糖尿病大鼠颌下腺肥大细胞数量及转化生长因子β1的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.24.013

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (24): 4457-4464.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.24.013

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糖尿病大鼠颌下腺肥大细胞数量及转化生长因子β1的表达

朱建华¹，唐春玲¹，张艳秋¹，刘继光²

1佳木斯大学附属口腔医院，黑龙江省佳木斯市 154007
2佳木斯大学研究生处，黑龙江省佳木斯市 154007

收稿日期:2012-10-28 修回日期:2012-12-14 出版日期:2013-06-11 发布日期:2013-06-11
通讯作者: 刘继光，博士，教授，佳木斯大学研究生处，黑龙江省佳木斯市 154007 liujg5550@163.com
作者简介:朱建华，女，1959年生，黑龙江省佳木斯市人，汉族，教授，主要从事牙周黏膜病方面的研究。 zhu8622877@yahoo.com.cn
基金资助:
佳木斯大学科学技术研究项目(编号：L2012-035)

Number of mast cells and expression of transforming growth factor beta 1 in the submandibular gland of diabetes mellitus rats

Zhu Jian-hua¹, Tang Chun-ling¹, Zhang Yan-qiu¹, Liu Ji-guang²

1 Stomatology Hospital, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China
2 Postgraduate Department, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China

Received:2012-10-28 Revised:2012-12-14 Online:2013-06-11 Published:2013-06-11
Contact: Liu Ji-guang, M.D., Professor, Postgraduate Department, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China liujg5550@163.com
About author:Zhu Jian-hua, Professor, Stomatology Hospital, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China zhu8622877@yahoo.com.cn
Supported by:
Scientific Research Funds of Jiamusi University, No. L2012-035*

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明，持续高血糖可导致大鼠颌下腺的细胞出现退行性改变，表现为细胞因子表达增加，糖原代谢改变，分泌功能减弱。关于肥大细胞及转化生长因子β1与糖尿病颌下腺组织病变的关系研究较少。
目的：观察糖尿病状态下颌下腺组织中肥大细胞数量与形态变化和转化生长因子β1的表达。
方法：雄性SD大鼠32只，随机分为实验组和对照组，实验组注射四氧嘧啶成模后的4，8，12周测量体质量和血糖，并与对照组大鼠一同取下颌下腺组织做苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色观察并计数肥大细胞，SP 免疫组织化学染色方法检测转化生长因子β1棕黄色阳性细胞数量。
结果与结论：①肥大细胞在正常鼠及糖尿病鼠颌下腺组织中均有表达，实验组与对照组比较肥大细胞数随病程延长而增多，实验组不同时期明显多于对照组(P < 0.01)。②转化生长因子β1阳性细胞数在正常大鼠及糖尿病大鼠颌下腺的腺泡细胞、颗粒曲管及纹状管细胞中均有表达，阳性颗粒位于胞浆内，糖尿病时，随病程延长而增多，实验组不同时期明显多于对照组(P < 0.01)。结果可见糖尿病大鼠颌下腺中肥大细胞与转化生长因子β1表达增强与糖尿病病程呈正相关。

关键词: 组织构建, 组织构建与生物活性因子, 糖尿病, 转化生长因子β1, 肥大细胞, 颌下腺, 大鼠, 免疫组化, 甲苯胺蓝染色, 苏木精-伊红染色, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: Continuous hyperglycemia may result in degenerative changes in submandibular gland cells, showing the increased cytokine expression, altered glycogen metabolism and attenuated secretion function. Little evidence is available addressing the mast cells and transforming growth factor beta 1 in diabetic submandibular gland lesions.
OBJECTIVE: To observe the number and morphological changes of mast cells, as well as transforming growth factor beta 1 expression in the submandibular gland of diabetic rats.
METHODS: Thirty-two male Sprague-Dawley rats were randomly divided into an experimental group and a control group. The body weight and blood glucose levels of all rats were measured at 4, 8, and 12 weeks after alloxan injection was given in the experimental group. Submandibular gland tissues were harvested for hematoxylin-eosin staining and toluidine blue staining to count mast cells. Transforming growth factor beta 1- positive cells were measured using SP immunohistochemical staining method.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Mast cells were expressed in submandibular gland of both normal rats and diabetic rats, and the number of mast cells gradually increased as the disease duration prolonged and was significantly higher in the experimental group than in the control group (P < 0.01). (2) The transforming growth factor beta 1-positive cells were expressed in submandibular gland acinar cells, granular convoluted tubule and striated duct cells in both normal rats and diabetic rats, and the positive granules were localized in the cytoplasm. The number of positive cells gradually increased along with the duration of diabetes and was significantly higher in the experimental group than in the control group (P < 0.01). The mast cells and upregulated expression of transforming growth factor beta 1 in the submandibular gland of diabetic rats are positively related to the duration of diabetes mellitus

