脉冲电磁场与软骨代谢

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.022

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前研究已证实外周脉冲电磁场可以促进软骨代谢，但其分子水平机制仍不甚清楚。
目的：探讨脉冲电磁场的物理特性及其在软骨形成方面的作用与机制。
方法：由第一作者应用计算机检索PubMed、中国期刊全文数据库(CNKI)、维普数据库和万方数据库1997年5月至2012年8月有关脉冲电磁场对软骨代谢影响的文献。在标题、摘要、关键词中以“pulsed electromagnetic field(PEMFs)，cartilage，bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)”或“脉冲电磁场，软骨代谢，软骨细胞，骨基质，骨髓间充质干细胞”为检索词进行检索。排除重复研究或内容较陈旧的文献。
结果与结论：初检得到145篇文献，排除99篇重复研究或内容较陈旧的文献，保留46篇文献进一步分析。结果显示，脉冲电磁场通过诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞，促进软骨特异性基质如Ⅱ型胶原及蛋白多糖的合成，从而发挥软骨诱导作用；脉冲电磁场通过促进转化生长因子β2与其他因子的表达，调节软骨细胞生长分化，使临床上永久性修复软骨组织缺损变为可能。

关键词: 组织构建, 组织构建综述, 脉冲电磁场, 软骨细胞, 软骨基质, 软骨诱导, 代谢, 骨髓间充质干细胞, Ⅱ型胶原, 蛋白多糖, 转化生长因子, 综述文献

Abstract:

BACKGROUND: Peripheral pulsed electromagnetic fields have an obvious effect on cartilage metabolism; however, its molecular mechanism is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the physical characteristics of pulsed electromagnetic fields and its mechanism and effect on cartilage formation.
METHODS: A computer-based online search of PubMed database, CNKI database, VIP database andWanfang database was performed to search related articles. “Pulsed electromagnetic fields, cartilage, cartilage cells, matrix, bone marrow mesenchymal stem cells” were used for word retrieval in the title, abstract, and keywords. Repetitive studies or old literatures were excluded.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 145 articles were retrieved in the initial search, and finally 46 articles were included in result analysis. The results showed that pulsed electromagnetic fields can promote the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocytes and cartilage specific matrix such as type II collagen and proteoglycan synthesis, thus playing a cartilage inducing effect. Pulsed electromagnetic fields can also promote the expression of transforming growth factor beta 2 and other factors to regulate the chondrocyte growth and differentiation, which can realize the permanent repair of defects in clinic.

Key words: tissue construction, tissue construction review, pulsed electromagnetic fields, chondrocytes, cartilage matrix, cartilage induction, metabolism, bone marrow mesenchymal stem cells, type Ⅱ collagen, proteoglycan, transforming growth factor, review literature

中图分类号:

R318

阮佳莉，田京. 脉冲电磁场与软骨代谢[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.022.

Ruan Jia-li, Tian Jing. Pulsed electromagnetic fields and cartilage metabolism[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.022.

图/表（结果） 1

2.1 脉冲电磁场对软骨细胞的作用
2.1.1 对凋亡抑制蛋白mRNA的作用 Li等[7]将人为损伤了软骨组织的去卵巢SD大鼠至于脉冲电磁场下进行3个月的治疗，免疫PCR检测显示脉冲电磁场能诱导上调大鼠的凋亡抑制蛋白mRNA表达。凋亡抑制蛋白mRNA能翻译形成凋亡抑制蛋白，凋亡抑制蛋白主要有3个结构域(BIR, RING 及CARD)，其中BIR结构域是发挥凋亡抑制的关键，通过caspase蛋白酶激活级联反应，肿瘤坏死因子受体介导的信号转导等途径抑制细胞凋亡。软骨细胞内的凋亡抑制蛋白mRNA含量增加，说明细胞已经启动抑制凋亡路径。凋亡抑制蛋白mRNA经过翻译形成凋亡抑制蛋白，从而抑制软骨细胞的凋亡，促进软骨细胞的合成和软骨细胞功能的实现。

