龟鹿胶、淫羊藿及红景天对骨质疏松大鼠骨密度及破骨细胞的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.002

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (15): 2669-2676.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.002

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龟鹿胶、淫羊藿及红景天对骨质疏松大鼠骨密度及破骨细胞的影响

杨澔侠¹，杨洋²，薛鹏²，周福贻²，王胜军¹

1无锡市第九人民医院，苏州大学附属无锡九院，江苏省无锡市 214062
2 南京中医药大学，江苏省南京市 210005

收稿日期:2012-12-27 修回日期:2013-01-18 出版日期:2013-04-09 发布日期:2013-04-09
通讯作者: 王胜军，医师，无锡市第九人民医院，江苏省无锡市 214062 wsj9527@sina.com
作者简介:杨澔侠，男，1967年生，江苏省无锡市人，汉族，1990年南京中医药大学毕业，副主任中医师，主要从事骨质疏松临床与实验研究。wxyhx1967@163.com

Turtle deer glue, epimedium, and rhodiola pills enhance bone mineral density of ovariectomized rats

Yang Hao-xia¹, Yang Yang², Xue Peng², Zhou Fu-yi², Wang Sheng-jun¹

1 Wuxi Ninth People’s Hospital, Wuxi 214063, Jiangsu Province, China
2 Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210005, Jiangsu Province, China

Received:2012-12-27 Revised:2013-01-18 Online:2013-04-09 Published:2013-04-09
Contact: Corresponding author: Wang Sheng-jun, Physician, Wuxi Ninth People’s Hospital, Wuxi 214063, Jiangsu Province, China wsj9527@sina.com
About author:Yang Hao-xia, Associate chief physician, Wuxi Ninth People’s Hospital, Wuxi 214063, Jiangsu Province, China wxyhx1967@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：中药研究骨质疏松症目前缺乏系统的药效学研究，中药组方尚欠精简，机制研究与中医理论指导不够紧密。
目的：观察中药复方龟鹿胶、淫羊藿、红景天对去卵巢大鼠血清各指标、骨密度及破骨细胞的的调控作用。
方法：建立去卵巢大鼠模型，分别用自拟中药组方龟鹿胶组、淫羊藿组、红景天组进行灌胃，以假手术组和模型组进行对比。造模后第4周开始称体质量，每周1次。造模后12周后测定大鼠骨密度、血清中钙、磷含量、血碱性磷酸酶活性等指标比较治疗效果，应用体外培养破骨细胞观察各组中药对破骨细胞抑制率的影响。
结果与结论：龟鹿胶能显著减少去卵巢大鼠体质量的增加幅度(P < 0.05)。相比模型组3种中药治疗组大鼠血清中钙含量明显升高(P < 0.05)，血磷与碱性磷酸酶活性明显降低(P < 0.01或P < 0.05)。龟鹿胶组和淫羊藿组大鼠骨密度显著高于模型组(P < 0.05)。3种中药治疗组与假手术组相比吸收陷窝数明显减少(P < 0.05)，其中红景天组吸收陷窝数减少较显著(P < 0.01)，红景天组对破骨细胞吸收功能具有抑制作用，抑制率为86.85%(P < 0.01)。结果证实，中药组方龟鹿胶、淫羊藿、红景天对去卵巢骨质疏松均具有显著疗效，其中龟鹿胶组和淫羊藿组主要以增加骨密度为主，红景天组具体表现在对破骨细胞吸收功能具有抑制作用。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, 骨质疏松症, 卵巢切除大鼠, 龟鹿胶, 淫羊藿, 红景天, 血清, 骨密度, 破骨细胞, 绝经, 血磷, 血钙, 碱性磷酸酶

Abstract:

BACKGROUND: At present, there are no systematic pharmacodynamic studies addressing osteoporosis
treatment with Chinese medicine. Chinese prescription is not simple enough and research on the mechanism is not close to the guiding of Chinese medicine theory.
OBJECTIVE: To observe the therapeutic effects of turtle deer glue, epimedium, and rhodiola pills on serum indices, bone mineral density and osteoclast regulation in ovariectomized rats.
METHODS: Ovariectomized rats were prepared and subjected to intragastric administration of turtle deer glue, epimedium and rhodiola in comparison with sham-surgery and model groups. The body mass was detected once a week starting from week 4. Bone mineral density, serum calcium, phosphorus content, and blood alkaline phosphatase activity were detected at week 12. Osteoclast inhibiting rates were evaluated by in vitro osteoclast culture model.
RESULTS AND CONCLUSION: The body mass increased for the model group, the turtle deer glue could significantly reduce the increase rate (P < 0.05). After 12 weeks, compared with the model group, the serum calcium content was significantly higher in the three Chinese medicine groups (P < 0.05), whereas the blood phosphorus content and alkaline phosphatase activity were obviously lower (P < 0.05). Bone mineral density in the turtle deer glue and epimedium groups was significantly increased as compared with that in the model group (P < 0.05). The number of resorption pits was decreased significantly in the three Chinese medicine groups, especially in the rhodiola group, as compared with the sham-surgery group (P < 0.05). Rhodiola pills could prohibit the absorptive function of osteoclasts, the inhibitory rate of which was 86.85% (P < 0.01). These findings indicate that turtle deer glue, epimedium, and rhodiola all have significant effects on ovariectomized osteoporosis. Turtle deer glue and epimedium mainly increase bone mineral density, while rhodiola pills prohibit the absorptive function of osteoclasts.

Key words: tissue construction, bone tissue construction, osteoporosis, ovariectomized rats, turtle deer glue, epimedium, rhodiola, serum, bone mineral density, osteoclasts, menopause, blood phosphorus, blood calcium, alkaline phosphatase

中图分类号:

R318

杨澔侠，杨洋，薛鹏，周福贻，王胜军. 龟鹿胶、淫羊藿及红景天对骨质疏松大鼠骨密度及破骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(15): 2669-2676.

Yang Hao-xia, Yang Yang, Xue Peng, Zhou Fu-yi, Wang Sheng-jun. Turtle deer glue, epimedium, and rhodiola pills enhance bone mineral density of ovariectomized rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(15): 2669-2676.

图/表（结果） 4

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引言

骨质疏松症发病率在中老年妇女中所占的比例较高。目前，全世界约有2亿人患骨质疏松症，中国约九千万患者，预计到2050年中国老年人口将达2.1亿，其中有25%-70%将患骨质疏松症，因骨质疏松症引起的一系列相关疾病将成倍增加，由此引起的医疗费用将呈快速增长趋势[1-2]。

骨质疏松症是一种常见的、全身性的骨代谢疾病，其特征是骨量减少、骨组织微结构退化，导致骨脆性增加从而引起腰背疼痛、骨密度下降、骨折等常见症状，并会发生身长缩短、驼背等；骨质疏松导致代谢紊乱，从而造成血钙偏高，由此引起一系列的与钙代谢紊乱相关的并发症，如高血压、冠心病、动脉硬化及脑血管疾病等。骨质疏松引起的各种疾病严重影响中老年人尤其是绝经后妇女的生活质量，加上医疗费用支出的增多、寿命的缩短等不仅对患者的身心健康造成危害，也增加了家庭和社会的经济负担，已被公认为仅次于心血管疾病的第2大健康杀手，成为极为严重的公共健康问题。因此，骨质疏松的防治是当前极为迫切的一项重大课题[3-5]。