Key words: tissue construction, tissue construction and bioactive factors, diabetes mellitus, transforming growth factor beta 1, mast cells, submandibular gland, rats, immunohistochemistry, toluidine blue staining, hematoxylin-eosin staining, other grants-supported paper

中图分类号:

R318

朱建华，唐春玲，张艳秋，刘继光. 糖尿病大鼠颌下腺肥大细胞数量及转化生长因子β1的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(24): 4457-4464.

Zhu Jian-hua, Tang Chun-ling, Zhang Yan-qiu, Liu Ji-guang. Number of mast cells and expression of transforming growth factor beta 1 in the submandibular gland of diabetes mellitus rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(24): 4457-4464.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 纳入SD大鼠32只均用于实验数据统计及结果分析。

2.2 血糖与体质量变化 实验组大鼠注射四氧嘧啶约5 d，出现多饮、多食、多尿等症状，血糖明显升高，与同一时期对照组大鼠血糖比较差异有显著性意义 (P < 0.01)，见表1。

实验组大鼠体质量从第3周起与对照组大鼠稍有差别，随着时间延长差异进行性增大，到12周时其体质量降低明显，体质量与同一时期对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，见表2。

2.3 光镜观察形态学结果

造模4周时：实验组大鼠颌下腺导管及各种腺泡均呈不同程度的萎缩，间隙增宽；肥大细胞数目增多，大多数细胞内异染性颗粒分布较密，见少量的颗粒释放现象；转化生长因子β1在浆液性腺腺泡上皮和导管上皮细胞胞浆中有弥漫性棕黄色颗粒，间质成分中的血管上皮可见阳性表达。

造模8周时：实验组大鼠颌下腺导管及各种腺泡萎缩加重，间隙增宽显著，出现核固缩，颗粒曲管数目减少，细胞排列不整齐，浆液性腺泡趋于减少；肥大细胞数目增多，胞膜不清晰，大多数细胞内异染性颗粒分布较密，部分细胞有脱颗粒现象，见图1。转化生长因子β1在颌下腺组织内表达增强，阳性细胞增多，除胞质外，胞核也可见有少量棕黄色颗粒，见图2。

造模12周时：实验组大鼠颌下腺腺泡萎缩，形态不规则，间隙增宽，出现核固缩。导管数目明显减少，细胞排列不整齐，管腔变小，而间质结缔组织纤维及血管明显增加，见图3；肥大细胞数目显著增多，部分肥大细胞胞膜结构不清，颗粒涌出胞外，细胞形状不规则，有的细胞完全脱颗粒；转化生长因子β1的表达大多增至强阳性。

对照组大鼠颌下腺腺泡饱满，呈圆形或卵圆形，浆液性腺泡较多，胞质呈淡蓝色，胞核扁平，位于细胞底部，导管管腔较大，管壁上皮排列整齐，见图4；肥大细胞数量少、体积较小，呈圆形、卵圆形及不规则形，胞膜清晰，主要分布在血管和导管周围的小叶间结缔组织中，见图5；转化生长因子β1在颌下腺的腺泡细胞、颗粒曲管及纹状管细胞中均有表达，高倍镜下阳性颗粒主要位于上述细胞的胞浆内，呈浅棕色，见图6。

实验组与对照组比较肥大细胞数及转化生长因子β1阳性细胞数均随病程延长而增多。方差分析结果显示，实验组与对照组大鼠的肥大细胞数及转化生长因子β1阳性细胞数差异有显著性意义，说明实验组的表达均强于对照组，见表3。