2.1.2 对促凋亡蛋白mRNA的作用 Li等[7]将人为损伤了软骨组织的去卵巢SD大鼠至于脉冲电磁场下进行3个月的治疗，免疫PCR检测同时显示脉冲电磁场能下调促凋亡蛋白mRNA表达。凋亡蛋白mRNA能翻译形成促凋亡蛋白，促凋亡蛋白和Bcl-2 是线粒体途径调节凋亡基因家族的基本成员，Bcl-2 和促凋亡蛋白的比值决定着细胞生存和细胞凋亡。细胞周围环境的改变通过一些分子反应激活线粒体途径调节凋亡基因家族，包括促凋亡蛋白基因，导致松散结合在线粒体膜上的促凋亡蛋白过表达并发生寡聚化，插入线粒体膜，线粒体膜通透性改变，细胞色素C从线粒体中大量释放，通过一系列的级联反应激活caspase mRNA，一方面降解聚ADP核糖核苷酸，后者是DNA修复中的关键酶；另一方面降解DNA片段化因子，其降解为Caspase活化DNA 酶，即一种核酸内切酶，使DNA碎片化。另外促凋亡蛋白还可导致线粒体膜电位的降低，而膜电位的降低使线粒体自身基因的转录和翻译受到抑制，同时也影响了ATP的合成在此途径中，促凋亡蛋白亚家族起着重要的调节作用。促凋亡蛋白mRNA能转录形成促凋亡蛋白，促进软骨细胞的凋亡，进而引起软骨密度的降低和功能障碍。

2.1.3 对细胞膜腺苷A2a受体的作用 Varani等[8]通过实验证明在软骨代谢的异常过程中存在炎症反应和抗炎症反应，抗炎症反应主要通过软骨细胞膜上的腺苷A2a受体介导。一些抗炎症药物正是通过抑制腺苷A2a受体介导的信号传导通路发挥抑制软骨不断损伤的作用[9]，而腺苷A2a受体的活化可能与脉冲电磁场对细胞因子肿瘤坏死因子a、白细胞介素6和白细胞介素8的抑制有关[10-12]。De Mattei等[13]用脉冲电磁场对不同密度的人软骨细胞进行照射，发现9 h和 18 h组的软骨细胞细胞膜上的腺苷A2a受体明显活化，同时软骨细胞密度相对于对照组明显增加。脉冲电磁场通过活化细胞膜上腺苷A2a受体，抑制炎症反应对软骨细胞的损害。

2.2 脉冲电磁场对软骨代谢相关细胞因子的作用
2.2.1 对转化生长因子β的作用脉冲电磁场可以上调转化生长因子超家族mRNA的表达，促进转化生长因子的释放[14]。Boyle等[11]对天竺鼠进行6个月的脉冲电磁场照射治疗，通过与对照组对比发现，脉冲电磁场对转化生长因子β的促进释放作用可能是其促进软骨修复的机制之一。

转化生长因子β促进软骨基质中蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白的合成，刺激软骨细胞合成前列腺素，直接抑制促炎类细胞因子的产生[15-16]，从而保持软骨结构的稳定。同时，转化生长因子β对软骨细胞的分化具有双重调节作用，可促进未分化和分化早期的软骨细胞的增殖，还可抑制分化末期软骨细胞的分化及软骨基质钙化。

2.2.2 对胰岛素样生长因子1的作用脉冲电磁场能上调胰岛素样生长因子1mRNA的表达，促进胰岛素样生长因子1释放。Pelletier等[17]对软骨组织进行脉冲电磁场的照射，研究显示，软骨代谢异常时，具有合成代谢作用的细胞因子产生增多，如胰岛素样生长因子1，它不仅可以抑制炎症介质的分解代谢作用，更能促进软骨细胞的合成代谢。胰岛素样生长因子1不仅总体上对关节软骨代谢起调节作用, 也作用于特定的次级软骨基质结构, 降低细胞周围胶原含量，增加其中心区域含量，同时，胰岛素样生长因子1和转化生长因子β软骨细胞增殖、分化过程中存在协同作用，并可抑制由转化生长因子β引起的软骨细胞外基质的钙化[18]。

