原代人宫颈癌细胞的培养方法

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.016

中国组织工程研究

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

原代人宫颈癌细胞的培养方法

程静新^{1, 2}，马秀萍³，周萍¹，袁敏¹，黄坤¹，张怡²

1新疆医科大学附属肿瘤医院妇科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 831100
2中南大学湘雅医院妇科，湖南省长沙市 410008
3昌吉市第二人民医院，新疆维吾尔自治区昌吉市 831100

收稿日期:2012-08-25 修回日期:2012-09-20 出版日期:2013-04-09 发布日期:2013-04-09
通讯作者: 张怡，教授，中南大学湘雅医院妇科，湖南省长沙市 410008 zhangyi@136.com
作者简介:程静新★，女，满族，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，硕士，主任医师，主要从事宫颈癌基础与临床研究。 13899899061@139.com
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2010211A31)

Culture methods for primary cervical carcinoma cells

Cheng Jing-xin^{1, 2}, Ma Xiu-ping³, Zhou Ping¹, Yuan Min¹, Huang Kun¹, Zhang Yi²

1 Department of Gynecology, Cancer Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 831100, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
2 Department of Gynecology, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China
3 Second People’s Hospital of Changji City, Changji 831100, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2012-08-25 Revised:2012-09-20 Online:2013-04-09 Published:2013-04-09
Contact: Zhang Yi, Professor, Department of Gynecology, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China zhangyi@136.com
About author:Cheng Jing-xin★, Master, Chief physician, Department of Gynecology, Cancer Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 831100, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Department of Gynecology, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China 13899899061@139.com
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2010211A31*

摘要/Abstract

摘要：

背景：在体外分离、培养宫颈癌上皮细胞, 从细胞水平及分子水平研究肿瘤病因及治疗的基础，是宫颈癌组织工程研究的最基本环节。
目的：探讨适用于组织工程宫颈癌研究的人宫颈癌原代细胞培养方法以及传代后细胞形态变化、增殖的特性。
方法：0.25%胰蛋白酶和2%Ⅰ型胶原酶联合消化法体外培养宫颈癌原代细胞，荧光倒置显微镜下观察肿瘤细胞形态、体外生长情况，免疫组化法检测体外培养宫颈癌细胞表面标记物CK17和肿瘤细胞增殖抗原Ki67表达。
结果与结论：采用胰蛋白酶与Ⅰ型胶原酶联合消化法体外分离培养人宫颈癌细胞，该法相对简单且重复性较好，所得到的原代细胞纯度较高。经体外传代培养的宫颈癌细胞仍可保持稳定的细胞表型。宫颈癌细胞表面标记物CK17阳性表达，证实细胞为上皮源性，肿瘤细胞增殖抗原Ki67表达阳性提示所培养细胞具有肿瘤细胞恶性增殖的特性。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, 细胞培养, 宫颈, 上皮细胞, 培养基, 胰蛋白酶, Ⅰ型胶原酶, 原代细胞, 体外培养, 生长特点, 肿瘤标记物, CK17, Ki67, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: In vitro isolation and culture of cervical epithelial carcinoma cells is the foundation for studying tumor etiology and treatment from the cellular level, which is the most basic aspect of cervical cancer tissue engineering research.
OBJECTIVE: To investigate the culture methods for primary cervical carcinoma cells, and passaged cell growth, proliferation and shape in vitro.
METHODS: We isolated and cultured primary cervical carcinoma cell by using enzyme joint digestion technique (0.25% trypsin and 2% type I collagenase), observed the shape of the tumor cell and condition of the cell proliferation using the inverted fluorescent microscope, and detected CK17 and Ki67 expression by immunofluorescence.
RESULTS AND CONCLUSION: Cervical epithelial carcinoma cells harvested using the enzyme joint digestion technique had a higher purity, and this technique was relatively simple to be repeated. The passaged cervical epithelial carcinoma cells also had a stable cell phenotype. CK17 positive expression indicated the cultured cells were cervical epithelial carcinoma cells and Ki67 positive expression showed that the cultured cells had the proliferative characteristics of malignant tumor cells.

