锌离子改善骨质疏松状态下钛植入体的稳定性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.29.006

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (29): 5296-5302.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.29.006

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锌离子改善骨质疏松状态下钛植入体的稳定性

林威¹，李旭东²，唐贶昀¹，胡静¹

¹四川大学华西口腔医院颌面外科，口腔疾病研究国家重点实验室，四川省成都市 610041；²浙江大学医学院附属邵逸夫医院下沙院区口腔科，浙江省杭州市 310018

收稿日期:2012-12-15 修回日期:2013-01-08 出版日期:2013-07-22 发布日期:2013-07-22
通讯作者: 胡静，教授，四川大学华西口腔医院正颌及关节外科，四川省成都市 610041 drhu@vip.sohu.com
作者简介:林威☆，男，1986年生，四川省邛崃市人，汉族，四川大学在读博士，主要从事骨内植入体研究。15982193296@163.com
基金资助:
国家自然科学基金项目(81070869)

Zinc ions improve the stability of titanium implants under the condition of osteoporosis

Lin Wei¹, Li Xu-dong², Tang Kuang-yun¹, Hu Jing¹

¹Department of Oral and Maxillofacial Surgery, West China Hospital of Stomatology, State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; ²Department of Stomatology, Xiasha Hospital, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310018, Zhejiang Province, China

Received:2012-12-15 Revised:2013-01-08 Online:2013-07-22 Published:2013-07-22
Contact: Hu Jing, Professor, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, West China Hospital of Stomatology, State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China drhu@vip.sohu.com
About author:Lin Wei☆, Studying for doctorate, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, West China Hospital of Stomatology, State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China 15982193296@163.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81070869*

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究表明，锌可通过调节成骨细胞活性起到改善骨质疏松状态下骨对钛植入体反应的作用。
目的：观察锌离子对改善骨质疏松状态下钛植入体稳定性的作用。
方法：摘除28只雌性SD大鼠卵巢，饲养12周获得骨质疏松效果，后随机分为2组，实验组于双侧股骨干骺端植入含锌羟基磷灰石涂层的钛植入体，对照组于双侧股骨干骺端植入羟基磷灰石涂层钛植入体。两组分别随机选择3只大鼠进行双重荧光标记，于术后6周末计算矿物沉积率；术后12周末，两组分别随机选择4只大鼠进行植入体及其周围组织组织形态学分析；术后12周，对两组剩余大鼠行推出实验，计算最大推出力与最大剪切力。
结果与结论：荧光标记检测发现在术后3-5周，两组中植入体周围均有活跃的骨生成，实验组矿物质沉降率显著高于对照组(P < 0.05)。两组中均可见新骨形成，但实验组新骨形成量、骨面积比率、骨-植入体接触率、最大推出力及最大剪切力均优于对照组(P < 0.05或P < 0.01)。表明锌离子在去势大鼠骨植入体中具有促进骨生成和改善植入体稳定性的作用。

关键词: 生物材料, 组织工程口腔材料, 锌离子, 钛植入体, 骨整合, 骨质疏松, SD大鼠, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Zinc can improve bone reaction to titanium implants through regulation of osteoblast activity under the condition of osteoporosis.
OBJECTIVE: To study the zinc ions effect on improving the stability of titanium implants under the condition of osteoporosis.
METHODS: After removal of the ovary, 28 female Sprague-Dawley rats presented with osteoporosis symptoms for 12 weeks and then, they were randomly divided into two groups. Two kinds of titanium implants with (experimental group) or without zinc (control group) were inserted into the bilateral femoral metaphysis longitudinally in the ovariectomized rats, separately. Three rats were selected from each group for double fluorescence labeling examination. Mineral apposition rate was calculated at postoperatively 6 weeks. Another four rats were selected from each group for histomorphometry analysis at postoperatively 12 weeks. Biomechanical test was in the remaining rats in the two groups to calculate the maximum push-out force and maximum shear force at 12 weeks postoperatively.
RESULTS AND CONCLUSION: The double fluorescence labeling examination revealed that the mineral apposition rate was improved in the experimental group as compared with the control group (P < 0.05). New bone formation occurred in the two groups. However, larger new bone amount, higher bone area ratio and bone-to-implant contact were detected in the experimental group (P < 0.05 or P < 0.01). The maximum push-out force and maximum shear force were also superior in the experimental group to the control group (P < 0.05 or P < 0.01). These findings indicate that zinc ions are capable of promoting bone formation and improving implant fixation in ovariectomized rats.