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引言

糖尿病是一组以慢性血葡萄糖(简称血糖)水平增高为特征的代谢疾病群。近年来，糖尿病患者日益增多，已成为继肿瘤、心血管疾病之后的世界第三大非传染性疾病，严重威胁人类的健康和生命。近年来，国内外关于糖尿病的研究均取得了很大进展，有研究证实，1型糖尿病是自身免疫性疾病，由于遗传易感性、诱发因素等导致抗胰岛自身抗体产生，β细胞胰岛素分泌不足、胰岛功能逐渐减退，因此患者最终发展成显性糖尿病^[1]。糖尿病患者口腔内唾液少而黏稠，口腔黏膜普遍干燥，唾液溶解酶活力降低，口腔的自洁作用降低，出现味觉异常，影响吞咽、咀嚼、语言等功能^[2]。口渴、多饮是糖尿病的主要临床症状之一，而颌下腺是唾液分泌的主要器官，占总分泌量的70%左右。口腔黏膜干燥可能与糖尿病患者自主神经病变、微血管变化、激素不平衡引起的唾液腺功能障碍有关。

颌下腺为三大唾液腺之一，大部分位于颌下三角内，小部分在下颌舌骨肌后上方，是以浆液性腺为主的混合腺。实质是由腺上皮细胞与导管系统组成，并有少数黏液性腺泡和混合性腺泡，属于典型的外分泌腺。间质由纤维结缔组织组成，血管、淋巴管和神经出入被膜及小叶间隔。闰管、分泌管位于小叶内、排泄管穿行于小叶间组成了复杂的导管系统。而啮齿类动物是由闰管、颗粒曲管、分泌管和排泄管组成，其中颗粒曲管粗长而弯曲，是啮齿类动物颌下腺导管的主要部分。

目前的研究则表明，颌下腺是产生生物活性物质种类最多的器官之一，其中有些因子完全达到激素的标准，如红细胞分化因子、内皮素^[3]、胰岛素样生长因子^[4]、肝细胞生长因子^[5]、转化生长因子α、β1等^[6-7]。这些生长因子大多分布于颗粒曲管细胞的分泌颗粒中，但有些呈弥散性分布于胞质的基质中，分泌管和排泄管也呈免疫阳性反应。由此得出，颌下腺是即具有外分泌功能又有内分泌功能的双重腺体。近些年来，糖尿病对唾液腺的影响一直受到关注，有文献报道，持续高血糖可导致大鼠颌下腺细胞出现退行性改变，被纤维结缔组织取代^[8]。也有学者在研究糖尿病大鼠动物模型时发现，成模2个月后，颌下腺形态发生改变，出现细

胞因子表达增加，糖原代谢改变，分泌功能减弱等现象^[9]。研究表明，糖尿病口渴与颌下腺腺体形态、间质纤维增生、功能异常有关^[10-13]。

为此，实验通过用四氧嘧啶复制糖尿病动物模型，应用光镜、苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色及免疫组织化学技术观察检测肥大细胞及转化生长因子β1在颌下腺组织中的表达，探讨其与糖尿病颌下腺损伤的关系，为糖尿病颌下腺病变的预防和治疗提供理论依据。

材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：于2011至2012年在佳木斯大学动物中心实验室和基础医学院病理科完成。

材料：

实验动物：健康清洁级雄性SD大鼠32只，10周龄，体质量180-220 g，由佳木斯大学动物中心提供，大鼠适应性喂养7 d后用于实验。

实验试剂和仪器：转化生长因子β1、SP试剂盒及二氨基联苯胺显色剂均购于武汉博士德生物工程公司；血糖仪为美国强生公司产品；四氧嘧啶购于中科瑞泰公司。

实验方法：

动物分组及造模：SD大鼠随机分为对照组8只，实验组24只(4，8，12周各8只)。实验组按200 mg/kg剂量腹腔一次性注射10%四氧嘧啶诱导糖尿病，对照组注射等量的生理盐水。

血糖和体质量检测：每次检测时间为上午9时，空腹。天平称量大鼠体质量，尾静脉取血，采用拜安捷快速血糖仪(美国强生公司)测定血糖值。选择血糖≥ 16.7 mmol/L确定造模成功。

