24 h，经过滤除菌，制得。

阴性对照液：体积分数10%胎牛血清的1640培养基。

阳性对照液：64 g/L苯酚溶液。

5 g/L MTT溶液的配制：用前称取50 mg MTT，放入小烧杯中，加入10 mL PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)在电磁搅拌机上搅拌30 min，用0.22 μm的微孔滤器除菌，4 ℃保存，备用。

L-929细胞的消化及传代：取状态良好的L-929细胞一满瓶，弃去培养基后，加入2.5 g/L胰蛋白酶0.5 mL消化细胞，显微镜下观察，消化至细胞开始收缩，变园后加入培养基停止消化，用吸管吹打细胞后，传于新培养瓶中，加入新鲜培养基，传够所需要细胞数量后，待用。

细胞毒性实验方法：取3块96孔培养板，编号1^#、2^#、3^#，每块板分别加入100 μL的细胞混悬液(接种浓度为4×10⁷ L^-1)，置37 ℃体积分数CO₂培养箱中培养24 h。取出培养板，每块板分别加入6孔以下溶液：100 μL供试品浸提液(实验组)；100 μL新鲜培养液，作为阴性对照；100 μL苯酚溶液，作为阳性对照。24 h后取出1^#板，每孔加入20 μL的MTT溶液，置37 ℃培养箱中继续孵育4 h，然后小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入200 μL二甲基亚砜，振荡10 min，选择490 nm波长测定吸光度，第3、5天分别取出2^#、3^#板，同1^#板操作，分别测定各孔吸光度。

RGR%=实验组平均吸光度/阴性对照组平均吸光度值×100

结果评定标准：参照《中华人民共和国国家标准GB/ T16886.5-2003》及相关文献进行细胞毒性试验评估^[20]，实验结果为0或1级为反应合格；实验结果为2级的应结合细胞形态分析，综合评价；实验结果为3-5级反应为不合格。

主要观察指标：①鸵鸟角膜基质载体的状态。②传代培养后正常L-929细胞的形态。③不同时间点实验组、阴性对照组、阳性对照组细胞的相对增殖度。④参照国家标准GB/T16886.5-2003细胞毒性试验结果。

讨论

目前组织工程化材料已广泛用于骨科、神经外科、心内科等临床医学领域，但在眼科，尤其是在眼表重建中大部分材料还停留在动物试验阶段。

人工生物角膜的研究是当今国内外眼科学研究的热点，角膜上皮干细胞培养技术已相对成熟，但由于内皮细胞扩增效率低，培养体系还不够成熟，尤其是人角膜内皮细胞的体外扩增问题至今国内外仍没有突破，成为全层人工生物角膜构建的瓶颈。从临床应用角度来看，组织工程化角膜并不一定需要具有全部3层结构，有时仅需板层组织或单纯的角膜上皮、基质或内皮组织。因而，技术的关键在于寻找合适的载体支架材料。

支架为角膜各层细胞的生长增殖提供三维空间和新陈代谢的环境。Terada等^[21]描述了组织工程支架材料的基本特征: 具有一定的生物降解速度、良好的生物相容性和细胞亲和性、一定的力学性能、特定的三维结构, 能灭菌消毒。人工生物角膜支架材料还应同时具有一定的透明性、屈光力, 对光线散射作用小, 可以使光线透过并屈折成像等特性。

人工生物角膜支架材料主要分三大类：人工材料，如聚羟基乙酸、聚乳酸、合成胶原；复合材料，聚乳酸和聚羟基乙酸、胶原和硫酸软骨素、胶原和壳聚糖等；天然材料，羊膜、胶原、角膜去细胞基质。

人工合成的高分子材料聚羟基乙酸作为第一批可降解材料已被美国FDA批准用于临床。在角膜组织工程方面,将角膜基质细胞接种于聚羟基乙酸，移植于兔角膜基质板层内, 8周后角膜逐渐恢复透明，组织学结构接近正常基质组织^[22]。同时，以聚乳酸羟基乙酸为载体种植兔角膜内皮细胞，获得单层兔角膜内皮细胞。这些材料支持细胞黏附分化，在体内降解为乳酸或羟基乙酸，吸收和代谢机制明确，具有可靠的生物安全性。但是这些材料的酸性降解产物会对细胞的活性产生不利影响，引起无菌性炎症反应。

