双重复合糖基转移酶的ABO基因启动子CpG岛甲基化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.015

中国组织工程研究

• 器官移植基础实验 basic experiments of organ transplantation • 上一篇下一篇

双重复合糖基转移酶的ABO基因启动子CpG岛甲基化

喻琼，苏宇清，甄建新，邓志辉

深圳市血液中心，广东省深圳市 518035

收稿日期:2013-02-01 修回日期:2013-03-13 出版日期:2013-07-30 发布日期:2013-07-30
通讯作者: 邓志辉，博士，主任技师，深圳市血液中心，广东省深圳市 518035
作者简介:喻琼★，女，1971年生，江西省南昌市人，汉族，2004年中山大学毕业，硕士，主任技师，主要从事输血医学、免疫遗传学的研究。 yuqiong7867@yahoo.com.cn
基金资助:
深圳市科技计划重点项目(201001021)。

Methylation of CpG island in ABO gene promoter coding glycosyltransferase with dual donor specificity

Yu Qiong, Su Yu-qing, Zhen Jian-xin, Deng Zhi-hui

Shenzhen Blood Center, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China

Received:2013-02-01 Revised:2013-03-13 Online:2013-07-30 Published:2013-07-30
Contact: Deng Zhi-hui, Doctor, Chief Technician, Shenzhen Blood Center, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China zhihui_deng@yahoo.com.cn
About author:Yu Qiong★, Master, Chief Technician, Shenzhen Blood Center, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China yuqiong7867@yahoo.com.cn
Supported by:
Key Science and Technology Planning Project of Shenzhen, No. 201001021*

摘要/Abstract

摘要：

背景：在ABO血型抗原的研究中，绝大多数样本是相同的ABO基因表达出正常的相同的ABH抗原。但有一定数量的样本表现出具有相同分子遗传背景但表达出来的抗原强度却随着家系\个体不同而有所差异，说明了ABO血型中复杂的表达调控机制。分析一类罕见的双重复合型标本的ABO血型血清学与基因背景情况，深入表观遗传学的研究，有利于部分揭示ABO基因表达机制。
目的：探讨双重复合型ABO糖基转移酶表达相关的ABO基因启动子CpG岛甲基化水平与ABH抗原表达的关系。
方法：6例经血型血清学定为CisAB或B(A)型的标本，进行ABO基因编码区全长序列和启动子序列的测定，采用重亚硫酸盐处理法检测ABO基因启动子CpG岛甲基化程度。
结果与结论：6例双重复合AB型的标本中，在B101等位基因基础上存在nt803C > G突变的2个CisAB05/B(A)06等位基因，在ABO启动子CpG岛区域两者在nt-33(30%)、nt+27(50%)、nt+49(50%)具有甲基化差异；在A101等位基因序列的基础上存在nt803C > G突变的2个CisAB01等位基因，在ABO启动子CpG岛区域两者在nt-26(10%)位置有甲基化差异；在B101等位基因基础上存在nt640A > G突变的2个B(A)04等位基因ABO启动子CpG岛，在nt-33(10%)、nt+16(50%)、nt+57(60%)、nt+59(60%)、nt+68(60%)和nt+74(60%)位有甲基化差异。全部的6例标本ABO基因启动子区域DNA序列无任何突变异常。结果提示在相同的ABO遗传基因背景下，ABO基因启动子CpG岛区域某些位点甲基化可能影响ABH抗原在红细胞膜表面的表达。

关键词: 器官移植, 器官移植基础实验, ABO血型, 正反定型不符, ABO基因, 双重复合糖基转移酶, 启动子, 序列测定, 多态性, CpG岛, 基因甲基化, 表观遗传

Abstract:

BACKGROUND: During the research of ABO blood type antigen, the overwhelming majority samples of same ABO gene express a normal and same ABH antigen. But a certain amount samples with the same ABO genetic background show different antigen intensity expression as for different family or individuals. The ABO blood type has complex expression regulation mechanism. Analysis of ABO blood group serology and genetic background of these rare bi-specific AB phenotype specimens, and further studying on epigenetics may partly revealed ABO gene expression mechanism.
OBJECTIVE: To study methylation of CpG island and explore the relationship between ABO gene promoter coding glycosyltransferase with dual donor specificity and ABH antigen expression.
METHODS: Six samples detected as CisAB or B(A) phenotype were studied in this paper. The whole code sequences and promoter sequence of ABO gene were amplified respectively. The level of CpG methylation in promoter of ABO gene was further detected with bisulfite treatment method．
RESULTS AND CONCLUSION: Among the six bi-specific AB phenotype samples, two previously-identified CisAB05/B(A)06 alleles with nt803C > G on the basis of B101 allele sequence could be seen, and three additional methylated sites nt-33(30%), nt+27(50%) and nt+49(50%) were found between the two regions of CpG island in promoter of ABO gene. Two CisAB01 alleles with nt803C > G mutation on the basis of A101 sequence were found at nt-26C(10%). Other two B(A)04 alleles contained nt640A > G mutation on the basis of B101 sequence were found in the whole code sequences regions, and six additional methylated sites nt-33(10%), nt+16(50%), nt+57(60%), nt+59(60%), nt+68(60%) and nt+74(60%) were found between the two samples. No abnormity was identified in the promoter region of ABO gene. Our results indicated that the differential methylation levels in the CpG island of ABO gene promoter region may affect ABH antigens expression on the red cell membrane even if the samples had the same ABO genetic background.

Key words: organ transplantation, basic experiments of organ transplantation, ABO blood type, ABO blood grouping discrepancies, ABO gene, glycosyltransferase with dual donor specificity, promoter, sequence analysis, polymorphism, CpG island, gene methylation, epigenetics

中图分类号:

R318

喻琼，苏宇清，甄建新，邓志辉. 双重复合糖基转移酶的ABO基因启动子CpG岛甲基化[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.015.

Yu Qiong, Su Yu-qing, Zhen Jian-xin, Deng Zhi-hui . Methylation of CpG island in ABO gene promoter coding glycosyltransferase with dual donor specificity[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.015.

图/表（结果） 4

2.1 血型血清学定型结果 6例标本分为3组，第1组标本1的ABO血型定为正常的AB型。这个家系是由于做新生儿溶血病检查时发现新生儿的血型为AB型，母亲的血型为O型，父亲的血型为AB型。新生儿与父母亲之间的血型违反了ABO血型系统的孟德尔遗传规律，进一步进行家系调查的。标本2的ABO血型鉴定中，与抗A单克隆反应呈现弱凝集，而与人源多克隆血清反应呈现阴性，符合经典B(A)型的定义，定为B(A)。
第2组标本3红细胞与抗B血清反应呈弱凝集，血浆中含有抗B抗体，定为ABw。标本4正定是AB型，反定中发现有抗A1抗体，可定为A2B型。
第3组标本5与标本4相同的反应，定为A2B型，标本6红细胞与抗A血清反应呈弱凝集，定为AwB型。见表2。

2.2 六个样本的ABO基因分型和ABO等位基因的序列分析见表3。

经与A101标准序列比对，6个标本的ABO基因启动子区域序列无异常。ABO基因编码区全长序列测定，第一组标本1为CisAB05/O02型，标本2为B(A)06/O02型，CisAB05和B(A)06等位基因结构相同，均是在B101等位基因基础上核苷酸803位G替代C突变而成，编码的是BBBA型糖基转移酶，新等位基因Genbank注册号DQ407740。第二组标本中，标本3为 CisAB01/O02，标本4为CisAB01/B101，均含CisAB01等位基因；第三组标本中，标本5和6都含有一个新等位基因(Genbank注册号DQ323501)，是在B101等位基因基础上核苷酸640位A > G。文章涉及到的双重复合ABO糖基转移酶的基因序列特异性(SNPs)，见表3。
2.3 六个样本ABO基因启动子CpG岛甲基化检测结果共检测ABO基因启动子及附近的37个CpG岛甲基化位点，见图1。

