跟腱移植物与不同大小骨隧道匹配重建前交叉韧带

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：前交叉韧带是维持膝关节稳定性的重要解剖结构，前交叉韧带重建后的腱骨愈合质量与临床功能康复一直备受关注。
目的：探讨在前交叉韧带重建术中采用相同直径的移植物与不同大小骨隧道相匹配，用组织学方法观察移植物肌腱与周围骨壁的愈合情况，同时用生物力学的方法检测其功能恢复情况。
方法：取犬自体中1/3跟腱作为前交叉韧带移植物，修整为相同直径4 mm。16只成年雄性杂交犬随机数字表法平均分配到4个组，完整切除前交叉韧带，于股骨和胫骨止点处分别制备胫骨、股骨隧道，直径分别为5，4.5，4，3.5 mm，并移植入待用跟腱链接于骨隧道内。重建后6周时，按常规麻醉处死实验犬，收集手术区域组织与器官，作解剖、苏木精-伊红染色组织学观察、生物力学检测及进行统计学分析。
结果与结论：前交叉韧带重建后6周，解剖观察移植物与骨隧道生长未见各组明显差异；苏木精-伊红染色发现腱骨愈合界面出现sharpey样纤维连接，3.5 mm骨隧道组胶原纤维较其他组致密有序；同时3.5 mm移植物生物力学检测结果优于同期各组。结果提示，在前交叉韧带重建中，减小与移植物匹配的骨隧道直径，使其肌腱与骨隧道之间紧密压配，能提供更加稳定的细胞生物学和力学环境，加快腱骨愈合界面的形成和改造，提高腱骨愈合质量。

关键词: 器官移植, 组织移植, 前交叉韧带, 骨隧道, 重建, 移植物, 骨隧道, 腱骨愈合

Abstract:

BACKGROUND: Anterior cruciate ligament is the important anatomic structure to maintain the knee joint stability. The tendon bone healing and clinical functional recovery after anterior cruciate ligament have attracted more attention.
OBJECTIVE: To observe the healing of graft tendon and surrounding bone with histological method through the same diameter grafts matching with the bone tunnel of different sizes in the anterior cruciate ligament reconstruction surgery, and to detect the functional recovery with biomechanics.
METHODS: Middle 1/3 of canine autologous tendon was selected as the anterior cruciate ligament graft, and then trimmed into the same diameter of 4 mm. Sixteen adult mongrel canine were randomly divided into four groups. The anterior cruciate ligament was resected completely, and the tibial and femoral tunnels were prepared on the end sites of tibia and femur with the diameters of 5, 4.5, 4 and 3.5 mm, then implanted into the tendon in prepared and linked into the bone tunnel. At 6 weeks after reconstruction, the experimental canine were sacrificed under general anesthesia to collect the tissue and organs in the surgical area. Then the hematoxylin-eosin staining, biomechanical testing and statistical analysis were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: At 6 weeks after anterior cruciate ligament reconstruction, anatomical observation showed that there were no significant differences in growth of grafts and bone tunnels between groups; hematoxylin-eosin staining showed sharpey-like fibronectin could be seen in the tendon bone healing surface, and the collagen fibers in the 3.5 mm bone tunnel group were more compact and regular than those in the other groups; the biomechanical testing results in the 3.5 mm bone tunnel group were better than those in the other groups. The results indicate that during anterior cruciate ligament reconstruction, decreasing the diameter of bone tunnel that matched with grafts in order to make the tendon and the bone tunnel closely matched can provide a more stable cell biological and mechanical environment, accelerate the formation and transformation of tendon-bone healing interface, and can improve the quality of tendon-bone healing.

Key words: organ transplantation, tissue transplantation, anterior cruciate ligament, bone tunnel, reconstruction, graft, bone tunnel, tendon-bone healing

中图分类号:

R318

杨晓，王跃，吕波. 跟腱移植物与不同大小骨隧道匹配重建前交叉韧带[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.007.

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cruciate ligament reconstruction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.007.