Key words: tissue construction, cytology experiment in tissue construction, cell culture, cervix, epithelial cells, medium, trypsin, collagenase type Ⅰ, primary cells, in vitro culture, growth characteristics, tumor markers, CK17, Ki67, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

程静新，马秀萍，周萍，袁敏，黄坤，张怡. 原代人宫颈癌细胞的培养方法[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.016.

Cheng Jing-xin, Ma Xiu-ping, Zhou Ping, Yuan Min, Huang Kun, Zhang Yi. Culture methods for primary cervical carcinoma cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.016.

图/表（结果） 5

2.1　原代、传代细胞培养情况　两种不同的培养方法比较，组织块法培养的细胞在培养24 h后未见贴壁，继续培养48 h时出现污染；酶联合消化细胞在培养24 h时，可见较多的圆形漂浮于培养液中的死亡细胞，少量细胞贴壁，体积较小，个体呈多边形、椭圆形、蝌蚪状或短梭形，成团形成明显癌巢，见图1；72 h后可见细胞已经分裂增殖并形成细胞集落，呈分散分布，细胞胞核明显，胞质透亮、可见少许颗粒，细胞折光性强，见图2。继续培养，各集落中的细胞数量明显增多，细胞融合成片，10 d左右时细胞融合已达80%以上，见图3，细胞呈细梭形、多边形，胞核亦呈不规则的细长形，传代后宫颈癌细胞呈不规则形，平铺生长，细胞形态均不规则，以多边形、菱形、梭形多见，分布不均匀，12 h即可贴壁，72-96 h后细胞融合可达80%，生长速度较原代细胞快，生长迅速而增殖活跃，见图4。冻存的第7代细胞复苏后贴壁较好，细胞形态与原代细胞无明显差异，生长旺盛，见图5。

2.2 宫颈癌细胞体外的生长趋势及特点原代细胞生长缓慢，潜伏期为三四天，一般自第5天起逐渐进入对数生长期，但生长速度平稳；传代后宫颈癌细胞，潜伏期为一二天，第3天开始生长迅速，并呈现平稳上升趋势，见图6。传代后细胞生长较原代快，细胞体积较原代细胞大，原代与传代细胞之间无明显形态学差异。

2.3 细胞表面标记的鉴定及及增殖活力的检测 CK17是宫颈储备细胞和复层鳞状上皮基底细胞的标记物[4-5]，其阳性表达部位在细胞质；宫颈癌细胞分子标志物CK17均为阳性表达，进一步证实培养的细胞来源于上皮类细胞，见图7。肿瘤细胞具有无限增殖能力，细胞核增殖抗原Ki-67表达于癌细胞核，主要用于判断细胞的增殖活性[6-7]，阳性表达为棕黄色，部位在细胞核，在宫颈癌细胞中可见表达，且Ki-67的阳性表达率为61.4%，见图8，说明体外培养的宫颈癌细胞具有恶性肿瘤增殖的能力。

参考文献

[1] Situ ZQ,Wu JZ. Xi’an: Xi’an world Publishing Corporation. 2004:33-320.司徒镇强,吴军正.细胞培养[M].西安:世界图书出版社,2004: 33-320.

[2] Ma XP,Cheng JX,Zhang Y,et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(11):1959-1962.马秀萍,程静新,张瑜,等.人宫颈癌细胞的体外培养及鉴定[J].中国组织工程研究,2012,16(11):1959-1962.

[3] E Z.Beijing: Peking Union Medical College Press. 2004: 311-321.鄂征.组织培养技术及其在医学研究中的应用[M].北京:中国协和医科大学出版社, 2004: 311-321.

[4] Ding L,Yang YG,Mei X,et al. Zhenduan Binglixue Zazhi. 2009; 16(3):174-176.丁岚,杨永国,梅霞,等. CK17和p16在宫颈鳞状上皮不成熟化生和宫颈上皮内瘤变中的表达及意义[J].诊断病理学杂志,2009, 16(3):174-176.

[5] Regauer S, Reich O.CK17 and p16 expression patterns distinguish (atypical) immature squamous metaplasia from high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN III). Histopathology. 2007;50(5):629-6.

[6] Wang CH. Zhongguo Xiandai Yisheng. 2010; 48(16): 14-15, 19.王川红. 宫颈癌中p- STAT3与Ki67的表达与意义[J].中国现代医生, 2010, 48(16): 14-15, 19.