第1组标本，标本1挑取的10个克隆测序后，有5个，4个，5个，6个，8个克隆序列分别在12，14，20，36，37位出现C残基甲基化，甲基化程度分别为50%，40%，50%，60%，80%；标本2在12、14、20、23、31，33，36，37位出现甲基化，甲基化程度分别为20%，10%，40%，30%，50%，50%，50%，50%，标本2比标本1的甲基化多3个位点，即在nt-33、nt+27、nt+49。两者nt-33位测序图谱见图2。
第2组标本，标本4的10个挑取的克隆株测序后，在ABO基因启动子及附近CpG岛37个位点中均未检出甲基化，标本3在24位(10%)检出即是在ABO基因nt-26位检出C残基部分甲基化。
第3组标本，标本5在1(10%)、33(10%)位检出甲基化，标本6在1(10%)、23(10%)、29(50%)、34(60%)、35(50%)、36(60%)、37(60%)多个位点出现甲基化，标本6与标本5比较，是在ABO基因启动子nt-33、nt+16、nt+57、nt+59、 nt+68、nt+74检出CpG岛中C残基部分甲基化。
这3组标本中，每组标本的甲基化位点不同，其ABH抗原表达亦不同，标本2的A抗原表达明显弱于标本1的A抗原表达，标本3的B抗原表达明显弱于标本4的表达，标本6的A抗原表达明显弱于标本5的A抗原表达。

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引言

ABO血型抗原作为人体分布最广、抗原数量最多、相对分子质量最大的抗原，是输血医学中最为重要的血型系统，是实体器官移植中的主要组织相容性抗原。它不仅表现在红细胞上，还广泛存在于不同的人体分泌黏液中[1]。ABO抗原在不同的胚胎分化和细胞分化中有着显著变化，与许多疾病的发生发展、安全输血、新生儿同种免疫性疾病、骨髓和器官移植、临床肿瘤以及法医学、人类学和医学遗传学等有密切关系。
人类ABO基因位于染色体9q34.1-34.2，ABO基因包含长度大小从28-688 bp不等的7个外显子和长度约为 19 514 bp的6个内含子，调控区域大约总长为18- 20 kb[2-3]，其基因产物是糖基转移酶，这些酶控制ABO血型抗原的生物合成。A和B等位基因编码一个长为354个氨基酸的蛋白质，短N端、疏水跨膜区、长C端催化区构成的Ⅱ型转膜糖基转移酶。ABO抗原的化学结构是糖蛋白，其血清学特异性取决于糖链末端3个糖基的结构。
目前已了解大约有200多个糖基转移酶，涉及到ABO血型抗原及它们变异型的构成[4-7]。A型个体带有α-3-N-D-氨基半乳糖转移酶，将N-乙酰半乳糖加在H物质的岩藻糖末端上，产生A抗原特异性。B型个体带有α-3-D-半乳糖基转移酶，将半乳糖加在H物质糖末端产生B特异性。AB型个体带有A和B两种糖基转移酶，因此红细胞上同时有A和B抗原。O型个体不具有A酶和B酶，不能生成A或B抗原，细胞上只有H抗原。ABO血型系统是用来研究基因遗传、酶(糖基转移酶)、糖基变化(碳水化合物)、免疫学(血清)4个不同生物水平的极好模式。
Cis-AB和B(A)表型是ABO血型中最为特殊的型别，在生物学中具有非常鲜明的特点。随着分子生物学技术的发展，对人类ABO血型基因及糖基转移酶的深入分析，发现Cis-AB和B(A)表型的分子基础极其相似，互为交错，把这两种以前认为血清学反应有所不同即异常表达原因不同的血型归为一类，称为双重复合糖基转移酶AB血型。较其他人种，cis-AB表型在亚洲人种较为常见，系统性研究复合型ABO糖基转移酶的分子基础和抗原表达将对临床输血、器官移植、法医鉴定都具有重要意义。
从1993年发现第一种双重复合型基因，20年间共有12个cis-AB或B(A)基因陆续被报道[8-13]。作者所在实验室于2007年在国际上首先提出双重复合AB型的概念[7]，在中国人群中发现了6种双重复合ABO等位基因，其中ABO*B(A)04、B(A)05,B(A)06/cis-AB05为国际上首报。而且作者在多例不同的抗原表达中发现了相同的ABO分子生物学基础，其中包括一个多达8人家系，有个别B(A)型与部分B型人源血浆发生反应，且在吸收放散实验中，B型红细胞可吸收单克隆抗A血清，而常常被错定为AxB型。有的B(A)型的B抗原反应性并没有增加，而是减弱。这些均与经典的CisAB或B(A)型定义不符。因此鉴定和解释ABH抗原弱表达的基因水平外，调控因素显得非常重要。
已报道的文献与课题组多年积累的研究结果发现：一定数量的标本表现出具有相同分子遗传背景但表达出来的抗原强度却随着个体不同而有所差异[14-18]。A和B分子表达水平随着个体的不同、家系的不同而有所不同。包括作者所在的实验室在内，发现为数不少的双重复合AB型的基因序列相同但是抗原表达不同；或者是抗原表达格局相同但是AB型基因序列不同。ABO血型中双重复合AB型的分子遗传背景有待进一步深入研究，双重复合AB型的表达调控机制尚为空白。
文章对课题组以往发现的6个具有双重复合糖基转移酶AB型的标本，进行ABO基因启动子区域CpG岛甲基化的检测，现报道如下。