Key words: biomaterials, tissue-engineered oral materials, zinc ions, titanium implants, osseointegration, osteoporosis, Sprague-Dawley rats, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

林威，李旭东，唐贶昀，胡静. 锌离子改善骨质疏松状态下钛植入体的稳定性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(29): 5296-5302.

Lin Wei, Li Xu-dong, Tang Kuang-yun, Hu Jing. Zinc ions improve the stability of titanium implants under the condition of osteoporosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(29): 5296-5302.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物生长存活情况 在两次手术中共有3只大鼠因麻醉并发症而死亡，其中对照组2只，实验组1只。其余大鼠均存活至实验结束或计划处死日，整个观察期伤口无明显炎症，无感染，切口愈合良好。所有动物饲养期间行动正常，未见明显跛行或后肢运动异常。

2.2 钛植入体涂层材料化学元素检测结果 含锌羟基磷灰石组中各元素相对原子浓度见表1。

X射线光电发射分光镜检查显示，羟基磷灰石组及含锌羟基磷灰石组钛植入体涂层材料的主要组成元素均为Ca、P、O、C(含锌羟基磷灰石组还包含Zn)，见图1。

2.3 双重荧光标记分析结果 通过荧光标记分析发现，从第3-5周两组均有明显的新骨形成。两组标本在荧光显微镜下均可见清晰的黄色荧光带(四环素带)和绿色荧光带(钙黄绿素带)，见图2，3。

两条荧光带间距离：实验组>对照组，矿物沉降率：实验组为1.20 μm/d，对照组为0.94 μm/d，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.4 生物力学检测结果 与对照组相比，实验组最大推出力显著增加(P < 0.01)，相应的最大剪切力也显著增加(P < 0.05)，见表2。

术后12周时，实验组与对照组骨面积比率分别为33.7%，27.3%，组间比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见图5A；第12周末，含实验组骨植入体接触率51.9%也显著高于对照组33.1%(P < 0.01)，见图5B；这些结果均表明锌离子可以加强植入体周围尤其是与植入体表面直接接触区域的骨生成。组织形态学结果见图6，7，实验组中可见更多的新骨形成。

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引言

骨内植入体植入技术作为矫形外科与口腔种植学中常见的一种恢复与重建手段，已逐渐被人们广泛接受。钛植入体具有良好的机械性能和生物相容性，可以在患者骨内形成理想的骨质量，以及良好的骨整合能力，能够很好地满足临床需求。然而由于基础条件较差，某些患者在钛植入体植入后常常不能获得满意的临床效果。有关研究显示，系统性疾病如骨质疏松症(主要临床表现为骨量与骨密度的降低)是造成骨植入体预后不良的常见原因之一^[1-3]。随着中国社会逐步步入老龄化，骨质疏松症的患病率也逐渐提高，因此有必要对骨质疏松下的骨内植入体植入进行深入研究。

极佳的细胞活性与随着矿化作用而逐渐变得紧密的种植体周围骨基质是获得良好骨整合的关键^[4]。在骨整合过程中除了成骨细胞之外，破骨细胞等其他细胞的参与也是必不可少的。植入体骨整合过程大致可分为植入初期伴随着出血与炎症的骨吸收，以及此后的骨生成两个阶段^[5]。骨内植入后早期，由于异物的刺激，种植体周围出现较明显的单核巨噬细胞系统介导的炎症反应，这些细胞在发生吞噬作用后释放出大量的炎症递质，如白细胞介素1、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α，诱导破骨细胞聚集、分化、活化^[4-7]，进而引起骨植入体界面周围骨吸收的发生。因此，可以认为骨整合的形成依赖于成骨细胞与破骨细胞共同介导的骨更新过程，而骨整合的程度则与骨更新过程中成骨细胞的成骨量超过破骨细胞破骨量的多少关系密切。