[7] Fan SZ,Yuan ZF. Zhengzhou Daxue Xuebao. 2010;45(1): 81-84.樊素珍,苑中甫. 宫颈癌组织中Annexin A2和Ki-67蛋白的表达[J].郑州大学学报,2010,45(1):81-84.

[8] Pectasides D, Kamosioras K, Papaxoinis G, et al. Chemotherapy for recurrent cervical cancer. Cancer Treatment Reviews. 2008; 34(7): 603-613.

[9] Zhao EF, Bao L, Li C,et al. Changes in epidemiology and clinical characteristics of cervical cancer over the past 50 years.Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao. 2005;25(6):605-609.

[10] Qin JL,Gulinar Kuerban,Meiliban Tuerxun,et al.Jiepou Kexue Jinzhan. 2010; 16(2): 113-116, 120.秦积龙, 古力娜尔•库尔班, 美力班•吐尔逊, 等. 新疆维吾尔族妇女宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中FHIT、P16INK4a、RARβ蛋白的表达及意义[J]. 解剖科学进展, 2010, 16(2): 113-116, 120.

[11] Meiliban Tuerxun, Gulinar Kuerban, Qin JL,et al. Jiepou Kexue Jinzhan. 2011; 17(3): 206-210.美力班•吐尔逊, 古力娜尔•库尔班, 秦积龙, 等. 新疆维吾尔族妇女宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中树突状细胞的检测及意义[J]. 解剖科学进展, 2011, 17(3): 206-210.

[12] Yang J,Chen XL,Su BS,et al. Xi’an Jiaotong Daxue Xuebao. 2008; 29(6): 717-719.杨军,陈晓黎,苏宝山,等.增强型绿色荧光蛋白标记的Hela细胞株的建立[J].西安交通大学学报:医学版, 2008, 29(6): 717-719.

[13] Reya T, Morrison SJ, Clarke MF,et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells.Nature. 2001;414(6859):105-111.

[14] Marx J.Cancer research. Mutant stem cells may seed cancer. Science. 2003;301(5638):1308-1310.

[15] Couzin J. Tracing the steps of metastasis, cancer's menacing ballet.Science. 2003;299(5609):1002-1006.

[16] Al-Hajj M, Becker MW, Wicha M, et al. Therapeutic implications of cancer stem cells.Curr Opin Genet Dev. 2004; 14(1):43-47.

[17] Reya T, Morrison SJ, Clarke MF,et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells.Nature. 2001;414(6859):105-111.

[18] Jiang SQ,Tu SA,Zhou JL,et al. Zhongguo Fuyou Baojian. 2006; 21(4): 524-526.姜淑清,土送爱,周俊兰,等. 新疆策勒县妇女病现状调查与分析[J].中国妇幼保健,2006, 21(4): 524-526.

[19] Ablimit Tangnur,Turgan Muyassaer, Abliz Guzalnur,et al.Zhonghua Liuxingbingxue Zazhi. 2011;32(5): 477-480.唐努尔•阿布力米提, 穆也沙尔•吐尔干, 古扎丽努尔•阿不力孜,等. 新疆宫颈癌高发区维吾尔族人群人乳头瘤病毒亚型的研究[J]. 中华流行病学杂志,2011,32(5): 477-480.

[20] Rockett JC, Larkin K, Darnton SJ, et al. Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization. Br J Cancer. 1997;75(2): 258-263.

[21] Zhao XF,Wang JK,Zhang XL,et al. Hebei Beifang Yixue Xuebao. 2007;24(1):35-37.赵秀芳,王金科,张晓丽,等.乳腺癌原代细胞培养及化疗药敏的研究[J].河北北方医学学报,2007,24(1):35-37.

[22] Lu ZT,Li M,Zou ZQ,et al. Guoji Zhongliuxue Zazhi. 2008;35(7): 553-556.卢兆桐,李明,邹志强,等. 食管癌细胞体外培养药敏试验与P—gp、LRP表达的相关性研究[J].国际肿瘤学杂志,2008,35(7): 553-556.

[23] Liu DC,Guo YH. Xiandai Zhongliu Yixue. 2009;17(4):699-701.刘德传,郭以河.MTT 法测定大肠癌对化疗药物敏感性的实验研究[J].现代肿瘤医学,2009,17(4):699-701.