材料方法

设计：观察实验。

时间及地点：实验于2008年2月至2012年10月在深圳市血液中心完成。

材料：

标本来源：常规ABO血型检测样本中，收集4例中国汉族无偿捐血者，以及4例临床送检的相关血液样本(其中包括一个3人祖孙家系，由于来自同一家系，血型血清学反应结果相同，考虑为相同的遗传背景，在研究中选取第2代的标本1例)。选取这6例标本，ABO血型鉴定困难，进一步进行ABO基因检测。6例均为健康成人，年龄18-40岁，其中女性2例，男性4例。根据血库操作规程，采集静脉全血，其中5 mL干燥管血样用于ABO反定型，5 mL EDTA或枸椽酸抗凝血用于ABO正定型、基因组DNA的抽提。

血型血清学检测所需主要试剂：单克隆抗A和抗B(上海血液技术公司)，多克隆抗A和抗B(效价128,成都蜀宝)，双花扁豆抗A1(Dominion Inc, Nova Scotia,加拿大)，单克隆抗AB(Immucor，Houston，TX美国)和多克隆抗AB(人类混合血清)，植物凝集素抗H(Immucor,Norcross 美国)。用于反定型A、B、O型试剂红细胞(上海血液技术公司)。

实验方法：

血型血清学检测：所有样本进行ABO血型鉴定。常规的方法有：①正向红细胞检测：用已知抗体的标准血清检查红细胞上未知的抗原。②反向血清检测：用已知血型的标准红细胞检查血清中未知的抗体。

ABO基因编码区全长序列与ABO基因启动子区域序列测定：运用快速盐析法从全血白膜层抽提基因组DNA，DNA质量浓度50-100 mg/L。纯度为1.60-1.90。分段扩增ABO基因7个外显子，引物设计参照GenBank已公布的血型序列(AY845133)，使用Oligo 5.0软件设计6对引物，见表1。引物由上海生工所合成。其中第1对引物可检测ABO基因的启动子和第1外显子区域^[19]。PCR反应体系为20 μL，各成分的终浓度分别为：Mg²⁺1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq酶1 U，引物5 pmol/L，样品DNA 100-200 ng。