金属基体表面涂层生物材料的研究已开展20多年，其中钛基表面制备羟基磷灰石涂层是最常见的一种，其存在的主要问题是涂层和基体的界面结合不牢固和涂层内部的残余应力。目前认为通过对涂层组成和结构设计的改进来改善涂层结合强度和稳定性是决定羟基磷灰石涂层钛植入体性能的关键^[8]。

锌作为一种人体必需的微量元素，具有刺激成骨细胞成骨，促进矿化，刺激破骨细胞凋亡等作用，许多骨骼畸形、胎儿期及出生后骨生长迟缓均与锌缺乏有关。有研究表明，锌是一种生物活性元素，可通过调节成骨细胞活性起到改善骨对钛植入体反应的作用^[9-10]。陈海军等^[9]的一项随机对照实验在40只家兔双侧胫骨近心端各植入1枚钛植入体，建立钛种植体动物模型，分为补锌组和对照组，此后通过注射方式每日给补锌组动物补锌并在不同时间点处死动物研究其植入体骨融合情况，结果发现补锌能够在钛种植体植入后1-4周内加速种植体-骨界面的新骨形成，促进种植体骨愈合。

由此看来，将锌用于钛植入体表面改性以提高钛植入体在骨内的稳定性应该具有一定可行性。实验旨在观察经含锌羟基磷灰石改性的钛植入体相比羟基磷灰石改性的钛植入体在卵巢摘除大鼠中是否具有更强的骨整合能力。

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年10月至2012年7月在四川大学口腔疾病研究国家重点实验室完成。

材料：

实验动物：3月龄健康雌性SD大鼠28只，平均体质量200 g，由四川大学华西动物实验中心提供，许可证号：SYXK(川)2009-045。

锌离子改善骨质疏松状态下钛植入体稳定性实验的主要试剂与仪器：

实验方法：

植入体设计：由四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心将市场上购回之的Ⅱ级商业纯钛加工成杆状(长12 mm，直径1.1 mm)样本。样本经喷砂、酸蚀后于乙醇和去离子水中进行超声清洗。

植入体涂层的制备：将预处理好的钛植入体随机分为含锌羟基磷灰石和羟基磷灰石两组，采用溶胶-凝胶浸涂技术使两组植入体分别获得含锌羟基磷灰石和羟基磷灰石表面涂层。含锌羟基磷灰石表面涂层制作大致流程为：①将分析纯Ca(NO₃)₂•4H₂O+Zn(NO₃)₂•6H₂O和P₂O₅分别溶于无水乙醇中以获得Ca+Zn前体(摩尔比9∶1)及P前体。经过24 h回流后，将两种前体溶液混合[摩尔比(Ca+Zn)/P=1.67]制成浸渍溶液。②采用浸渍提拉法将经过预处理的样本浸入浸渍溶液中并以 8 cm/min的速度进行提拉。浸渍结束后样本在150 ℃下干燥15 min，再于800 ℃下熔结60 min，便可获得含锌羟基磷灰石涂层。最后，重复以上沉积过程2次，以获得接近1 μm的涂层厚度^[11-12]。实验中Zn在涂层中替换Ca的比例为10%。羟基磷灰石涂层制作在上述步骤中不加入Zn(NO₃)₂•6H₂O。
涂层材料化学元素分析：使用X射线光电发射分光镜检查测定羟基磷灰石涂层和含锌羟基磷灰石涂层的化学组成以及相应元素(如Ca、P、Zn)的浓度。测定时将Mg-Kα X射线(1 284.6 eV；12 kV×9 mA)与钛植入体成90°方向投照，透射深度为10 nm。