[24] Hao WP,Yao YS,Wang JW,et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(50):9348-9351.郝维平,姚友生,王家伟,等.人类膀胱移行上皮细胞的体外培养与鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(50): 9348-9351.

[25] Cai HY,Yu B,Bai X,et al. Linchuang Junyi Zazhi. 2011;39(4): 611-612.蔡慧云,于波,白雪,等.简便人大肠癌原代细胞培养方法的探讨[J].临床军医杂志, 2011,39(4):611-612.

[26] Fang LJ,Song E,Luan Y,et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(45):8450-8454.方立建,宋鄂,栾瑛,等.人脐带血内皮祖细胞体外培养和鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(45):8450-8454.

[27] Liu N,Hu C,Ren Y,et al. Yatai Chuantong Yiyao. 2011;7(3): 12-14.刘念,胡超,任野,等.人子宫内膜细胞体外培养技术的改良研究[J].亚太传统医药,2011,7(3):12-14

引言

材料方法

设计：细胞实验观察。
时间及地点：实验于2011年1月在新疆医科大学第一附属医院科技楼细胞室完成。
材料：
标本：宫颈癌组织由新疆肿瘤医院提供，经病理证实为宫颈鳞癌，取材前未进行放化疗。
主要试剂和仪器：胰蛋白酶，Ⅰ型胶原酶，噻唑蓝，二甲基亚砜(美国Sigma公司)，DMEM(高糖)培养基，胎牛血清(美国GIBCO公司)，CK17抗体(鼠抗人单克隆抗体)(Pierce公司)，鼠抗人Ki-67单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司)，25 cm培养瓶，96孔培养板，10 cm培养皿(Firse公司)，R40-ⅡA2型超净台(青岛海尔)，371型CO2培养箱(Thermo Scientific)，IX71型倒置显微镜(OLYMPUS)，全自动酶标仪(BIO-RAD)。
方法：
宫颈癌细胞培养：取宫颈活检及术中切除的宫颈癌新鲜标本，迅速送至实验室。①采用胰蛋白酶及胶原酶联合消化法[1-2]：在超净台内将宫颈癌组织块移入10 cm培养皿中用眼科剪
剪碎成糊状，先加入3 mL的0.25%胰蛋白酶消化，放置37 ℃，体积分数为5%CO2孵箱中消化15-20 min，每隔5 min振荡1次，待组织消化为果冻状(注意观察组织的黏度，若组织消化为透明的液态，则消化过度)，弃上清加入0.2%胶原酶2.0-3.0 mL，放置37 ℃ CO2孵箱，振荡消化30-60 min(胶原酶要将组织完全消化溶解)，加含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液3 mL混匀，200目滤网过滤，1 000 r/min离心5 min；弃上清，加入含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养液，充分混匀，接种于25 cm培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。②组织块培养法[3]：无菌条件下将宫颈癌组织剪成1 mm×1 mm