应用ABO-1，2，3，4引物对ABO基因前5个外显子进行PCR扩增，反应条件为；95 ℃10 s； 94 ℃ 20 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，10个循环；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25个循环；72℃ 5 min。应用ABO-5引物扩增第6外显子PCR反应循环参数为：94℃ 3 min；94 ℃ 60 s，58 ℃ 60 s，72 ℃ 1.5 min，35个循环；72 ℃ 5 min。应用ABO-6引物扩增第7外显子PCR反应循环参数为：95 ℃ 10 min；94 ℃ 60 s，63 ℃ 1.5 min，72 ℃ 60 s，10个循环；94 ℃ 60 s，61 ℃ 1.5 min，72 ℃ 60 s，25个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物使用Montage PCR Centrifugal Filter Devices(Millipore公司)纯化，配成25-30 μL的DNA测序模板。使用循环测序试剂盒(Big Dye Terminator Cycle sequencing Kit 3.1，美国ABI公司)直接测序，PCR扩增反应体系为10 μL，各成分为引物3.2 μL，纯化产物1 μL，ddH₂O 1.8 μL，测序液(BigDye^® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit) 4 μL。反应条件是95 ℃预热10 min，然后96 ℃10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 4 min进行25个循环，进入4 ℃。测序引物与扩增引物相同，正、反方向通测。扩增产物使用醋酸钠纯化，加入变性液，ABI3730 DNA测序仪检测、SEQ ANA5.3软件分析结果。ABO基因启动子及第1外显子及部分第1内含子序列使用Genbank:NG006669比对，第2外显子至第7外显子，包含相应内含子序列使用Genbank:AJ336122比对。

ABO基因启动子CpG岛甲基化检测：用重亚硫酸盐处理基因组DNA：用MethylCode™ Bisulfite Conversion Kit(美国Invitrogen公司)对样本基因组DNA进行处理，在20 μL(约500 ng)的DNA样品中加130 μL的CT转换试剂，混匀后在PCR仪上进行以下程序：98 ℃ 10 min，64 ℃ 2.5 h，4 ℃放置20 h。在制备管中加入600 μL的Binding buffer，以及经CT转换试剂处理的DNA样本，均匀后，12 000×g离心30 s，弃收集管中的滤液。加入 100 μL Wash buffer，12 000×g离心30 s，弃滤液；加入200 μL Desulphonation Buffer，室温放置15-20 min， 12 000×g离心30 s，弃滤液；加入200 μL Wash buffer，12 000×g离心30 s；最后将制备管置于干净的1.5 mL离心管中，在制备管中加入10 μL的Elution buffer，12 000×g离心30 s，洗脱DNA的收集液在1.5 mL离心管中供表观遗传学研究。

Bisulfite处理后CpG岛的PCR扩增：参照Genbank AC000397序列，使用Primer 5.0软件设计原则：将全基因组的C全部替换成T，生成新的不含C的序列，针对目的片段的位置按常规方法来设计引物。正链：5'-TTG TTG GGT GTA TTT TGT ATT TT-3'；反链：5'-AAC CCC AAA ATA CCA AAA CCA C-3'。PCR反应体系采用50 µL体系，内含10×PCR Buffer 5 µL，10×PCR Enhancer 5 µL，Mg²⁺ (50 nmol/L) 2 µL，PCR引物(2 pmol/L)各2 µL，dNTP(10 mmol/L)1 µL，Bisulfite处理的DNA 1 µL，Taq DNA聚合酶(5 U/µL)0.5 µL，ddH₂O 34 µL。于ABI 9700PCR仪中运行以下参数：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35 cycles；72 ℃ 10 min。取PCR产物稀释20倍, 取1 µL做为模板，进行第二轮扩增，体系、PCR程序与第一轮相同。