2.2.3 对白细胞介素1β的作用骨关节炎患者由于组织损伤，局部释放出更多具有分解代谢作用的酶类和细胞因子类物质，如白细胞介素1β等[17]。用白细胞介素1β的拮抗剂封锁该细胞因子在骨关节炎患者体内的功能，可以促进软骨细胞基因表达，加快软骨细胞代谢，产生更多软骨基质，加快软骨的修复[19]。

张志刚等[20]采用不同强度低频脉冲电磁场对兔膝软骨细胞进行电磁辐射刺激，使用Western blot检测细胞中以及细胞培养液中白细胞介素1β的水平。发现低频脉冲电磁场的刺激并没有引起兔膝软骨细胞形态的变化以及细胞内白细胞介素1β表达水平的变化，但能够引起细胞增殖能力的增强，这与Jahns 等[21]的研究结果相一致。同时观察到在低频脉冲电磁场的刺激下，兔膝软骨细胞培养液中白细胞介素1β的水平有明显降低(可能是由于电磁场引起的膜电位变化导致膜泡运输和跨膜蛋白从膜上解离这两个过程受到影响而造成)，并且随着施加脉冲磁场刺激强度的增加，白细胞介素1β的降低程度增大。这些结果说明低频脉冲电磁场虽然不能影响白细胞介素1β在细胞内的合成，但可以抑制它们向胞外分泌的过程，从而减轻了白细胞介素1β对软骨组织的分解代谢作用。

2.2.4 对肿瘤坏死因子α的作用骨关节炎易并发滑膜炎，在滑膜附近发现大量活化的B细胞和T淋巴细胞，而在骨关节炎患者关节内发现异常增多的促炎症细胞因子，其中，肿瘤坏死因子α含量较正常关节内含量明显增加。由此，肿瘤坏死因子α可能与该疾病的发生密切相关[17]。

张志刚等[20]采用不同强度低频脉冲电磁场对兔膝软骨细胞进行电磁辐射刺激，使用ELISA检测细胞及细胞液中肿瘤坏死因子α的水平，发现细胞内肿瘤坏死因子α未变化，但细胞液中肿瘤坏死因子α明显降低。Yan等[22]也同样证明该现象。肿瘤坏死因子α是软骨代谢的异常早期重要的炎症因子，不仅可以提高其他促炎症类细胞因子的合成，如白细胞介素6、白细胞介素8等，更会导致蛋白聚糖的再吸收，金属蛋白酶的合成，以及诱导软骨细胞产生过氧化反应，促进含氮氧化物的合成，从而加速软骨基质结构的破坏和软骨的吸收，进一步造成软骨细胞的死亡。脉冲电磁场通过减少肿瘤坏死因子α的分泌，间接抑制其他炎症因子的释放，减轻了其对软骨组织的损害。

2.2.5 对金属蛋白酶的作用脉冲电磁场能下调金属蛋白酶mRNA的表达，减少金属蛋白酶的合成[23]。在骨关节炎时软骨细胞金属蛋白酶合成增多。已证实在骨关节炎时金属蛋白酶13无论是在mRNA水平还是在蛋白水平都明显增高[24]。金属蛋白酶主要参与胶原的降解，同时在多聚蛋白聚糖的降解中起辅助作用。正常软骨组织中，金属蛋白酶与金属蛋白酶抑制剂相互作用，维持蛋白聚糖的代谢平衡。但当软骨代谢异常时，过渡释放的金属蛋白酶对软骨基质进行破坏，使蛋白聚糖，尤其是透明质酸失去正常的结构，进一步加剧软骨的损害[25]。
2.3 脉冲电磁场对软骨基质形成的作用
2.3.1 对蛋白聚糖的作用细胞外基质由纤维、蛋白聚糖和水构成。相关研究表明，脉冲电磁场能促进细胞外基质的合成[26]，保持细胞外基质的完整性，并提升软骨基质中蛋白聚糖的含量[27-28]。

蛋白聚糖是一类由氨基聚糖和核心蛋白所组成的化合物，其含糖量可高达95%以上，因而化学性质更类似于多糖而不是蛋白质，实际为含蛋白的多糖。结构上，软骨中的蛋白聚糖分子包绕所有的结构，并松散地附着到胶原纤维上。功能上，蛋白聚糖作为大分子具有高度的亲水性，对保持结缔组织水分及其组织间物质交换具有重要作用。软骨基质的吸水性和选择透过性依赖于蛋白聚糖。研究最多的是多聚蛋白聚糖。它是软骨中的主要成分，与透明质酸形成的聚集体充填于细胞间隙，缓冲机体和组织对关节的压强。