标本制备：实验组(4，8，12周)大鼠，与随机选取的对照组大鼠一同测体质量、血糖。然后用2%戊巴比妥钠(4 mL/kg)腹腔注射麻醉，打开胸腔，从左心室插管至升主动脉，同时剪开右心耳，先以生理盐水快速冲洗，再用40 g/L多聚甲醛进行灌注固定，灌注完毕后，取下颌下腺组织。将标本固定于40 g/L多聚甲醛液中24 h，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，做连续切片，切片厚度6 μm，常规苏木精-伊红、甲苯胺蓝和免疫组化染色。

免疫组织化学染色：①切片常规脱蜡至水，PBS洗 5 min×3次。②每张切片经体积分数为3%过氧化氢处理10 min，用以消除内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次5 min。③正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10 min，甩去血清，滴加一抗，兔抗转化生长因子β1， 4 ℃孵育过夜。④用PBS冲洗3次，每次5 min。⑤滴加生物素标记山羊抗兔IgG，室温下孵育10 min。⑥去除二抗，PBS冲洗3次，每次5 min。⑦滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育10 min。⑧PBS冲洗3次，每次5 min。⑨DAB显色一两分钟，至显色满意，蒸馏水终止显色。⑩自来水冲洗，苏木精复染。?梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。?结果判定：显微镜下观察，转化生长因子β1活化的阳性表达为细胞核呈黄色或棕黄色颗粒染色。以PBS代替一抗，作为阴性对照。

甲苯胺蓝染色：①石蜡切片，脱蜡至水洗。②甲苯胺蓝染色30 min。③稍水洗，冰醋酸分化数秒钟。④蒸馏水洗两次，冷风吹干，透明，封固。⑤显微镜观察。

细胞计数：在 HPIAS-100 高清晰度彩色病理图像细胞测量系统- 129 上，对肥大细胞数量及转化生长因子β1阳性细胞计数。每只动物取5张切片，每张切片随机选取5个镜下视野(×400)，细胞质或核内见淡黄色细颗粒明显高于背景色者为阳性颗粒。

主要观察指标：不同时期实验组大鼠颌下腺中肥大细胞数量及转化生长因子β1的表达。

统计学分析：应用 SPSS 17.0 软件包对不同时期糖尿病大鼠颌下腺肥大细胞的数目、转化生长因子β1阳性细胞数组间差异采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义；所有数据以x(_)±s表示。

讨论

糖尿病动物模型大体可分3类：实验性、自发性和转基因糖尿病动物模型。实验性糖尿病动物模型是指运用各种方法损伤动物胰脏或胰岛β细胞导致胰岛素缺乏，或运用各种拮抗剂对抗胰岛素的作用，引起实验性糖尿病^[14]。四氧嘧啶是胰岛β细胞毒剂，通过产生超氧自由基而破坏β细胞，使细胞内DNA损伤，并激活多聚ADP核糖体合成酶活性，从而使辅酶Ⅰ含量下降，导致mRNA功能受损，β细胞合成前胰岛素减少，导致胰岛素缺乏，为研究糖尿病及其并发症提供了良好的基础。

肥大细胞是神经-内分泌-免疫网络调节过程中关键细胞之一^[15-19]，肥大细胞分泌多种生物活性物质，如组胺、肝素、蛋白水解酶、白三烯以及白细胞介素1，2，3，4，5，6、转化生长因子β和肿瘤坏死因子α等细胞因子，可促进机体产生对病原菌的免疫应答与炎症反

应^[20-21] 。糖尿病病程中存在免疫反应及炎症反应，由于长期高血糖刺激，而糖尿病自身胰岛素缺乏，需要其他降糖因素，包括一些细胞因子来降低血糖，一系列细胞因子通过复杂的细胞因子网络使肥大细胞的数量急剧增多^[22-23]。作者实验显示，实验组早期4周时大鼠颌下腺内肥大细胞数量增多(12.00±3.51)个/HP，导管及各种腺泡均呈不同程度的萎缩，间隙增宽，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)；第12周时，肥大细胞数目显著增多(30.20±7.03)个/HP，大部分肥大细胞胞膜结构不清，颗粒涌出胞外，有的细胞完全脱颗粒，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)；随病程延长肥大细胞显著增多，大部分肥大细胞胞膜结构不清，大量颗粒涌出胞膜，有的细胞完全脱颗粒，脱颗粒反应是肥大细胞实现其生理病理功能的最重要方式^[24]。这种生理或代偿性地维持或调整损伤胰岛功能，促进胰岛素分泌的同时也对颌下腺组织造成一定的损害。高血糖导致肥大细胞在多种疾病中的作用与其活化并释放活性介质密切相关，有文献报道，肥大细胞可能作为一种潜在的生长因素，参与糖尿病血管增生的病理过程^[25-27]。肥大细胞激活后可分泌转化生长因子β1，而转化生长因子β1可能对肥大细胞有趋化作用，促进其迁移聚集于病灶组织^[28]。所以糖尿病引起的高血糖使肥大细胞增多，肥大细胞通过与成纤维细胞相互作用参与纤维化过程。