克隆测序：1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，然后用凝胶回收试剂盒对目的PCR产物进行回收纯化。 PCR回收产物经pMD18-T Vector(Takara公司)载体连接、转化。从平板挑取多个克隆先做PCR鉴定，确定是已插入目的基因的单克隆方可进一步扩大培养，用于质粒小提和进行测序。测序引物与PCR引物一致：正链 (M13-48): 5'-GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG-3'，反链 (M13-47)：5'-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3'。测序反应以质粒为模版，其他与常规的测序一样。由于目标基因长度为384 bp，所以只需要单向测序。每个样本的PCR产物随机挑选10个阳性克隆测序检测，BIQ Analyzer软件分析。

主要观察指标：抗原抗体反应强度，ABO基因编码区DNA序列，ABO基因启动子DNA序列，ABO基因启动子甲基化后DNA序列。

讨论

ABO血型中Cis-AB的经典定义是：Cis-AB细胞上A抗原经常是A₂，B抗原表达弱，血清中总是有弱的抗B抗体；所含的H物质与A₂细胞所含的H物质相当。B(A)型的实验血清学概述是：一些高反应能力的单克隆抗体抗-A试剂能与某些B型细胞发生弱凝集。随着这两种血型报道不断出现，ABH抗原表达呈现很大的差异：表达有正常强度的，也可能是镜检可见的弱凝集表达，而实验中也发现有个别的B(A)型可与部分B型人源的血浆发生反应，且在吸收放散实验中，B型红细胞可吸收单克隆抗A血清，有的B(A)型的B抗原反应性并没有增加，而是减弱。经典的血清学血型分类受到挑战，现已知道这两个血型在ABO基因分子基础上可以用相同的理论来解释^[20-21]。

1993年首先在日本人群Cis-AB表型个体中发现一种基因^[22]，它能编码一种即有催化N-乙酰基半乳糖(A抗原表位)到H抗原活性又有催化半乳糖(B抗原表位)到H抗原活性的糖基转移酶，是处于A和B基因之间的一种基因，编码的酶定为AAAB酶型。到目前为此，国际权威的血型抗原基因突变资料库^[23]已有12个Cis-AB或B(A)基因被报道，包括6个B(A)等位基因和6个Cis-AB等位基因。已报道的双重复合型基因均是在常见的A基因或B基因中，发生一个或二个碱基突变，发生变异的基因编码一种特殊ABH糖基转移酶，它可将N-乙酰氨基半乳糖加在H前体物质上，也同时将半乳糖加在H物质糖末端上，这样在红细胞表面表达出来的A抗原就有了一些B抗原的性质，B抗原有一些A抗原的性质。

从众多的报道可知，双重复合AB型中A、B抗原同时表达已从ABO基因编码区核苷酸序列的分子基础找到其遗传机制，但是A和B分子表达水平因家系、个体的不同而不同，双重复合AB型抗原表达的调控机制尚为未知。

ABH抗原表达是由一系列复杂的细胞事件构成：前体糖基对抗原的影响；糖基转移酶与包括起始子、终止子等翻译因子对抗原的影响；转移酶在高尔基器体中的定体；编码区序列、mRNA转录结构以及调控区域(启动子、转录因子、增强子、Chi序列、CpG岛、转录结构中的甲基化/去甲基化等)的控制。在ABH抗原表达研究方面，由于绝大多数人群的ABH抗原表达正常，运用目前检测技术检查个体之间的表达差异存在困难。而近期某些肿瘤导致ABH血型物质减少的现象已引起关注，国际上对于ABH抗原表达的研究对象均是疾病患者^[24-25]。研究发现ABO血型与许多疾病的发生发展相关，在各类癌症中常常发现A和B抗原缺失表达或ABH血型物质减少，而且研究还进一步证实了ABO抗原的缺失先于肿瘤的转移，多种恶性肿瘤中血型抗原的异常表达状态与其恶性程度、转移和预后等生物学行为有关^[26-27]。