目前防治骨质疏松症的药物主要有基础性用药(钙剂和维生素D)、骨吸收抑制剂(降钙素、雌激素、二膦酸盐)、骨形成促进剂(人甲状旁腺素)、混合制剂(锶盐类药物雷奈酸锶)及中药制剂等5类[6-17]。维生素D主要能够促进肠道内钙磷的吸收，调节甲状旁腺素的分泌及骨细胞的分化，以增强骨的形成为目的；维生素D与钙剂联合使用，可以防止高钙血症的发生；降钙素和二膦酸盐都是属于骨吸收抑制剂，临床研究结果证明降钙素能够短时间内迅速抑制破骨细胞的活性，减少破骨细胞的数量从而起到抑制骨吸收的作用；雌激素也是一种典型的
骨吸收抑制剂，它是通过抑制骨吸收以维持骨量；二膦酸盐类药物是目前常用的抗骨质疏松症药物，其作用机制是二膦酸盐与体内羟基磷灰石结合，抑制破骨细胞的分化、增殖，干扰成熟破骨细胞的功能，并促进其凋亡；甲状旁腺素是调节钙、磷代谢及骨转换的肽类激素之一，其作用机制尚不清楚；锶盐与其他抗骨质疏松药物不同，在减少骨吸收的同时可以增加骨的合成，主要用于减少绝经后妇女椎体和非脊柱骨折的发生。另外一些研究发现他汀类药物也具有增加骨密度，恢复微结构的作用。这些药物虽然可以不同程度地缓解骨质疏松症症状，但在治疗方面缺乏有效的措施使骨质疏松症患者的骨量恢复到正常，在治疗作用机制方面仍然存在许多争议。

虽然二膦酸盐、降钙素和雌激素等药物在治疗骨质疏松方面经临床确证疗效显著，但其昂贵的价格和可能引起的一系列并发症使众多患者望而生畏；雌激素替代疗法虽然是目前绝经后骨质疏松症治疗中疗效比较确切的治疗措施，但这种替代疗法需长期坚持，常引起乳房胀痛、阴道出血，并增加患乳腺癌、子宫癌的危险性；因此，探索新的有效的绝经后骨质疏松治疗手段十分必要。近来许多学者将研究重点放在中医中药的研究和开发上。

近年来的研究发现，中医中药在治疗骨质疏松方面具有较大的优势。中医注重“补肾壮骨”、“补肾健脾”、“活血化淤”3大理论，由此来指导骨质疏松的合理用药。中药可以通过调节体内微量元素的平衡，提高垂体、下丘脑等功能，促进骨钙吸收等方面防治骨质疏松症，其疗效尤为显著[18-26]。目前市场销售的中药方有：仙灵骨葆胶囊、金乌骨通胶囊、强骨胶囊；用于治疗骨质疏松症的中药新药如：骨松宝颗粒、骨疏康颗粒、晶珠六味壮骨颗粒等中药复方口服剂也在进行临床应用中，这些复方制剂的主要成分为人参、淫羊藿、骨碎补、熟地及丹参等。医院自创并命名的中医药复方也不断地在开发探索中。但目前关于中药治疗骨质疏松的作用机制尚不明了，在机制研究方面还存在一些问题，实验研究多以骨静力学为主，系统的药效学研究不够全面和深入，中药复方欠精简，作用机制的解方分析不够明确，机制研究与中医指导联系不够紧密。

实验从血清学指标、骨密度及细胞学等方面对自拟中药组方的药效学进行全面考察，观察中药复方龟鹿胶、淫羊藿、红景天对去卵巢大鼠血清各指标、骨密度及破骨细胞的的调控作用。

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2010年10月至2011年5月在南京中医药大学实验中心完成。
材料：
实验动物：健康10月龄雌性SD清洁级大鼠30只，体质量(200±20) g，由上海莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2003-0003。所有动物饲养条件一致，室温为(19±2) ℃，湿度为(58±12)%，自由摄食，饮水。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》[27]。
中药：实验用自拟中药组方，龟鹿胶组中药组方为鹿角20 g、龟板20 g、枸杞子20 g、人参10 g组成；淫羊藿组为淫羊藿10 g、丹参20 g、牡蛎30 g；红景天组为红景天30 g、黄芪30 g、山萸肉20 g。各组中药加水1 L，浸泡1 h，煎煮1 h，浓缩至900 mL，离心去除药渣，充分摇匀，定容至900 mL。大鼠灌胃前摇匀药液，每次灌胃1 mL，含生药龟鹿胶组80 mg，淫羊藿组 70 mg，红景天组90 mg。
破骨细胞培养相关仪器：
Instruments for osteoclast culture:

方法：
去卵巢大鼠模型的建立及分组：将30只大鼠随机分成5组：假手术组、模型组、龟鹿胶组、淫羊藿组、红景天组，每组6只。①假手术组以100 mg/kg氯胺酮腹腔麻醉，背侧切开腹腔，切除小块脂肪组织，不切除卵巢，3个月后开始灌注生理盐水，1 mL/只，1次/d。②模型组麻醉后，背侧切开腹腔，作双侧卵巢切除[28]。建模后3个月开始灌服生理盐水，1 mL/只，1次/d。③龟鹿胶组、淫羊藿组、红景天组双侧卵巢切除后3个月后开始按 20 mg/kg给予自行配制中药组方龟鹿胶、淫羊藿、红景天灌胃，1次/d，连续12周。各组大鼠于造模后第4周开始称质体质量，每周1次。
标本收集：
血清标本：给药后12周主动脉采血取血清样品作生化分析。体积分数10%乌拉坦腹腔麻醉动物，颈动脉插管取血，离心分离血清，-20 ℃保存待测。
骨组织标本：给药后12周动物取血后，作全身骨密度测量，然后分离左右侧股骨、腰椎椎体、左侧胫骨标本进行相应的处理及各项指标的检测。
大鼠破骨细胞培养：另选1只新生24 h内的SD大鼠消毒后，在无菌条件下取四肢长骨，机械分离破骨细胞，以5×104/cm2的密度接种于牛皮质骨薄切片上(5 mm× 5 mm)，培养液为体积分数15%FCS-MEN，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。
大鼠血清磷、血钙、血清碱性磷酸酶、骨密度及破骨细胞抑制率的测定：采用自动生化分析仪分析大鼠血清钙、磷、碱性磷酸酶的含量。采用单光子骨密度仪测定股骨骨密度，精度为2%，单位为g/cm2。采用骨密度仪全身扫描测定全身骨密度，仪器精度为1%，单位为g/cm2。应用AG-2020KNA型万能材料试验机进行抗弯力测定。置标本于跨距为22 mm的支架上，以2 mm/min速度作3点弯曲试验，记录股骨断裂载荷，单位为牛顿(N)。
破骨细胞抑制率的测定：细胞培养3 d取出骨片超声去除细胞后，经体积分数1%甲苯胺蓝染色，是以新生24 h内的SD大鼠分离的破骨细胞为对照组，未加任何药物干预。光学显微镜下作吸收陷窝计数。
主要观察指标：大鼠体质量，大鼠血清中钙、磷、碱性磷酸酶水平，股骨骨密度、抗弯力及全身骨密度，破骨细胞吸收陷窝数。
统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 11.5统计学软件进行数据处理，组间均数差异的比较采用独立样本t 检验和单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