骨质疏松大鼠模型的建立：取SD大鼠28只，于室温 25 ℃，湿度55%环境中，自由摄取自来水及啮齿类动物食物，适应性饲养2周。所有大鼠均在全麻下(水合氯醛75 mg/kg+盐酸二甲苯胺噻嗪5 mg/kg)进行双侧卵巢摘除手术，术后继续饲养12周，采用双能X射线吸收测定法检测大鼠骨密度，确定骨质疏松模型建立成功。

钛植入体植入手术：12周后，将28只大鼠随机分为2组，每组14只。全麻下(水合氯醛75 mg/kg+盐酸二甲苯胺噻嗪5 mg/kg)行双侧股骨干骺端(远心端)钛植入体植入手术，实验组植入含锌羟基磷灰石涂层钛植入体，对照组植入羟基磷灰石涂层钛植入体，术中严格执行无菌原则。所有手术大鼠术前给予青霉素肌注，术后继续予青霉素肌注3 d。

双重荧光标记实验：于两组实验动物中分别随机选取3只大鼠进行双重荧光标记试验。在术后3周末对选取大鼠皮下给予四环素30 mg/kg，术后5周末皮下给予钙黄绿素15 mg/kg。

术后6周末，全麻下处死已行标记的大鼠，将植入体连同其周围骨组织一并取出。获取的标本经固定、脱水后，包埋于甲基丙烯酸甲酯中，使用切片机垂直于植入体纵轴方向在骨骺板上方3 mm水平切片(每个标本选取3张切片)，初始切片厚200 μm，然后磨片至40 μm。利用荧光显微系统对切片进行荧光显微检测并拍摄照片，所得照片用图像分析仪进行分析。测量两条标记带之间的宽度(400倍放大率)，并以此计算矿物沉积率(标记带间距/标记间隔天数)^[13]。

组织学准备与组织形态学分析：术后12周末，于两组实验动物中分别随机选取4只大鼠，全麻下处死后将植入体连同其周围骨组织一并取出并于体积分数10%甲醛缓冲液中固定10 d。固定完成后，按前述方法处理样本并切片，置于光学显微镜下观察并拍摄照片。

分别在40倍与100倍放大率下利用图像分析仪进行组织形态学评估。同时测量形成骨整合的植入体骨界面面积以及植入体周围100 μm以内的骨面积，计算骨面积比率和骨-植入体接触率。

推出实验：术后12周，如前述方法处死余下未进行检测的大鼠并获取标本(对照组5只，实验组6只)，利用通用材料测试系统进行推出实验。具体步骤如下：分离骨骺及邻近骨质以暴露出植入体末端；将带有植入体的股骨固定于事先设计好的塑料模型中；用仪器对植入体施以垂直向下作用力(1 mm/min)并记录载荷位移数据；绘制载荷位移曲线，其峰值即为推出实验测值，将最大载荷除以植入体骨接触面积，即得到最大剪切力^[16]。

主要观察指标：两组矿物沉积率、组织形态学分析、最大推出力与最大剪切力比较结果。

统计学分析：数据采用x(_)±s的形式表示，并使用SPSS 16.0(USA)进行统计分析。两组间的差异采用t 检验进行比较，当P < 0.05时认为差异有显著性意义。

讨论

钛植入体被广泛应用于修复与重建手术(如肿瘤切除，骨折，关节置换，无牙颌等)中作为固位体。植入体成功植入并发挥其固位稳定作用有赖于早期、足量植入体周围新骨形成，即良好的骨整合。植入体植入后其周围骨组织生理变化受到植入体比表面特性、骨组织的质和量等多种因素的影响。为了获得良好的植入体骨整合，可以从两方面入手：改善拟植入部位骨质量与优化植入体性能^[1]。对于后者，常见且有效的办法为表面改性，如喷砂、酸蚀、生物分子掺入、药物释放等^[17]，这些方法均取得了较好的效果。然而植入体的性能优化仍有大量工作需要进行，尤其对于基础条件较差(如骨质疏松等)的患者，经上述改进的植入体尚不能取得满意效果。

