衰老血管内皮细胞线粒体膜电位与活性氧的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.010

摘要/Abstract

摘要：

背景：血管内皮细胞衰老、凋亡与再生的平衡对正常血管的功能维持具有极其重要的作用。而线粒体是机体细胞内的重要细胞器，除了合成ATP为细胞提供能量外，还控制细胞程序性死亡、以及衰老等多种病理生理的代谢过程。
目的：通过检测脐静脉内皮细胞传代过程中线粒体膜电位与活性氧的改变及其相互关系，从而探讨细胞衰老过程中所产生的功能障碍。
方法：体外培养人脐静脉内皮细胞，选取传代过程中的第2，4，6，8代细胞，采用流式细胞术检测细胞线粒体膜电位及活性氧变化。选取第2，8代细胞行透射电镜检查，观察正常及衰老细胞超微结构的改变。
结果与结论：传代衰老过程中，血管内皮细胞线粒体膜电位逐代降低，而胞内活性氧则出现由增加转而降低的过程。传代后期血管内皮细胞同早期内皮细胞相比，线粒体及内质网明显减少。说明内皮细胞在传代导致的复制性衰老过程中，线粒体膜电位降低，线粒体受损。而在早期传代过程中线粒体轻度受损，而活性氧产生增加，但在线粒体严重受损、功能严重退化过程中，活性氧产生降低。

关键词: 组织构建, 血管组织构建, 内皮, 衰老, 线粒体, 活性氧, 膜电位, 细胞, 传代, 血管, 超微, 退化

Abstract:

BACKGROUND: Balance among aging, apoptosis and regeneration of vascular endothelial cells exerts a critical role in maintenance of the function of normal vessels. Mitochondria are a key cell organelle in the body, which cannot only support energy for the cells via adenosine triphosphate synthesis, but also control the procedure death, aging of cells as well as many pathophysical metabolism processes.
OBJECTIVE: To investigate the relationship between mitochondria membrane potentials and reactive oxygen species of endothelial cells during growing and senescence process in order to explore the dysfunction occurring during the senescence process.
METHODS: Human umbilical vein endothelial cells were cultured in vitro and passaged. Passages 2, 4, 6 and 8 human umbilical vein endothelial cells were selected to detect those mitochondria membrane potentials and reactive oxygen species. Levels of reactive oxygen species and mitochondria membrane potentials were checked by flow cytometry. At the same time, passage 2 and 8 cells were selected for observation of normal and aging ultramicro-morphoses by electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: During the passage and senescence, mitochondria membrane potentials were decreased gradually with cell passage, while the levels of reactive oxygen species were increased firstly and then decreased. The number of mitochondria and reticulum was reduced along with cell passage. In replicate aging process, the mitochondrial membrane potential was decreased and the mitochondrion was damaged. At the first time the production of reactive oxygen species was increased, while decreased along with the cell degeneration.

Key words: tissue construction, vascular tissue construction, endothelium, aging, mitochondria, reactive oxygen species, membrane potential, cells, passage, vessels, advanced micro devices, degeneration

中图分类号:

R318

赵海梅，杨斌，成蓓. 衰老血管内皮细胞线粒体膜电位与活性氧的变化[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.010.

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。
时间及地点：实验于2005年6月至2010年6月在华中科技大学同济医学院附属协和医院老年科实验室完成。
材料：
脐带标本：取足月剖腹产后婴儿新鲜脐带，约15 cm，由南昌大学第三附属医院妇产科提供，产妇知情同意用于实验研究，经医院伦理委员会批准。
主要试剂和仪器：
Main reagents and instruments:

方法：
脐静脉内皮细胞的提取、培养与传代：原代血管内皮细胞取自新鲜脐带，约15 cm，剪除两侧受损部分，PBS冲洗静脉腔内淤血。止血钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉内注入0.25%胰蛋白酶约10 mL。放入37 ℃ PBS中孵化10 min。吸出脐静脉内消化液，同时加入新生胎牛血清终止消化。1 000 r/min(离心半径13.5 cm)离心 5 min。吸除上清液，加入M199完全培养基(M199，含体积分数为20%胎牛血清，4 μg/L血管内皮生长因子)混合。在细胞计数板中计数。调整细胞数，以5×108 L-1接种在25 cm2培养瓶中。置于体积分数为5%CO2，37 ℃条件下培养。当培养瓶中脐静脉内皮细胞融合达80%以上，应用胰蛋白酶消化分离后依据上述方法行传代培养。
脐静脉内皮细胞的鉴定：选取第2代细胞进行血管内皮细胞的鉴定。在6孔培养板中放置无菌盖玻片，每孔中滴加分散的细胞悬液，待内皮细胞生长至近融合状态时取出盖玻片，PBS冲洗3次，投入冷丙酮中(-18- -20℃)，作用7 min，PBS冲洗3次，每次1 min，进行免疫组化染色。一抗为鼠抗人VWF单克隆抗体，1∶20倍稀释，加入50 μL于盖玻片上，放入湿盒内4 ℃过夜。同时不加一抗做阴性对照。隔天用PBS冲洗5次后，加入辣根过氧化酶标记的二抗50 μL，37 ℃孵育2 h后，PBS洗涤5次。用DAB显色试剂盒显色，显微镜下观察鉴定。
线粒体膜电位(ΔΨm)的检测：选取第2，4，6，8代细胞，培养瓶中细胞培养融合达80%左右，0.25% 胰蛋白酶消化，M199培养基(无血清)冲洗2次，加入PBS，调整细胞浓度至4×108 L-1。后加入线粒体膜电位特异染料3,3’-DIHEXYLOXACARBOCYANINE IODIDE(用二甲基亚砜配成2 μmol/L的储存液)2 μL，流式细胞仪检测(激发光波长488 nm，发射光波长530 nm)。采用BD公司的sinmulSET软件进行测定及分析。
细胞内活性氧的检测：分别选取第2，4，6，8代细胞，培养瓶中细胞融合达80%左右，0.25%胰蛋白酶消化，M199培养基(无血清)冲洗2次，加入PBS，调整细胞浓度至4×108 L-1。加入1 μL 5 mmol/L的2',7'-二氯氢化荧光素二酯(DCFH2DA，用无水乙醇配置)，流式细胞仪检测荧光强度。
透射电子显微镜观察细胞传代过程中超微结构的改变：选取第8代脐静脉内皮细胞进行电子显微镜观察。铺满培养瓶底的脐静脉内皮细胞经0.25%胰酶消化，2.5%戊二醛缓冲固定液固定30 min，0.1 mol/L PBS冲洗2次，每次20 min，1%锇酸后固定60 min，体积分数为50%乙醇、体积分数为70%乙醇、体积分数为90%乙醇、体积分数为90%乙醇丙酮、100%丙酮(2次)梯度脱水，每梯度脱水时间5 min，丙酮与环氧树脂1∶1混合物浸透 2 h，纯环氧树脂包埋剂浸透2 h，再依次进行包埋、聚合(80 ℃恒温箱10 h)、修块。切片机(德国LEICAULTRACUTUCT超薄切片机)切片，醋酸双氧铀，枸橼酸铅双重染色各10 min，透射电镜观察，拍照，记录。
主要观察指标：①脐静脉内皮细胞的形态。②脐静脉内皮细胞线粒体膜电位。③脐静脉内皮细胞活性氧含量。④透射电镜下观察血管内皮细胞包膜、胞核超微结构形态，线粒体、内质网数量及形状。
统计学分析：每组实验重复3次(n=3)。实验数据使用SPSS 11.0 for window 进行统计分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