2.3.2 对Ⅱ型胶原的作用蛋白聚糖和胶原是构成细胞外基质的主要生物大分子，而细胞外基质则是与软骨细胞代谢密切相关的，它构成了软骨细胞生长的微环境。有学者发现脉冲电磁场能增加软骨组织内Ⅱ型胶原的含量。以关节软骨为例，Ⅱ型胶原由软骨细胞合成，是构成关节软骨的主要胶原，占胶原总量的80%-90%，Ⅱ型胶原形成的纤维束较细，而且羟赖氨酸的糖化率也高，糖基产物有高度的吸水性，所以Ⅱ型胶原能够较好地保持关节软骨的水分。有证据表明Ⅱ型胶原和蛋白多糖通过Ⅸ型胶原完整地联系在一起，对维持关节软骨的完整性和机械性具有重要意义[29-30]。Ⅱ型胶原和糖胺多糖的减少是所有自然发生和实验诱导骨关节炎的主要特征。脉冲电磁场通过诱导Ⅱ型胶原的合成保证软骨基质的抗压性和黏滞性。

2.3.3 对氨基葡聚糖的作用有实验证明，脉冲电磁场能提高不成熟软骨组织内氨基葡聚糖的含量[31-33]。在软骨代谢异常时，软骨表面的炎症反应会消耗大量的氨基葡聚糖并抑制Ⅱ型胶原蛋白的合成[34]。

氨基葡聚糖主要分为硫酸软骨素、硫酸角质素、透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸肝素等6种物质。氨基葡聚糖和连接蛋白构成蛋白聚糖亚单位，亚单位连接至核心蛋白形成蛋白聚糖聚合体。软骨细胞的功能状态和细胞外基质中的多聚蛋白聚糖代谢紧密相联，它们之间存在着大量的信息、能量和物质交流。而软骨细胞通过细胞膜上的CD44与透明质酸和连接蛋白与多聚蛋白聚糖发生联系，感知细胞外基质的变化，调节细胞外基质的代谢。因此，透明质酸和连接蛋白可以看作是软骨细胞与细胞外基质之间的“桥梁”。若该桥梁的任一环节发生改变，都会造成细胞外基质代谢异常、基质降解和细胞变性坏死，导致关节软骨受损。脉冲电磁场通过增加氨基葡聚糖的含量，促进软骨基质的合成和软骨结构的稳定。

2.4 脉冲电磁场对软骨细胞发育微环境的作用由于软骨下骨、滑膜细胞、滑液都会对软骨细胞及软骨基质的代谢和软骨的修复产生影响，体内实验能帮助人们更好的理解脉冲电磁场对软骨细胞发育微环境的影响[35]。现已有许多方法如半月板切除术、内外侧副韧带的断离等都可以人为造成动物软骨的损伤，以用于研究[36-42]。

2.4.1 脉冲电磁场对软骨下骨的作用软骨下矿化组织可以分为3层：钙化软骨、软骨下皮质骨和软骨下松质骨。软骨下骨包括软骨下皮质骨和其下方的血管、骨小梁、小梁间腔隙等。软骨下骨区域内含有大量的动脉、静脉和伴行的神经。软骨下骨的主要功能为吸收应力，缓冲震荡和维持关节形状，同时也为得不到关节液滋养的深层软骨提供营养。软骨代谢异常时，早期骨吸收增强，破骨细胞数量增加，软骨下骨生成组织蛋白酶K和基质金属蛋白酶13等分解代谢因子显著增多。

Benazzo等[43]用脉冲电磁场照射羊自体移植的骨软骨组织，发现脉冲电磁场不仅对软骨产生了影响，对软骨下骨也产生了影响。电镜显示，1个月时，在实验组软骨与骨的交界面，破骨活动减少，成骨活动相对增多；6个月时，对照组的软骨下骨组织内存在大的再吸收区域，而照射组未出现，软骨下骨组织密度适中。软骨下骨的重建，既对软骨起到机械保护作用，也抑制自身产生更多的分解代谢因子，从而减少软骨的损害，有利于关节功能的恢复。