左右大小的组织块，放入培养皿中加含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养液，置CO2孵箱培养，隔日观察细胞贴壁情况给予换液，培养瓶中细胞代谢的沉淀物用PBS轻柔吹打冲洗干净，更换新的培养液。
原代细胞系的维持：原代肿瘤细胞接种后24 h大部分细胞已贴壁，未贴壁的死亡及凋亡细胞呈圆形漂在培养液中，贴壁细胞聚集成团散在分布，细胞团块周边第3-5天开始爬出细胞，15 d左右细胞达单层融合，紧密镶嵌排列，给予首次传代，加入3 mL的PBS冲洗2次(宫颈癌细胞为贴壁生长细胞，冲洗时用玻璃弯管轻轻吹打冲洗细胞)，加入0.25%胰蛋白酶2.0-3.0 mL，放置孵箱中消化2.0- 3.0 min，显微镜下观察细胞发亮，伪足回缩立即加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，用弯管吹打，移入离心管1 000 r/min离心5 min，弃上清加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养液，放置体积分数为5%CO2培养箱培养，此后每3-5 d传代1次。
细胞生长动力学观察：取原代宫颈癌及传代宫颈癌细胞，消化后加含胎牛血清的培养基，将细胞浓度调整至5×103 L-1。接种于96孔板中，每孔100 μL。待细胞完全贴壁后(约24 h)后降低血清浓度，换为含体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养液，置于37 ℃CO2孵箱中培养，适时换液，每天固定时间随机抽取6孔细胞，加入20 μL的MTT溶液，放置孵箱中继续孵育4 h，吸净孔内液体，每孔加入150 μL的二甲基亚砜，在酶联免疫测定仪上振荡10 min检测波长为490 nm的滤光片测定每孔的吸光度，取6孔吸光度均值，以时间(d)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标绘制生长曲线。
宫颈癌细胞表面标志物CK17的检测：取传代后生长状态好的第3代宫颈癌细胞消化、爬片，期间倒置显微镜下观察细胞形态学变化。培养细胞长满载玻片70%-80%时取出载玻片，以40 g/L多聚甲醛固定，PBS冲洗，加入含1%BSA的1×PBS稀释至工作浓度的一抗(鼠抗人单克隆抗体) 4 ℃过夜，避光加入用含1%BSA的1×PBS稀释至工作浓度的荧光素二抗，37 ℃反应30 min，荧光显微镜下观察，细胞呈绿色为阳性，收集图像。
免疫组化法检测分子标志物Ki-67的表达：取对数生长期第2，3代细胞消化，爬片放置培养皿中、置于37 ℃含体积分数为5%CO2饱和湿度温箱内培养，待细胞基本长成单层，取出长有细胞的载玻片，加入体积分数为95%的乙醇固定，滴加一抗，4 ℃过夜，滴加试剂1，室温孵育10-20 min，滴加试剂2，DAB溶液显色，在显微镜下观察显色情况，浸入苏木精染液，体积分数为95%的乙醇脱水、中性树胶封固，光学显微镜下观察分子标志物的表达情况。
宫颈癌细胞的冻存与复苏：取对数生长期的宫颈癌细胞，用PBS漂洗1遍，加0.25%胰蛋白酶2.0-3.0 mL，放置CO2孵箱消化1.0-2.0 min，倒置显微镜下观察细胞形态变化，待细胞发亮，变圆，用弯管吹打细胞，至细胞完全脱落后，移入离心管，离心1 000 r/min×5 min，用培养液重悬细胞，计数，按1×106浓度冻存，冻存液为培养液比例为8∶1∶1 (8份血清，1份二甲基亚砜，1份DMEM)，细胞冻存后放置液氮罐中永久保存。复苏时将细胞从液氮中取出，37 ℃水浴融化，离心1 000 r/min×5 min，加入DMEM培养液打匀细胞，接种培养瓶培养。