图/表（结果） 3

2.1 参与者数量分析术后1只犬麻醉未能苏醒后死亡，予以补充。其余动物在观察期间存活好。观察6周，最后均进入结果分析。
2.2 大体观察各组移植后6周时，关节腔内前交叉韧带均有明显滑膜包裹；各组直径均较正常前交叉韧带增粗；关节液清亮。5 mm骨隧道组1例6周的标本，股骨外侧髁近内侧及相应胫骨平台部分有软骨损伤表现，表面失去正常光泽，部分崩裂，可见软骨下骨。其余各组标本未见有半月板和软骨损伤表现。
2.3 组织学情况正常前交叉韧带与骨的连接点具有典型的4层结构。第1层是韧带本身，第2层是未矿化的软骨区，第3层是钙化的软骨区，在这个区，纤维软骨矿化并且插入至第4层软骨下骨板。其中在纤维软骨和钙化软骨之间有“潮线”相隔。
前交叉韧带重建6周时，移植物与骨隧道之间的愈合界面由含有新生毛细血管的肉芽组织和胶原纤维形成。5，4.5 mm骨隧道组骨隧道与移植物间距大，愈合界面中胶原纤维数量少。4 mm骨隧道组骨隧道与移植物接触较好，愈合界面sharpey样纤维连接增多。3.5 mm骨隧道组移植物与骨隧道结合紧密，编织骨和移植物间的愈合界面其他组更加致密，可以见到更多的sharpey样纤维连接，但排列还不规则，见图2。

5，4.5 mm骨隧道组腱骨愈合界面中还存在一些血管组织，胶原纤维排列无序，类软骨样细胞数量较少，分布零乱。4 mm骨隧道组腱骨愈合界面的胶原纤维数
量含量增加，排列也更加有序。3.5 mm骨隧道组腱骨之间的sharpey样纤维连接致密有序，大片编织骨转化成板层骨，基质中的类软骨样细胞有排列成行的趋势，但未观察到分区和“潮线”形成。见图3-5。

2.4 生物力学情况移植物重建后 6周时，每组标本的移植物均从骨隧道中拖出，腱骨愈合界面发生撕脱。6周时，各组标本生物力学测试数据分别为5 mm骨隧道组(67.16±8.2) N，4.5 mm骨隧道组(71.82±12.06) N， 4 mm骨隧道组(93.94±14.26) N，3.5 mm骨隧道组(113.62±15.58) N，在移植物重建后6周时，3.5 mm骨隧道组腱骨愈合力学强度优于其他3组，4 mm骨隧道组腱骨愈合力学强度优于5，4.5 mm骨隧道组。除了5，4.5 mm骨隧道组之间差异无显著性意义外，其余各组间比较，均有显著性意义。见图6。

2.5 不良反应及并发症实验中未出现感染，移植物排斥等不良反应。

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引言

膝关节前交叉韧带损伤是常见而严重的运动创伤之一。前交叉韧带撕裂引起膝关节不稳，治疗不当将严重影响或丧失运动能力。前交叉韧带损伤后的治疗一直是骨科和运动医学领域内重要的研究课题。过去治疗的方法有韧带断端缝合法、关节外动力重建和关节内静力重建等多种方法。但是，由于前交叉韧带血供较差，韧带断端缝合难以保证韧带的愈合，且瘢痕修复的韧带力学性能差，不能满足稳定膝关节的功能^[1]。随着人们生活方式的改变和一些体育运动的发展，前交叉韧带损伤已经成为骨科运动医学研究的热点问题。现代科学研究证明，前交叉韧带断裂后愈合能力很差，如果不早期恢复其正常功能，可导致膝关节不稳，载荷传导紊乱，继发半月板、软骨损伤，加快关节退行性改变，影响运动功能。关节镜下前交叉韧带重建，重建后创伤小，功能恢复快，是目前前交叉韧带重建的“金标准”术式^[2-3]。
重建移植物主要包括自体和异体组织以及人工韧带，目前应用最多的还是自体腘绳肌腱和骨-髌腱-骨。前交叉韧带重建移植物固定后与骨之间达到良好的生物愈合，最大限度地恢复移植肌腱的力学特性，早期恢复膝关节功能，是手术获得成功的关键之一^[4-5]。已有报道表明，骨隧道直径大于肌腱时，会明显降低腱骨愈合质量，同时也有报道提示报告腱骨间隙增大会延长其愈合过程^[6]。
在国内外的研究中，目前还未见前交叉韧带重建时，骨隧道直径略小于肌腱，对腱骨愈合情况观察的报告^[7]。关节内前交叉韧带重建的手术中，采用比肌腱直径略小的骨隧道，希望可以减小骨隧道内肌腱的微动，增加肌腱与骨隧道之间的愈合接触面积，改善隧道内肌腱的应力分布，消除腱骨之间的滑液“死腔”，提高腱骨固定效果，促进生物愈合。达到前交叉韧带重建手术后早期活动和康复锻炼，提高前交叉韧带重建手术的远期疗效^[8-10]。
前交叉韧带是膝关节的核心稳定结构，具有制导膝关节生理活动并限制非生理性活动的功能。前交叉韧带断裂后愈合能力很差^[11-13]，如果不早期恢复其正常功能，可导致膝关节不稳，载荷传导紊乱，继发半月板、软骨损伤，加快关节退行性改变，影响运动功能。因此前交叉韧带损伤后除个别由于关节稳定性尚好可以进行非手术治疗外，多数患者需要接受前交叉韧带重建手术治疗^[14-16]。
前交叉韧带重建手术后，移植物结构开始削弱的环节是移植物与骨的固定，而不是移植物本身的强度[17-18]。已有研究证明移植物在骨隧道内的运动、关节液渗入、滑膜包裹、非特异炎症反应、不良的隧道位置、应力遮挡和激进的康复计划等会显著降低腱骨愈合的质量[19]。在国内外的研究中，目前还未见前交叉韧带重建中，骨隧道直径略小于肌腱，对腱骨愈合情况观察的报告。实验在关节内前交叉韧带重建的手术中减小与移植物匹配的骨隧道直径，肌腱与骨隧道之间紧密压配，希望能够提供更加稳定的生物和力学环境，加快腱骨愈合界面的形成和改造，提高腱骨愈合质量。达到前交叉韧带重建手术后早期活动和康复锻炼，提高前交叉韧带重建手术的远期疗效。