有关研究分别从ABO基因的杂合性和ABO基因启动子甲基化程度二个层面进行疾病与抗原表达相关性的研究^[28-30]。排除了基因的杂合性可能影响ABH抗原表达，肿瘤形成过程中ABO基因启动子CpG岛甲基化/非甲基化与ABH抗原不表达/表达关系的分子机制研究进一步深入。DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳原子共价键结合一个甲基基团，DNA甲基化后核苷酸顺序未变，而基因表达受影响。在正常的细胞中CpG通常是处于非甲基化状态，启动子的超甲基化引起的基因沉默等这些表观遗传的改变影响着肿瘤发展的各个阶段，几乎所有的人类肿瘤中都存在相关基因的异常甲基化^[31-33]。因此相关基因的甲基化状态被认为是一种有前景的分子生物标志物。

2005年Chihara等^[34]研究结果发现：ABO基因的表达受到近端启动子甲基化程度影响：膀胱癌患者甲基化程度越高，ABO基因的表达就越不活跃，从而导致A、B抗原的表达减少。国内2008年徐华等^[35]研究白血病患者发现，均出现不同程度的A、B抗原减少，健康人和再生障碍性贫血患者在ABO基因启动子的CpG岛区没有甲基化的位点，而急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)和部分骨髓增生异常综合征(MDS)患者在位置为-102、-101、-100、-99和-97的C碱基均有甲基化的现象。

作者认为，针对恶性疾病患者的ABH抗原表达进行ABO基因启动子区域CpG岛DNA甲基化/非甲基化研究的科研思路，可以解决排除基因组DNA层面的影响，对ABH抗原表达强度不同的标本进行表达调控方面的研究。但是由于表达过程复杂，疾病发生发展过程中是否有别的因子因素影响ABH抗原的表达，还有待进一步探讨。

文章独辟蹊径，研究的对象不是各类疾病患者，而是利用自己科研优势，积累6个B(A)或CisAB型的正常健康人群的标本，分成3组研究。每组的标本，在具有相同的ABO基因编码序列的分子遗传基础上，抗原表达呈现不同：正常强度A或B抗原表达的同时有弱反应的A或B抗原表达。在这些宝贵的标本上，深入探讨ABH抗原表达与ABO基因启动子区域CpG岛DNA甲基化/非甲基化关系。

标本1和标本2所含的基因为ABO*CisAB05/B(A)06，另外一条单倍体为O02等位基因，标本2的A抗原表达明显弱于标本1的A抗原表达，2个标本在基因组DNA编码区的结构是完全相同的，而标本2与标本1的甲基化位点比较，区别是标本2在ABO基因启动子CpG岛中nt-33、nt+27、nt+49位的C残基部分出现甲基化，甲基化程度高达30%-50%。标本3的B抗原表达明显弱于标本4的表达，区别在nt-26 C残基部分甲基化，但由于标本3和标本4所含的基因ABO*CisAB01相同，而另外一条单倍体，标本3为编码截短无功能糖基转移酶的O02等位基因，而标本4为B101等位基因，这是否存在竞争作用^[36]，导致B抗原表达正常，需深入研究。标本5和标本6所含的基因为ABO*B(A)04，另外一条单倍体均为O01等位基因，2个标本在基因组DNA编码区的结构是完全相同的。标本6的A抗原表达明显弱于标本5的A抗原表达，区别是标本6在nt-33、nt+16、nt+57、nt+59、 nt+68、nt+74位6个位置有部分甲基化，甲基化程度为10%-60%。抗原减弱的标本2与标本6均在nt-33位C残基出现甲基化。

从上结果提示，ABO基因启动子CpG岛中某些C残基的甲基化可能影响ABH抗原在红细胞表面的表达，甲基化程度越高，抗原表达减弱。由于此类标本来源较少，因此今后需继续积累该类标本，且应进一步在体外功能性研究证实，以期深入阐明ABO抗原表达调控的分子机制。

双重复合糖基转移酶的ABO基因启动子CpG岛甲基化

Methylation of CpG island in ABO gene promoter coding glycosyltransferase with dual donor specificity

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