人工合成的复合材料如聚乳酸羟基乙酸，是聚羟基乙酸的共聚物，二者均为可降解聚合物，具有降解过程可控制、重塑性好、机械强度高、生物相容性好等优点。

余克明等^[23]研究发现，在体外角膜基质细胞能与聚乳酸羟基乙酸牢固结合，并能在其上生长，材料对细胞无毒性。将细胞聚乳酸羟基乙酸复合物移植到新西兰白兔角膜基质层间后，开始混浊，移植1周后，复合物的透明度逐渐增加。聚乳酸羟基乙酸在活体角膜部位的降解始于术后1个月，可能由于聚乳酸羟基乙酸降解产物乙醇酸和乳酸的作用，会出现角膜新生血管，同时由于新生血管向中央长入聚乳酸羟基乙酸，聚乳酸羟基乙酸的降解速度加快，约4个月时聚乳酸羟基乙酸完全降解，新生血管逐渐消退。裂隙灯及组织切片检查证明，虽然聚乳酸羟基乙酸降解的过程伴随着新生血管的增生，但聚乳酸羟基乙酸周围的角膜组织始终保持透明，无任何水肿和免疫排斥反应发生。结果表明，聚乳酸羟基乙酸作为组织工程学细胞支架材料具有组织相容性好、无毒、低免疫原性和可降解的特性，但它在降解过程中会刺激周围新生血管的产生，影响角膜的透明度，因此不是一种合适理想的支架材料。

天然材料羊膜是胎盘膜的内层、呈半透明的膜样组织，是人体最厚的一层基底膜，共分5层，由内向外依次是上皮细胞层、基底膜、实质层、纤维母细胞层和海绵层，而经过处理的羊膜仅有基底膜和实质层，无抗原性，具有碱性成纤维细胞生长因子等生长因子，具有IV 和V型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白和各种整合蛋白，可以提供细胞生长所需要的物质，促进细胞的黏附、分化和生长增殖；还具有抑制炎症反应的作用。羊膜作为组织工程化角膜上皮细胞的载体，已经应用于临床治疗眼表疾病并取得了一定的成效。Koizumi等^[24]以羊膜为基质培养兔正常眼角膜缘干细胞，14 d 融合；继续培养1个月，将其自体移植于眼表损伤的患眼，5 d 内患眼角膜完全上皮化并与结膜上皮相连。Ishino等^[25]以羊膜为支架培养人角膜内皮细胞，将其移植于去除后弹力层和内皮细胞层的兔角膜的裸露基质面，人角膜内皮细胞可以成活并保持功能和大体形态。Espana等^[26]以羊膜为载体培养人角膜基质细胞，在原代和传代培养过程中基质细胞能保持树枝状的形态和出现细胞间的拉网现象，经Western blot和RT- PCR检测，基质细胞体外表达角膜蛋白多糖keratocan。

羊膜具备来源广、制备成本低等优点，是一种较成熟的组织工程支架材料，但是有传播疾病的潜在危险和处理不当引起羊膜损坏的可能。另外羊膜本身的厚度较薄，极易降解，无法适应于复杂的角膜移植如穿透性移植和眼压较高的病例。

异种角膜基质是一种天然结构，具有以下优点^[27]：①基质本身免疫原性很小，脱细胞后更小，残留的微量抗原不足以诱发排斥反应。②角膜基质内含有多种细胞因子，虽经物理或化学方法处理，仍有部分保留，这样的微环境有利于上皮及基质细胞的生长和增殖。③抗拉力强、可以缝合。④动物实验证实可以透明愈合。⑤异种基质移植后，基质细胞可以重新长入,且排列有序。⑥动物实验结果提示,受主的角膜神经可以长入被移植的角膜基质。⑦可以按需要塑形。

根据上述优点，利用脱细胞猪角膜基质作载体,取受主角膜缘小部分上皮细胞，以脱细胞的异种角膜基质为载体，在其上进行培养，成为载有受主角膜上皮细胞板层角膜供体，有望用于治疗角膜表层难治之疾。Amano^[28]及很多学者提出异种角膜基质,尤其是猪角膜基质有良好的材料界膜，抗原性低，动物实验可以透明愈合,有望成为替代来源匮乏的人类角膜基质和成为体外构建组织工程角膜较为理想的材料^[29-32]。