2.4.2 脉冲电磁场对滑膜细胞的作用关节软骨的关节囊由纤维层和滑膜层构成，滑膜层由内的内膜层和外的内膜下层构成，内膜层有3种细胞：A细胞为类巨噬细胞，吞噬滑液内异物；B细胞为类成纤维细胞，分泌透明质酸至滑液；C细胞为未分化细胞，是A、B细胞的前体。内膜下层主要由成纤维细胞、巨噬细胞、肥大细胞、血管、淋巴管构成，主要负责代谢废物的转运并分泌炎症反应因子到滑液。Benazzo等[43]在对羊异体移植骨软骨组织进行照射时发现，6个月时滑液中的炎症相关因子较对照组明显减少，但透明质酸与纤维并没有明显增加。实验表明，脉冲电磁场对滑膜细胞具有选择性作用，它能抑制内膜下层巨噬细胞和肥大细胞的作用，减少炎症反应，以减少其对关节软骨的损害，而对B细胞和成纤维细胞的作用不明显。

2.5 脉冲电磁场对骨髓间充质干细胞的作用研究表明，骨髓间充质干细胞具有向软骨定向分化的能力。骨髓间充质干细胞的软骨分化潜能由在碱性成纤维生长因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子1、骨形态发生蛋白、血小板源性生长因子等在内的多种因子介导。转化生长因子β对于软骨细胞表型的表达和维持已被广泛报道。不单来源于骨髓，还有来源于骨膜、滑膜的细胞已成功向软骨分化[44]。

由于软骨组织无血管、神经和淋巴管，同时软骨细胞代谢率低，加之在基质纤维网中的增生和迁移受限，当软骨组织受到破坏后，其自行修复能力非常有限，往往会造成不可逆转的功能障碍，从而引起患者长期的、慢性的疼痛，降低患者的生活质量。目前软骨缺损的外科治疗方法主要有软骨清理成形术、钻孔微骨折术、骨膜及软骨膜移植等。这些治疗方法在一定程度上能够缓解损伤导致的疼痛，延缓关节退行性变，恢复关节的部分功能。但修复组织难以保持透明软骨表型，大部分仍以纤维软骨形式出现，而且分化组织也易钙化成骨，远期效果维持困难。直到组织工程的出现，人们开始用自体软骨细胞移植的方法治疗软骨缺损，并取得良好的效果。但由于软骨细胞取材困难，移植细胞可能出现渗漏，单层培养时不能保持软骨细胞生物学功能，供区有限等原因，限制了其进一步的应用。

近年来，随着组织工程学的快速发展，采用骨髓间充质干细胞作为种子细胞在体外不同环境及生长因子的作用下使其分化为软骨细胞可能成为一种新的修复关节软骨的治疗方式。研究通过低频脉冲电磁场刺激骨髓间充质干细胞后，从形态学、生物化学、分子生物学等方面观察加载低频脉冲电磁场刺激是否能够促进骨髓间充质干细胞向软骨方向分化。

研究表明低频脉冲电磁场对骨髓间充质干细胞具有促软骨方向分化效应[42]。其机制之一可能是低频脉冲电磁场能促进细胞自分泌或旁分泌一些细胞因子以发挥作用，诸如转化生长因子β1、骨形态发生蛋白等[45]，从而促进骨髓间充质干细胞的软骨样分化并促进软骨细胞的代谢活动。另有研究显示，低频脉冲电磁场刺激可增加骨髓骨髓间充质干细胞aggrecan mRNA表达和Ⅱ型胶原mRNA表达[46]。Aggrecan是蛋白质与硫酸化的糖胺聚糖共价连接的大分子糖复合物，它能维持软骨基质的润滑和弹性，是软骨分化过程中极为重要的分化产物，亦是软骨形成的特异性标志物；Ⅱ型胶原是软骨细胞所分泌的特异性胶原蛋白，是软骨基质的关键组分，也是软骨形成的特异性标志物之一。两者作为软骨基质的重要组分，为软骨功能的实现提供了物质保证。

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