线粒体是细胞进行有氧呼吸、电子传递、三羧酸循环、氧化磷酸化并产生能量的场地，是细胞重要的细胞器，其病变影响到细胞各成分的协调并危及细胞生命活动。细胞中线粒体数量取决于该细胞的代谢水平，代谢活动越旺盛的细胞线粒体越多。线粒体功能的丢失亦决定了细胞的损伤程度及细胞的死亡[5]。早期电镜观察可见细胞内含大量线粒体、内质网等细胞器，说明细胞生长状态良好，生长旺盛，线粒体与内质网物理位置紧密，显然与线粒体向粗面内质网提供蛋白合成所需的能量有关[6]。本实验证实脐静脉内皮细胞在传代过程中，细胞形态发生着明显的变化。在电镜下观察细胞超微结构发现衰老细胞线粒体、内质网等细胞器明显减少、退化或变性，表明细胞呼吸功能减退，分泌功能也由分泌旺盛发展为分泌障碍等。这些都说明在传代过程中，细胞形态与功能发生着明显的变化，细胞功能逐渐走向衰老。
线粒体跨膜电位(ΔΨm)的形成主要依赖于内膜上的电子传递链中的复合体Ⅰ，是反映细胞线粒体功能的重要指标。复合体Ⅰ实际上是个质子泵，在电子传递过程将质子打出内膜外，从而形成内膜外的高浓度质子电位势能和高pH化学势能，这是线粒体跨膜电位的基础。因此线粒体跨膜电位势能的维持和平衡对于线粒体的正常功能非常重要，其降低是衰老的标志，同时也是许多凋亡事件的前奏，膜电位的改变就意味着内膜的通透性发生了改变。因此线粒体跨膜电位是一种反映细胞毒性效应较灵敏的指标。3,3’-DIHEXYLO- XACARBOCY- ANINE IODIDE(DIOC6(3))是一种特异的具有亲脂性的荧光染料，能够透过线粒体膜进入线粒体内，小剂量DIOC6(3)可以用来监测线粒体膜电位大小[7]。利用它的特性来检测线粒体膜在传代过程中的变化。线粒体膜电位的大小可直接反映线粒体的功能及数量[8]。本实验中，反映细胞膜电位的DIOC6(3)荧光强度逐代发生有显著意义的降低，说明内皮细胞在传代过程中，伴随着细胞的老化，线粒体膜电位逐渐衰减。后者使线粒体肿胀，线粒体膜通透性转变孔开放增强，线粒体内的CYT-C、AIF等凋亡因子释放增加，激活某些蛋白酶系统，启动凋亡程序[9]。传代过程中，悬浮、凋亡细胞增多，可能原因之一是细胞线粒体膜电位降低增加了细胞的凋亡。这个过程中，线粒体内酶系统活性受损，使细胞氧化过程，包括氧化磷酸化过程发生障碍，ATP生成不足，细胞膜离子泵功能障碍，钠离子、钙离子、水分等进入细胞，导致细胞胞质基质水肿，继而线粒体肿胀，功能进一步受损，从而导致一系列的恶性循环。
细胞内绝大部分活性氧由线粒体代谢产生，并主要通过线粒体呼吸链复合物进行调节[10]。通常它们是通过一系列的酶严格的调控产生。但是在生产过程中无论是从线粒体电子传递链或NAD(P)H氧化应激的过度刺激，或灭活减少，细胞内可产生大量活性氧[11]。活性氧对于调解细胞生长有重要意义，恰当水平的活性氧可作为促进细胞增殖和存活的信号，而活性氧严重增加可以诱导细胞死亡[12]。大量自由基聚集，可对生物膜产生脂质过氧化作用，使生物膜受损，导致生物膜流动性下降。这些变化与线粒体膜电位的丢失，电子传递链的传递障碍有密切关系[13]。线粒体膜通透性增加，明显降低细胞及线粒体的功能，导致凋亡诱导因子释放而引起凋亡。线粒体受到严重损伤，功能降低，活性氧生成降低。在本实验中，胞内活性氧随着内皮细胞传代次数的增多先增加后降低。考虑其可能的原因为，细胞内氧化酶的活性随着细胞的衰老而逐渐降低，不能够有效地清理除去产生的活性氧。增加的活性氧在细胞内累积，损伤生物大分子如蛋白质、脂类、核酸等，造成其结构改变和功能丧失，甚至引起基因突变、DNA复制停止等，损伤的蛋白质半衰期延长，而衰老的细胞中蛋白质合成速率下降，导致受损伤的蛋白质更新率下降。在细胞传代末期，线粒体数量显著减少，残存的线粒体功能明显降低，导致呼吸功能受到抑制，因而产生的活性氧同样降低。在胞内过多的活性氧会引起更多活性氧的产生，并引起线粒体钙离子通道开放，导致钙超载，这些都可导致细胞的凋亡及死亡[14]。在胞内增多的活性氧促进线粒体跨膜电位的进一步下降，损伤生物膜、引起膜通透性和硬度增加、改变细胞内环境稳定性、引起细胞内DNA及蛋白质的损伤、干扰信号传导通路并且能抑制端粒酶的活性，从而加速细胞衰老，加重细胞的受损[15]。氧化应激中线粒体产生大量活性氧，线粒体本身对于活性氧非常脆弱，高浓度活性氧进一步损害线粒体，通过活性氧诱导更多活性氧产生，从而形成活性氧和线粒体功能障碍的恶性循环[16]。已有实验衰老模型，通过检测蛋白氧化的标志物发现了细胞内氧化蛋白的积聚，以及被氧化的生物大分子分子内和分子间交联产物增加[17]。因此大量的活性氧可以诱导细胞衰老和凋亡[18]。有研究证实在线粒体中大量表达抗过氧化氢酶等物质可以延长小鼠的寿命[19]。
而血管内皮细胞对于血管功能的调节起着重要的作用。其结构完整和功能正常是多种心血管疾病发生的重要影响因素。衰老及炎症因子等导致内皮细胞完整性的破坏和内皮细胞功能不全，内皮细胞的损伤直接导致了冠状动脉粥样硬化的发生和发展，暴露在高浓度活性氧中的内皮细胞中线粒体膜电位明显降低，基质膨胀，外膜破裂，细胞凋亡[20]。
总之，随着内皮细胞不断的传代，细胞形态退化，细胞增殖能力降低，显示细胞有明显的复制性衰老特征。在内皮细胞衰老的过程中，细胞内脂质过氧化作用增强，线粒体膜电位降低，必然导致线粒体功能的降低，可能是内皮细胞出现衰老变化的机制之一。