讨论

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，给广大妇女带来了无尽的痛苦，全球每年约有50万例宫颈癌的新发病例[8]，其中80%发生在发展中国家，它已成为发展中国家妇女死亡的主要原因，死亡率仅次于乳腺癌[9]，居第2位，严重威胁妇女的健康和生命[10-11]。肿瘤细胞系是目前研究肿瘤的重要手段之一，至今国内外已建立多种人体肿瘤细胞系，为肿瘤研究提供了理想的模型[12]。对于恶性肿瘤的治疗，不断有学者提出新的观点，有学者认为肿瘤是一种干细胞疾病，而肿瘤干细胞是来源于肿瘤组织，它具有成瘤能力和分裂增殖能力，它是肿瘤的发生、发展和转移和复发的根源[13-15]，并与肿瘤细胞有不同分化表型的细胞[16]。肿瘤干细胞和正常组织干细胞可能存在某些细胞膜蛋白表达差异，可以成为抗肿瘤抗体的新靶标，治疗应该针对肿瘤干细胞，只有杀死全部肿瘤干细胞才能最终治愈肿瘤[17]。

然而目前多数研究报道是针对于细胞系进行的研究，其结果只能代表一种肿瘤细胞系的表达情况，肿瘤存在个体差异，不同个体所表达的细胞及基因水平可能存在差异。若在宫颈癌中同样证实有“癌症干细胞”存在，体外分离培养、提取肿瘤干细胞，对肿瘤干细胞进行药敏实验及相关基因的研究，根据药敏结果进行药物选择化疗将在很大程度上提高化疗的有效性，减少化疗的耐药性。对于肿瘤致病机制以及实现肿瘤个体化治疗模式必将起到强大推进的作用。新疆是全国宫颈癌的高发区之一，有资料统计新疆和田策勒县维吾尔族宫颈癌患病率为527/10万[18]，是北京市妇女宫颈癌患病率的210倍。喀什伽师县夏普桃勒乡普查宫颈癌患病率为459/10万[19]。国内文献报道新疆医科大学附属肿瘤医院收治恶性肿瘤的构成比中宫颈癌占第一位，就诊患者中多数为中晚期患者，失去了直接手术的机会，需先进行放化疗，降低手术的病理级别和提高手术的切除率，因而术前的新辅助化疗已成为宫颈癌综合治疗的重要手段，临床的化疗基本是经验用药，化疗的疗效仍不能令人满意。为此，需要体外原代培养宫颈癌细胞进行药敏实验筛选患者相对敏感的化疗药物化疗并建成新疆特色宫颈癌细胞株，为相关研究提供实验基础，进一步研究新疆地区宫颈癌与全国其他地区宫颈癌是否存在细胞及分子水平的差异。国外研究报道关于宫颈癌原代细胞培养的较少，文献报道中原代食管癌采用组织块法培养成功率为12.5%(5/40)[20]，培养的成功率较低，培养过程中易出现污染，分析其原因是组织块培养法选择培养皿进行培养，相对于细胞经过过滤网过滤在培养瓶中培养，它与外界接触的面积较大，且宫颈癌组织是开放的器官，组织本身存在炎症，未经过滤，操作中比较容易被污染。本实验采用酶联合消化法对24例宫颈癌细胞进行体外培养，体外培养宫颈癌细胞成功率为25%(6/24)，与食管癌相比较成功率有所提高。食管癌与宫颈癌同为鳞状上皮肿瘤，采用酶联合消化法可能同样提高食管癌培养的成功率。采用酶联合消化法，体外培养宫颈癌细胞，操作方法简便，但原代宫颈癌细胞培养对血清要求高，体积分数为10%-15%，血清浓度低影响细胞贴壁，这可能是细胞刚刚离体对环境的适应需要过程，原代细胞在25 cm培养瓶中生长较培养皿好，且不易污染，传代后可降低血清到体积分数为5%，倒置显微镜下观察细胞状态较好。原代细胞培养过程中常伴有成纤维细胞的污染和过度增殖，需要纯化去除成纤维细胞，本实验中用胰酶消化法反复消化去除成纤维细胞的影响，成纤维细胞对胰蛋白酶较为敏感，首先被消化下来，通过消化、反复贴壁的方法去除成纤维细胞，但注意胰蛋白酶消化时间不宜过长，经过二三次传代后成纤维细胞可被去除，此法可进一步提高细胞的纯度。本实验采用上述方法对24例新鲜标本进行原代培养，其中有2例取材时污染，5例培养传代过出现细菌污染，3例出现杆菌污染，3例因胰蛋白酶消化时间过长，细胞未贴壁，2例真菌污染，3例细胞株交叉污染。实验中培养原代肿瘤细胞，传代10代以上，可满足实验需要，进行后续实验的仅6例。培养的成功率为25%，培养失败的最主要的原因是细胞污染，因为宫颈是一相对开放性器官，肿瘤表面通常附有细菌或霉菌及其他感染，因此培养前需要仔细处理避免污染问题。取材时严格无菌操作，避免取坏死组织，将所需标本取下浸入无菌的含双抗的DMEM培养液中。在超净台内使用含双抗PBS浸泡并反复冲洗标本，冲洗过程中注意去掉血渍及坏死组织，以保证冲洗效果，经上述处理后可降低污染的概率。另外细胞培养需要一个相对无菌的坏境，培养过程严格无菌操作，器械要高温消毒，细胞培养箱要定期消毒，避免原代细胞与癌株同台操作，导致交叉污染。