3.1 三种中药对去卵巢大鼠体质量的影响体质量是妇女绝经后的一个极为重要的指标，妇女绝经后卵巢功能迅速衰退，雌激素分泌水平下降，导致垂体功能亢进、自主神经功能紊乱，食欲亢进致使体质量增加。实验采用去卵巢大鼠模型模拟妇女绝经后的病理情况[28]，去卵巢后大鼠体质量较假手术组显著增加，此结果与妇女绝经病理机制相吻合[29]。3种自拟中药组方中，龟鹿胶组具有显著抑制去卵巢大鼠体质量增加的效果。这可能与龟鹿胶中的主成分鹿角、龟板能够激活脂蛋白脂酶活性，导致脂肪组织减少有关。
3.2 三种中药对去卵巢大鼠血清中钙、磷、碱性磷酸酶及骨密度的影响血钙、磷、碱性磷酸酶是反映骨形成活性的重要指标。血钙主要以3种形式存在，即离子钙、蛋白结合钙和与小分子阴离子结合钙。蛋白结合钙与小分子阴离子结合钙均无生理活性，分别占血清总钙的4%和13%。高离子钙具有生理活性，约占血清总钙的47%。血清总钙的测定对骨矿代谢和钙磷代谢的研究具有重要价值[30]，绝经后妇女随年龄增加血钙减少显著[31]。实验结果表明模型组血钙显著低于假手术组；中药治疗组血钙均显著高于模型组，其中淫羊藿组血钙比模型组增加13.6%，龟鹿胶组增加12.7%，红景天组增加10.8%。说明3种中药均有避免骨质疏松大鼠血钙丢失的作用，淫羊藿组的作用较其他2种相比作用更为明显。磷是人体中的主要元素，约占人体质量的1%，主要以羟基磷灰石的形式存在于骨和牙齿中，少部分以有机磷的形式存在于软组织和体液中。磷具有多种生理功能，在细胞膜内以磷脂形式存在的磷酸盐为主要成分，参与能量复制、基因复制等，发挥许多细胞的功能。体内的磷大部分存在于骨矿物质中。磷在骨矿物质中的作用之一是维持机械强度，另一作用是以无机磷的形式存在于骨中维持细胞内磷的稳定保证生命过程的完成。随着绝经后雌激素的降低，绝经后女性的血磷随着年龄的增加而增高。
实验结果显示，假手术组血磷显著低于模型组，与模型组相比，淫羊藿组血磷降低了28.05%，龟鹿胶组降低26.70%，红景天组降低24.43%。3种中药组方治疗后对血磷的降低均有较显著的作用。碱性磷酸酶是参与骨代谢的重要蛋白质，是成骨细胞分化的特异性标志之一，骨形成时成骨细胞可分泌大量的碱性磷酸酶参与骨的矿化，骨形成与碱性磷酸酶的活性具有高度相关性，碱性磷酸酶活性可以反映成骨细胞的活跃状况。实验结果中，模型组碱性磷酸酶显著高于假手术组和中药治疗组，其中龟鹿胶组碱性磷酸酶略低于其他2组。龟鹿胶组方剂中鹿角、龟板可刺激破骨细胞形成和促进骨吸收，抑制成骨细胞碱性磷酸酶生成并减少细胞内钙含量，抑制骨形成和钙化。本次实验骨密度测量结果表明，淫羊藿组与龟鹿胶组治疗后骨密度接近假手术组；抗弯力有改善的趋势但无统计学意义。3组中药治疗大鼠骨质疏松具有一定疗效。
3.3 三种中药对去卵巢大鼠破骨细胞抑制作用的影响破骨细胞在骨转换中不断分化成熟，通过对骨组织吸收作用清除旧骨，与成骨细胞一起完成骨重建。骨吸收作用的强弱与破骨细胞的数量、吸收能力等密切相关。破骨细胞骨吸收功能抑制是防治骨质疏松症的主要途径之一[32]。
吸收陷窝计数是用于评价药物对破骨细胞抑制作用的药效学指标之一。由于吸收陷窝的加深、加宽，造成骨小梁变细、穿孔等微结构的破坏，同时，当旧骨的清除量大于新骨的形成时，造成骨密度下降。
实验结果显示，3种中药组方对破骨细胞吸收功能均具有抑制作用，其抑制作用顺序为红景天组>淫羊藿组>龟鹿胶组。红景天组对破骨细胞吸收功能具有抑制作用，抑制率为86.85%。3种自拟组方对去卵巢骨质疏松均具有显著疗效，龟鹿胶组和淫羊藿组主要以增加骨密度为主，红景天组具体表现在对破骨细胞吸收功能具有抑制作用。