材料方法

设计：随机对照动物犬实验。

时间及地点：于2012年6至12月在四川省医学科学院四川省人民医院动物研究所完成。

材料：

实验动物：16只本地成年雄性杂种家犬，体质量(10.0±0.7) kg，常用大动物骨科手术器械，由四川省医学科学院动物中心提供。

股骨和胫骨端皮质骨螺钉：骨科手术专用，购于武进第三医疗器械厂，直径3.5 mm，为钛制皮质骨螺钉，生物相容性良好。

实验方法：

前交叉韧带自体移植物制备：常规实验犬麻醉后，行后肢踝关节后方正中纵行切口，长约3 cm，截取中1/3跟腱组织，在起止点处切断，修剪多余组织后，用测孔器测量，将其直径修整为4 mm，见图1。后于术中测量骨隧道长度，制成与其等长的拟用肌腱移植物，其两端分别用手术线丝线双锁边缝合，生理盐水纱布覆盖待用。

前交叉韧带重建过程：

双膝关节手术：术前30 min肌肉注射速眠新(长春畜牧大学生产)，0.1 mL/kg麻醉。常规术前操作，行膝关节前内侧切口，同时暴露髌骨使其向外脱位，切除部分髌前脂肪垫，自前交叉韧带的股骨和胫骨止点处完整切除前交叉韧带。切除前交叉韧带后，沿原前交叉韧带走行方向，在胫骨止点处钻取胫骨隧道。同样地方法，在股骨外侧髁前交叉韧带止点处向上、外钻取股骨隧道。

骨隧道制备：将16只狗随机数字表法平均分配到4个组钻取不同直径的骨隧道，分别为5 mm，4.5 mm，4 mm，3.5 mm，同时在术中分别测量骨隧道和关节腔内前交叉韧带长度，制备与隧道等长的肌腱移植物。

移植物内固定：在股骨隧道外口的上方和胫骨隧道外口的下方，各置于入1枚直径2 mm的皮质骨螺钉，随即将待用的移植物植入骨隧道内，重建韧带两端通过缝线分别固定于胫骨、股骨螺钉上。生理盐水冲洗关节腔，常规缝合关节囊，关闭切口。

移植后与解剖观察处理：移植后每只犬肌注40×10⁴ U青霉素，不予外固定，分笼饲养，移植后3 d内观察进食、切口和一般活动等情况。每只犬膝关节移植重建后6周处死，清除膝关节周围其他组织等，解剖观察前交叉韧带后重建后半月板和软骨等的修复与愈合情况。

苏木精-伊红染色方法：收集腱骨愈合标本，用体积分数10%甲醛固定和EDTA脱钙，石蜡包埋，常规苏木精-伊红染色，制片与分析。

生物力学测试：①按测试要求修整标本，去处周围其他组织，将自重建前交叉韧带韧带关节腔内中央横断，骨隧道方向作单轴拉伸实验。②设备：WDW-50微机控制电子万能试验机(中国，长春朝阳机械制造公司)。③方法：常温下解冻标本后，加载速度2 mm/min，应力下降100%停止加载；测试期间用生理盐水保持样品湿润。