原代细胞的体外培养及其相关基因的研究及体外的药敏实验成是目前研究的热点，体外药敏实验在乳腺癌，食管癌、大肠癌等中广泛应用[21-23]，对于各类癌症患者来说，因个体之间存在差异，在治疗前能对个体的细胞进行培养和药敏，选择个体敏感的药物进行治疗，是化疗成功的关键，它能直接地帮助研究者了解抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤情况，给予敏感的药物进行化疗，提高化疗的有效性，被认为是肿瘤个体化治疗的一种理想模式。然而在实验中发现原代宫颈癌细胞的生长周期相对较长，一般为10-15 d长满培养瓶，细胞体积较小，形态不规则。传代后的细胞生长较快，二三天长满培养瓶。然而细胞传代过程中可能因消化时间过长或细胞污染等因素，存在细胞系丢失的风险，就目前的实验结果来说，原代肿瘤细胞的培养，传代至完成一次药敏实验需要25-29 d，这对于实现肿瘤的个体化的临床治疗带来了巨大的困难，目前文献报道中原代细胞的培养在各类组织都获得了一定得成功[24-27]，没有规范的同一培养标准，同时可能因为地区差异等因素，细胞培养的方法各不相同，细胞的生长周期也存在差异，随着科学技术的不断进步，细胞培养技术的不断完善和提高，目前实验中所面临的问题将逐一规范化、系统化的得到解决。

实验采用胰蛋白酶与胶原酶联合消化法体外分离培养人宫颈癌细胞，该法相对简单且重复性较好，所得到的原代细胞其纯度较高，采用角蛋白抗体(CK17)进行免疫组化分析，染色为阳性证实细胞为上皮源性，并检测Ki67表达阳性提示所培养细胞具有肿瘤细胞恶性增殖的特性，如此获得较为可信的鉴定结果。经体外传代培养的宫颈癌细胞仍可保持稳定的细胞表型，可认为是一种理想的细胞培养方法，有助于宫颈癌的体外实验研究。

原代人宫颈癌细胞的培养方法

Culture methods for primary cervical carcinoma cells

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王丰, 周立宇, 赛吉拉夫, 齐士斌, 马艳霞, 韦善文. CaMKⅡ-Smad1促进外周神经的轴突再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1064-1068.
[2]	徐彬, 杨秀书, 刘旋, 王振兴. 尿液环境中肠上皮细胞及其凋亡因子半胱氨酸蛋白酶3、Bax和Bcl-2表达的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3173-3177.
[3]	从人愿, 袁静, 夏金婵, 孙颖. 黄芩苷对脂多糖联合三磷酸腺苷刺激BEAS-2B细胞氧化应激的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 286-291.
[4]	严秀蕊, 陶金, 梁雪云. 人胎盘间充质干细胞来源外泌体保护氧化应激损伤肺上皮细胞的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2994-2999.
[5]	赵双丹, 郑嘉华, 亓文博, 黄向华. 间充质干细胞外泌体应用于生殖系统疾病治疗的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3097-3102.
[6]	杨帆, 刘保一, 刘家河, 杨佳慧, 覃开蓉, 赵德伟. 体外培养SD大鼠关节软骨细胞原代至第3代的形态学特点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2161-2165.
[7]	蔡原, 邓呈亮. 脂肪干细胞无细胞提取液的治疗用途：皮肤老化、创面愈合、瘢痕恢复乃至神经再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2097-2102.
[8]	颜南, 司晓凤, 曾亮, 田伟, 单广东, 熊礼硕, 杨炜杰, 王正东. 神经生长因子干预大鼠骨骼肌卫星细胞增殖及α-肌动蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2030-2035.
[9]	徐金辉, 秦绪祯, 张鸿程, 马艳霞, 齐士斌, 赛吉拉夫. 无血清培养基和有血清培养基对背根神经节生长的差异[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2043-2048.
[10]	周立宇, 马艳霞, 齐士斌, 赛吉拉夫, 韦善文, 倪莉. 硫化氢缓释供体ADT-OH对神经前体细胞增殖的调控[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 96-100.
[11]	陶贵录, 楚同彬, 张雷. 骨髓间充质干细胞条件培养基加入罗格列酮后促进内皮祖细胞的增殖与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 56-60.
[12]	许国峰, 李学斌, 唐一钒, 赵寅, 周盛源, 陈雄生, 贾连顺. 人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1174-1181.
[13]	周玉, 龙小安, 李宁, 王纯. 有限元法分析髌腱炎状态时的生物力学变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1280-1286.
[14]	李芹, 夏翠萍, 刘晓红, 徐志云, 龚德军, 吴昊. 脱细胞猪膀胱支架的构建[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 572-576.
[15]	陈沛杉, 张海燕. 器官芯片与工程化人体组织在药物研发中的应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(29): 4717-4723.