骨质疏松是一种系统性骨骼疾病，主要表现为由高频率不平衡骨转换引起的骨量减少，以及骨矿物质密度降低^[1]。有关研究显示，骨质疏松患者在进行牙种植、关节置换等植入体置入后，预后常常不佳而需要进行修正手术，也更易发生其他并发症^[18]。去势动物的骨组织特点在许多方面与绝经女性相似，已被公认为建立骨质疏松模型的较佳实验对象^[19]。

实验通过溶胶-凝胶浸渍涂层法制成含锌羟基磷灰石涂层钛植入体和羟基磷灰石涂层钛植入体，以切除卵巢的雌性SD大鼠为骨质疏松研究模型，比较两种植入体在其股骨内植入后的骨整合情况，以研究锌离子在改善骨质疏松患者骨植入体骨整合能力中的作用。近年来，越来越多的学者开始关注微量元素在植入体中的应用，这些微量元素常可以通过激活成骨细胞，抑制破骨细胞等方式促进骨生成，从而具有潜在的促进骨整合作用^[20]。锌作为一种人体必需元素，逐渐开始受到关注，一些临床前研究结果支持关于锌可以提高细胞活性，改善钛植入体骨整合能力的假说^[10]。实验发现，经含锌羟基磷灰石改性的钛植入体相比羟基磷灰石改性钛植入体在摘除卵巢大鼠中植入后出现了更多的骨生成及更好的骨整合，这表明在钛植入体表面改性材料羟基磷灰石中加入锌有利于骨整合的形成。这一研究结果与Kawamura等^[21]此前的体内研究结果一致。

荧光标记检测可以反映骨生成与骨整合的动态过程。实验中荧光标记检测发现在植入后3-5周，两组中植入体周围均有活跃的骨生成，而实验组矿物质沉降率(1.20 μm/d)显著高于对照组(0.94 μm/d)。

推出实验是研究骨植入体界面骨结合质量的最常见手段之一^[22]，可用于评价植入体与骨之间形成的功能性骨整合。实验结果显示，植入体表层涂覆材料中添加锌后其推出力显著增加。但由于卵巢切除后大鼠较高的骨转换率可能会导致骨吸收的增强，甚至破坏植入体表面特性，其远期效果仍有待进一步研究。另外，植入体较高载荷能力与周围骨量的维持和锌持续刺激的相关性亦不明确。

Cooper 等^[23]认为大鼠骨内植入体植入后28- 35 d骨生成成熟过程即彻底完成，这与本实验结果并不完全一致。作者发现在植入后6周，植入体周围骨质仍未成熟，而且6-12周植入体周围骨质仍有活跃的骨改建发生，这可能与卵巢摘除后大鼠骨改建活跃度上升有关。

王丹宁等^[24]通过在微弧氧化电解液中加入一定浓度的钙和3 种不同浓度的锌来处理纯钛片，制成含有不同浓度锌的涂层材料，研究其对成骨细胞(MG63) 生物学特性的影响，结果发现MG63 在钙加低锌组表面生长最好，黏附、增殖和分化明显好于其他组，中锌组优于高锌组。赵宝红等^[25]研究了不同浓度钙离子、锌离子涂层对变形链球菌黏附和形态的影响，发现含锌离子涂层可有效抑制变形链球菌的黏附并影响其菌体形态，其具有的抗菌性能随锌含量的升高而增强。

综上所述，锌离子在掺入植入体表面后具有促进与加速植入体周围骨生成，改善植入体周骨微结构，增强植入体机械固位的作用。随着人口老龄化的逐步出现，经锌表面改性钛植入体在矫形外科与牙科手术中的应用前景将会非常巨大。

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Zinc ions improve the stability of titanium implants under the condition of osteoporosis

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