主要观察指标：①大体解剖学观察。②腱骨愈合的组织学观察。③生物力学情况。

统计学分析：采用SPSS 10.0统计软件分析，组间t 检验，P < 0.05时为差异有显著性意义。

讨论

3.1 前交叉韧带重建后腱骨愈合机制的研究重建前交叉韧带的目的在于恢复其解剖形态和生理功能，重建后前交叉韧带的止点愈合对于恢复韧带的生理功能非常重要^[20-22]。正常前交叉韧带止点是典型的直接止点，以韧带与骨软骨的结合为特征，包括4个区，即：韧带、纤维软骨、钙化纤维软骨和骨组织^[23]。理想的前交叉韧

带重建后，其止点应恢复这些结构以确保功能^[24]。

在实验中，观察前交叉韧带重建6周时发现，不同直径骨隧道的腱骨愈合模型中均可见韧带与骨隧道间充满疏松结缔组织，形成与骨组织相连的胶原纤维，胶原纤维排列紊乱。Kaplan认为，此期主要为出血期和细胞增殖阶段，血凝块内的各种因子影响炎性反应的起始阶段。血凝块变为多血管组织，通过毛细血管网的重新分布实现血管化^[25-27]。Weiler等^[28-30]研究表明在山羊前交叉韧带重建后，骨隧道中形成的纤维组织在20-52周后会转变为典型的与正常解剖相似的四层结构。在整个实验中，没有发现腱骨之间直接愈合的现象。这可能与移植物固定方式、术后观察时间和动物手术模型不同有关。

3.2 改变骨隧道直径对腱骨愈合影响的研究实验观察中发现6周时，骨隧道直径比肌腱直径偏小组(3.5 mm骨隧道组)，腱骨愈合质量在组织学观察和生物力学测量结果中均明显优于其他组。在同一标本中，骨隧道内口的愈合质量往往好于中段和外口。实验分析这些现象可能和以下一些因素有关：

移植物在骨隧道内的活动：移植物在骨隧道内的活动有两种表现方式，即蹦极效应和雨刷效应。许多学者认为，这种微动很可能是导致前交叉韧带重建术后骨隧道扩大的主要因素^[31-34]。实验中3.5 mm骨隧道组肌腱和骨隧道接触紧密，提供了较好的初始固定强度，阻止了术后肌腱在骨隧道中的活动，有利于腱骨愈合界面的形成和改造。

移植物的应力分布：实验中观察到腱骨愈合质量在骨隧道内口处优于隧道远端，这与Yamakado等^[35]和Rodeo等^[36]的报道一致。在隧道入口处，腱骨界面的接触应力大于隧道远端的应力，使隧道入口处界面的新生骨和胶原含量多于隧道内。3.5 mm骨隧道组高质量的腱骨愈合，可能与肌腱与骨隧道之间紧密接触，受到挤压，肌腱承受到更多的压应力有关。

关节滑液的作用：前交叉韧带重建术后在膝关节液中表达的白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子等多种骨吸收相关细胞因子、骨形成蛋白以及一氧化氮与骨道扩大效应密切相关^[37-38]。这次实验的5，4.5 mm骨隧道组，由于肌腱的直径小于骨隧道，肌腱与骨组织间接触不佳、存在间歇，有可能成为了关节滑液进入骨隧道并存留的“死腔”，严重影响腱骨愈合的质量。

移植肌腱与骨隧道接触面积：Tien等^[39]认为移植物的直径比骨隧道直径小时，彼此之间的接触面积小，不利于腱骨愈合界面的形成。实验3.5 mm骨隧道组移植物肌腱直径略大于骨隧道，可以增加肌腱与骨隧道之间的接触面积，缩短连接距离，改善肌腱的顺应性，提高初始固定强度，加快腱骨愈合。

实验结果提示，在前交叉韧带重建中，减小骨隧道直径，肌腱与骨隧道之间紧密压配，可以提供更加稳定的生物学和力学环境，有利于腱骨愈合界面的形成和改造，加快腱骨愈合速度，提高腱骨愈合质量。由于本实验仅是动物模型研究，在人体重建前交叉韧带手术中，肌腱移植物与不同直径骨隧道匹配后的作用，还有待进一步的临床研究。