3.4 中药作用机制探讨骨质疏松症是以骨量减少、骨微观结构退化为特征的致使骨的脆性增加易于发生骨折的全身性骨骼疾病，中医称之为“骨瘘”、“骨枯”或“骨痹”。人的骨骼生长发育依赖于肾精，中医认为肾为先天之本，主骨生髓，骨质疏松症主要病因为肾虚，其次是脾虚、肝郁；肾中精气不足，肾阳虚而生寒，脾肾亏虚、气虚则血液运行不畅致血瘀，血瘀日久渐进，凝滞瘀结不散，发展为瘀血，瘀血的形成反过来加重脾肾亏虚，进而产生全身骨关节疼痛，因而血瘀也是绝经后骨质疏松症的主要发病机制。实验所用方剂以此为指导原则。
骨质疏松症验方中以补肾健脾药为主。自拟组方中淫羊藿、鹿角胶温肾壮阳、温通经脉、散寒止痛；有“益精气、坚筋骨、补腰膝、强心力”等作用。淫羊藿味辛、甘、性温，归肝、肾经，《本草备要》曰：“补命门，益经气，坚精骨，功能补肾壮阳，去风除湿”；牡蛎平肝潜阳、止汗涩精；方中以淫羊藿和牡蛎为君药，二者均补肾阳，强筋骨，祛风湿。现代药理研究发现，淫羊藿含有黄酮类物质，其结构与己烯雌酚相似而具有雌性激素样作用。淫羊藿能促进骨髓细胞DNA合成，对去卵巢成骨细胞代谢调控的影响，主要通过增加破骨细胞抑制因子mRNA的表达来抑制破骨细胞的分化和成熟，因而对破骨细胞具有直接的抑制作用，从而达到其抑制骨吸收、治疗骨质疏松症的目的。此方剂不是单一地应用补肾、健脾、养肝疗法，而是融入血瘀与瘀血的理论，加强活血化瘀类药物联合的应用，在方剂中加入了活血化瘀类药物丹参，起到活血祛瘀止痛之功效。诸药合用，共奏补肾壮骨、健脾和胃、活血祛瘀之功效，以达到治疗骨质疏松症的作用[33-35]。
《本草纲目》记载，李时珍曰：龟鹿皆灵而有寿，龟首常藏于腹，能通任脉故取其甲，以补肾、补血，皆以养阴也。鹿鼻常返向尾，能通督脉故取其角，以补精、补气，皆以养阳也。方中以鹿角通督脉而补阳，龟板通任脉而补阴。阳生于阴，阴生于阳，阴阳并补，此精之所由生也。故龟鹿两味并进，二者为异类血肉有情之品，能峻补阴阳以生气血精髓；人参大补元气，枸杞滋补肾阴。诸药合用，益气生精，可达精生而气旺。为阴阳气血交补之剂，共具填补精髓，补肾健脾，达到治疗骨质疏松的目的[36-37]。
红景天组方主要组成为红景天、黄芪与山萸肉等。方中红景天《神农本草经》中列为上品，《本草纲目》中记载可轻身明目。其主要成分红景天甙含多种人体必须的氨基酸和维生素，对核酸、激素及细胞膜起着平衡调节和激活的作用，可提高机体的免疫力；实验研究表明红景天苷能有效上调小鼠颅骨细胞MC3T3-E1中骨形态发生蛋白2的表达效应，该化合物可能具有一定的促骨形成能力。红景天对治疗中医的虚证疗效显著，具有健脾益肾、益气生血功能。
黄芪味甘性温，健脾补气，助“后天之本”的运化，《医学衷中参西录》中有“黄芪之性，又善治肢体萎废”，《神农本草经》中谓其“主腰有痛，补中益经气，坚筋骨”；山萸肉酸、涩，微温，补肝肾、益经气，通血脉、壮骨髓，为平补肝肾之佳品。诸药合用，益气健脾、滋肝肾、强筋骨，温而不燥，补而不滞。实验中红景天在对破骨细胞吸收功能的抑制作用，红景天方剂治疗骨质疏松症可能通过对机体骨代谢多环节、多层次的进行调节，在分子作用机制方面还有待进一步考证[38-39]。
中医药是祖国医学的宝贵资源，在治疗骨质疏松方面具有独特的优势，然而目前关于中药治疗骨质疏松症的机制研究还存在许多不足。中药具有辨证施治和综合治疗的作用特点，它能够迅速有效地改善骨质疏松患者的临床症状。但正由于中药复方综合整治的特点，使得其作用机制和靶向研究存在高度的复杂性，针对骨代谢的细胞水平和分子生物水平的研究也处于瓶颈，这需要更多的科研人员致力于中药治疗骨质疏松的开发和应用中去。需要将中医的理论指导与机制研究精密结合起来，相关的研究工作尚待进一步深入，更多的有潜力有价值的中药等待深入研究证实。

龟鹿胶、淫羊藿及红景天对骨质疏松大鼠骨密度及破骨细胞的影响

Turtle deer glue, epimedium, and rhodiola pills enhance bone mineral density of ovariectomized rats

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