总体来讲，复合材料和角膜去细胞基质是目前研究的热点，有望成为良好的人工生物角膜支架材料，为人工生物角膜的构建解决难题。

尽管目前国内外异种角膜支架材料研究较多的是猪角膜，但通过实验研究发现，猪角膜比人角膜厚，并且电镜下前板层基质结构与人的相比排列相对紊乱。而鸵鸟角膜与人角膜厚度，电镜下的板层结构更接近，并且它复水后透明性，韧性与猪相比效果更好。这就预示鸵鸟角膜基质具有良好的研究及应用前景。为去细胞鸵鸟角膜基质的产业化开发奠定了坚实的基础。

鸵鸟是世界上最大的陆栖鸟类，是鸟类种系的第一个分支种属。体型高大,颈长，成年鸵鸟身高2.5-3.0 m，体质量可达150 kg。食草野生动物，热带、亚热带、温带的湖泊、沙滩、河滩、荒滩及半山坡的荒山草地，均适合其生长。鸵鸟有极快的奔跑速度，最大步伐可达 4 m，时速可达80 km，是马的数倍^[33]。为了适应这种快速移动，它的视锐度及视觉分辨率是很高的，鸵鸟在刚孵化时是近视，到第7天发展成轻度远视，7 d以后很快转为正视眼和很小的屈光不正，这使得它的视力发育在所有动物中独一无二^[34]。

作者研究鸵鸟角膜基质载体的理由是：①鸵鸟的眼睛及其占头颅的比率是陆地上的脊椎动物中最大的，它的角膜大约是人角膜的3倍，它的视锐度及视觉分辨率很高。②鸵鸟角膜韧性较强，抗拉力强大，不易发生溶解，干燥脱水法保存角膜基质复水后透明性好。③通过测定发现鸵鸟的角膜曲率半径内皮细胞计数和人角膜极相似。④有研究显示鸵鸟-兔板层角膜移植在早期能完全保持透明,未观察到超急性排斥反应的发生,无感染、层间积血、层间积液、崩线情况出现，未发生溶解^[35]。⑤本所在培养成功角膜缘干细胞的基础上，首次以干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质为载体成功的构建了兔角膜上皮组织^[36]，奠定了以干燥脱水法保存鸵鸟角膜基质作为组织工程支架材料的基础。

为了更进一步研究材料的生物相容性，安全性，作者采用干燥脱水法保存的去细胞角膜基质载体进行细胞毒性试验。

理想的载体必须具有良好的生物相容性。首先无细胞毒性，不会诱发细胞变异与凋亡。细胞毒性试验定义为“用细胞培养方法，进行毒理学风险评价”，细胞毒性是由于生物组织工程支架材料与细胞膜、细胞器(细胞线粒体或脂质体)、蛋白质合成、DNA合成和细胞周期、DNA顺序等方面相互作用而产生的，这样可以测定细胞的活性和死亡，以及对细胞功能和遗传毒性。ISO10933制订的标准中通过3种形式进行评价：浸提液试验、直接接触试验和简接接触试验。

细胞毒性试验是一种在体外状态下，模拟生物体生长环境，检测生物医用材料及制品或其浸提液对细胞溶解、细胞死亡、抑制细胞生长和其他毒性作用的方法。

在ISO10093-5：1999中该项试验可分为浸提液方式法、直接接触法和间接接触法3种。目前，绝大多数医疗器械及材料是通过浸提液来进行检测的。其中MTT比色法是目前最常用的浸提液试验，通过材料的浸提液与培养细胞广泛接触，可分析材料中各组成成分及其浓度对细胞的毒性影响。比色法的基本原理是存在于活细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶能脱下琥珀酸的氢原子，而死细胞没有这一性质，黄色的MTT接受氢原子。还原成蓝色的甲臢结晶，用二甲基亚枫溶解，在波长490 nm下，用酶标仪测定反映甲臜量的吸光度值，就能定量反映细胞数与细胞活性的变化。MTT比色法因其检测所需的细胞量相对较少，实验步骤相对简便，误差小，检测周期短等优点，是一种常用的细胞毒类药物体外细胞毒性试验的测定方法^[37]。

实验采取浸提液试验对干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质片进行细胞毒性试验，其结果符合国家相关标准，奠定开发该材料的安全性。并为进一步以其为载体构建生物角膜提供了研究基础。

干燥脱水保存鸵鸟脱细胞角膜基质载体材料的细胞毒性

Cytotoxicity of dehydrated ostrich acellular corneal stroma as a carrier material

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