转化生长因子β是由多种细胞分泌的一类具有多重生物学效应的生长因子，转化生长因子β异构体活化后转化生长因子β1所占比例高达90%^[29]。转化生长因子β1是由2条分子质量为11 ku有112个氨基酸构成的单链，二硫键与单链结合而成的分子质量为25 ku的多肽，具有多功能的细胞因子。转化生长因子β1主要分布在中胚层间叶组织细胞，血小板和活化单核巨噬细胞中转化生长因子1含量最多，要发挥生物学作用必须与其受体结合。转化生长因子β1受体分布极为广泛，几乎所有正常细胞表面都有转化生长因子β1受体。转化生长因子β1是一类具有双向调节功能的生长因子，它具有多种生物学效应，它调控细胞生长、分化、细胞外基质合成，在个体发育、免疫、炎症过程都有重要作用^[30-33]。转化生长因子β1对炎症细胞和成纤维细胞具有强烈的趋化作用，使炎症反应强烈。转化生长因子β1长时间被认为是细胞外基质最重要的调节因子。转化生长因子β1不但刺激细胞外基质的产生，而且低浓度转化生长因子β1能刺激纤维连接蛋白、胶原蛋白、结缔组织生长因子和纤溶酶原激活物抑制剂1等细胞外基质的合成增多。纤溶酶原激活物抑制剂1是一种丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，能调节炎症反应、迁移。Otsuka 等^[34]用大鼠模型发现，转化生长因子β1过度表达，引起纤溶酶原激活物抑制剂1产生大量细胞外基质，使细胞外基质的合成和降解失衡。近年来研究表明，高血糖可通过一系列细胞内信号转导通路调节转化生长因子β1的基因表达，引起细胞外基质积聚，导致组织硬化^[35]。作者实验结果显示，实验组4，8，12周时，转化生长因子β1阳性细胞数分别为(7.72±1.14)，(9.40±1.19)，(12.24±1.5)个/HP，提示随病程延长转化生长因子β1表达亦增强。表明高血糖、晚期糖基化终末产物、高脂血症或氧化应激等糖尿病指证可能引起转化生长因子β1表达上调，其机制与转化生长因子β1通过调控炎症刺激相关的细胞因子和生长因子影响颌下腺功能有关。糖尿病大鼠颌下腺转化生长因子β1表达随病程延长而增多，表明转化生长因子β1与细胞外基质的增生之间可能有密切联系，与实验苏木精-伊红染色结果相符。其机制与转化生长因子β1通过调控炎症刺激相关的细胞因子和生长因子影响颌下腺功能有关。糖尿病时颌下腺高表达的转化生长因子β1可能通过旁分泌作用导致了结缔组织纤维的增生^[36-38]。研究发现糖化白蛋白培育下的小鼠血管内皮细胞转化生长因子β1含量及其水平持续升高，促进微血管纤维化^[39-40]。实验的结果显示糖尿病大鼠颌下腺转化生长因子β1表达逐渐增高可能与高血糖有密切联系。

综上所述，实验结果表明高血糖导致颌下腺组织中肥大细胞和转化生长因子β1表达较对照组明显增加，并且随着病程的延长进一步增加，促使颌下腺结缔组织增生明显，表明两者在糖尿病鼠颌下腺损伤中共同起作用，最终导致颌下腺分泌功能下降，其具体机制还有待进一步研究。

糖尿病大鼠颌下腺肥大细胞数量及转化生长因子β1的表达

Number of mast cells and expression of transforming growth factor beta 1 in the submandibular gland of diabetes mellitus rats

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