目前对于体外培养骨髓间充质干细胞、软骨细胞用于骨与软骨缺损的研究中，体外细胞培养常规使用胎牛血清，但其具有引起动物源性病毒感染及异种蛋白变态反应的可能性
[3]，对于其培养的细胞和组织应用于临床还存在很大争议。富血小板血浆源于自体血液提取部分，因其能提供多种生长因子，且各因子比例适合，可与胎牛血清担当同样的角色。
富血小板血浆通常采用离心的方式获取，不同离心力、离心时间所制备的富血小板血浆中血小板浓度存在明显统计学差异。Petrungaro法、Landesberg法、Aghaloo法分别代表3种不同的富血小板血浆制备方式。Petrungaro法为首次高速离心，而后中低速离心。Landesberg法两次均为低速离心。Aghaloo法则为首次低速离心而后高速离心。本实验证实Landesberg法、Aghaloo法所制备的富血小板血浆符合目前公认的富血小板血浆中血小板浓度>1 000×10
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-1[4]。而Petrungaro法所制备的富血小板血浆显然没有符合这一要求，反而低于正常全血中的血小板浓度。图1-4显示了正常血浆及3种方法制备的富血小板血浆中血小板含量(来取自于同一只实验动物)。
分析其原因是由于Petrungaro法首次较大离心力可同时造成红细胞、血小板的沉降，因此在白膜层下的红细胞中夹杂着大量的血小板。正是这样使得首次离心后上层血浆中只含有很少的血小板。在实验过程中对Petrungaro法首次离心后对白膜层及白膜层下部3 mm体积的红细胞层进行了收集，血小板计数发现血小板浓度为(1 370.16±204.76)×10
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-1，见图5，这一结果也证实先前的猜想。
由于Landesberg法、Aghaloo法首次离心力小，使沉降速率大的红细胞首先沉降于管底，而对血小板的影响相对较小，故大部分血小板仍位于上清血浆中，Landesberg法第2次离心力仍为200×g，此离心力不能使上层血浆中全部的血小板沉降于管底，所以血小板回收率低于Aghaloo法。而Aghaloo法第2次离心使保留在上层血浆中了大部分的血小板降于管底，因此使其回收率最高。
实验选用血小板源性生长因子、转化生因子β1进行测定从而评价富血小板血浆活性。研究证实富血小板血浆释放的血小板源性生长因子、转化生因子β1是促进骨髓间充质干细胞增殖和诱导其分化的重要因子
[3]，Mishra等[5]研究证明转化生因子β1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的作用，刺激蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达、促进细胞增殖，并且抑制向脂肪细胞方向分化。Ng等
[6]发现人骨髓间充质干细胞增殖及向软骨方向分化过程中血小板源性生长因子、转化生因子β1信号通路发挥着重要的作用。抑制血小板源性生长因子信号通路后骨髓间充质干细胞仅能分化成少量的功能不全的成骨细胞，抑制转化生因子β1信号通路后细胞完全不能向软骨细胞方向分化。Brandl等
[7]单独使用血小板源性生长因子、转化生因子β1培养的人软骨细胞与对照组相比有明显的促有丝分裂作用，且证明血小板源性生长因子、转化生因子β1不影响细胞染色体端粒的生物学特征，对细胞没有促无限增殖作用，为血小板源性生长因子、转化生因子β1细胞培养的细胞应用临床于提供了安全性依据。
Sun等
[8]制备的兔富血小板血浆血小板浓度与本实验中Landesberg法制备的富血小板血浆浓度相近，其测定富血小板血浆中转化生因子β1水平与实验结果相似。实验对正常血浆、贫血小板血浆、未活化富血小板血浆也进行了转化生因子β1水平测定，比较发现没有显著统计学差异，提示<1 500×g的离心力不会使血浆中转化生因子β1多肽分子发生聚集沉降，也不会引起血小板活化。实验结果同时显示了Petrungaro法制备的富血小板血浆活化后与未活化富血小板血浆相比转化生因子β1水平无差异，可能是由于Petrungaro法制备的富血小板血浆中血小板数量少的原因。需要指出的是富血小板血浆在使用激活剂活化后，物理特性发生明显改变，可迅速凝集成富血小板凝胶，见图6，因此在富血小板血浆活化后不太可能使用注射器进行局部或关节内注射。
预实验过程中对活化后1 h的富血小板凝胶离心后行ELISA测定发现，血小板源性生长因子、转化生因子β1水平与正常血桨比较无明显差异，且所得萃取液的量很少。而在室温静置24 h后测定血小板源性生长因子、转化生因子β1水平有明显增高，离心后萃取液的量也较之前多，见图7，提示活化后血小板对活性因子的释放需要一定时间。
Duan等
[9]应用富血小板血浆及洗涤后的富血小板血浆对大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养，比较发现富血小板血浆及洗涤后的富血小板血浆在早期对细胞增殖作用无统计学差异，培养后期洗涤后富血小板血浆促增殖作用明显，且两种培养方式对细胞分化方向也产生不同影响。说明血液中的白细胞和其他细胞成分对血小板活化后因子的释放过程有影响。因此本实验与常见制备富血小板血浆方法相比丢弃了白膜层及其附近红细胞层中的血小板
[2,10-11]，减少富血小板血浆中白细胞及其他细胞因素对血小板活性的影响。富血小板血浆可由不同的离心力造成血小板数量的不同，因此一味的增加富血小板血浆中血小板数量，可使其中生长因子浓度富集。Weibrich等
[12]报道人的有效富血小板血浆血小板浓度应界于(503-1 729)×10
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-1之间，浓度>1 800×10
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-1将对组织再生产生抑制作用，因此适合浓度富血小板血浆才促进种子细胞的增殖和分化。
实验证实Landesberg法和Aghaloo法均可制备有效浓度的富血小板血浆，Aghaloo法制备血小板浓度及活性高于Landesberg法，且存在统计学差异。活性因子含量与血小板数量呈正相关性。细胞增殖、分化是一个多因子调控的复杂过程，富血小板血浆中除血小板源性生长因子、转化生因子β1外还含有大量其他种类生长因子，因此富血小板血浆是否具有稳定的作用，还需要长期实验研究和临床疗效观察。但因富血小板血浆的天然优势，在组织工程领域将有广阔的应用前景。
致谢：对于本文提供帮助的天津市第一中心医院卫生部危重病重点实验室的各位老师表示感谢，感谢天津医科大学总医院王景华教授在统计学分析方法方面给予的指导意见。
基金资助：天津市卫生局科技基金重点攻关课题(KG109)。
作者贡献：实验设计、实施为第一作者，实验评估、审校为通讯作者，第一作者对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物处置方法符合中华人民共和国科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。
