骨髓间充质干细胞移植治疗矽肺小鼠肺炎及肺纤维化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.017

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (6): 1049-1055.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.017

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骨髓间充质干细胞移植治疗矽肺小鼠肺炎及肺纤维化

潘雍，杨昆，刘永哲

天津医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，天津市 300070

收稿日期:2012-07-05 修回日期:2012-07-23 出版日期:2013-02-05 发布日期:2013-02-05
通讯作者: 杨昆，副教授，硕士生导师，天津医科大学公共卫生学院，天津市 300070 yangkun@tijmu.edu.cn
作者简介:潘雍★，女，1984年生，内蒙古自治区人，汉族，天津医科大学在读硕士，主要从事骨髓间充质干细胞和矽肺纤维化治疗方面的研究。 panyong49@sina.cn

Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells for treatment of pneumonitis and pulmonary fibrosis in silicosis mice

Pan Yong, Yang Kun, Liu Yong-zhe

Department of Toxicology, School of Public Health, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China

Received:2012-07-05 Revised:2012-07-23 Online:2013-02-05 Published:2013-02-05
Contact: Yang Kun, M.D., Associate professor, Master’s supervisor, Department of Toxicology, School of Public Health, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China yangkun@tijmu.edu.cn
About author:Pan Yong★, Studying for master’s degree, Department of Toxicology, School of Public Health, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China panyong49@sina.cn

摘要/Abstract

摘要：

背景：矽肺对职业人群健康的影响日益严峻，目前没有有效治疗的方法。
目的：观察骨髓间充质干细胞移植对矽肺的治疗作用。
方法：36只C57BL/6小鼠随机摸球法均分为3组。对照组小鼠气管内注入生理盐水；矽肺模型组和骨髓间充质干细胞移植组小鼠气管内注入二氧化硅混悬液建立矽肺模型；骨髓间充质干细胞移植组于造模后6 h尾静脉输注骨髓间充质干细胞。
结果与结论：肺组织羟脯氨酸的含量矽肺模型组和骨髓间充质干细胞移植组高于对照组，差异均有显著性意义(P < 0.01)；骨髓间充质干细胞移植组含量明显低于矽肺模型组，差异有显著性意义(P < 0.01)。矽肺模型组和骨髓间充质干细胞移植组小鼠的肺系数均高于对照组(P < 0.01)，其中骨髓间充质干细胞移植组低于矽肺模型组，差异有显著性意义(P < 0.01)。白细胞介素1β的表达矽肺模型组和骨髓间充质干细胞移植组高于对照组 (P < 0.01)；骨髓间充质干细胞移植组低于矽肺模型组，差异均有显著性意义(P < 0.01)。转化生长因子β1在肺组织中的表达同样为矽肺模型组(P < 0.01)和骨髓间充质干细胞移植组(P < 0.05)高于对照组；骨髓间充质干细胞移植组低于矽肺模型组，差异有显著性意义(P < 0.01)。说明骨髓间充质干细胞移植可以减轻肺部炎症反应和纤维化程度。

关键词: 干细胞移植, 骨髓间充质干细胞, 移植, 矽肺, 肺炎, 肺纤维化\小鼠, 绿色荧光蛋白, 二氧化硅, 白细胞介素, 转化生长因子, 羟脯氨酸, 其他基金\干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Silicosis is a serious disease that harms human’s health. So far, there has been no effective treatment strategy.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on silicosis.
METHODS: Thirty-six C57BL/6 mice were randomly divided into three groups. In the control group, mice received intrateacheal injection of physiological saline. Mice from the silicosis model group and bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group received intrateacheal injection of silica crystals (SiO2) to establish silicosis mouse models. In the bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group, bone marrow mesenchymal stem cells were transfused into the tail vein at 6 hours after silicosis induction.
RESULTS AND CONCLUSION: Hydroxyproline content in lung parenchyma in the silicosis model group and bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group were significantly higher compared to the control group (P < 0.01). The hydrocyproline content in the bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group was significantly higher than that in the silicosis model group (P < 0.01). The lung index in the silicosis model group and bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group was significantly higher than that in the control group (P < 0.01), but the lung index was significantly lower in the bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group than in the silicosis model group (P < 0.01). Interleukin-1β expression in the lung tissue was significantly higher in the silicosis model group and bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group than that in the control group (P < 0.01), and interleukin-1β expression in the bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group was significantly lower than that in the silicosis model group (P < 0.01). Transforming growth factor β1 expression in the lung tissue was significantly higher in the silicosis model group (P < 0.01) and bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group (P < 0.05) than that in the control group, and transforming growth factor β1 expression was significantly lower in the bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group was significantly lower than that in the silicosis model group (P < 0.01). These findings suggest that bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can alleviate pulmonary inflammatory reaction and pulmonary fibrosis.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, bone marrow mesenchymal stem cells, transplantation, silicosis, pneumonitis, pulmonary fibrosis, mouse, green fluorescent protein, silica crystals, interleukin, transforming growth factor, hydroxyproline, other grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

潘雍，杨昆，刘永哲. 骨髓间充质干细胞移植治疗矽肺小鼠肺炎及肺纤维化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(6): 1049-1055.

Pan Yong, Yang Kun, Liu Yong-zhe. Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells for treatment of pneumonitis and pulmonary fibrosis in silicosis mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(6): 1049-1055.

图/表（结果） 5

2.1 实验小鼠的一般情况 对照组小鼠术后苏醒快，存在短时间的活力下降，即不似术前一样喜爱攀爬、嬉闹，但不超过4 h即可恢复，进食良好；矽肺模型组及骨髓间充质干细胞移植组小鼠术后苏醒慢，不喜活动，进食少，可闻及小鼠喘息声，渡过第4天喘息声消失，骨髓间充质干细胞移植组小鼠皮毛较矽肺模型组光滑有光泽。实验过程中矽肺模型组小鼠死亡2只，骨髓间充质干细胞移植组小鼠死亡1只。14 d时各组小鼠肺系数的数据情况见表1。

以上数据表明：骨髓间充质干细胞移植组小鼠的肺系数明显低于矽肺模型组，说明尾静脉移植骨髓间充质干细胞可以降低肺脏器与体质量的比值，即可以改善肺脏器的实变，从而达到提高肺功能的目的。

2.2 小鼠肺组织形态学观察 对照组肺泡结构完整，清晰可见，小支气管腔壁纤毛较多，见图1A；矽肺模型组炎性细胞浸润、聚集，成纤维细胞增生，肺泡壁增厚，肺泡间隔增宽，肺泡结构破坏，小支气管腔壁纤毛脱落，炎性细胞取而代之，较大矽结节形成(箭头所示)，见图1B。骨髓间充质干细胞移植组与矽肺模型组相似，但是成纤维细胞增生、矽结节的大小以及病变累及的范围较矽肺模型组小，见图1C。

2.3 各组小鼠肺组织中羟脯氨酸的测定结果 细胞移植2周后，与对照组肺组织羟脯氨酸含量(0.401 6± 0.032 0) mg/L比较，矽肺模型组(0.749 1±0.068 6) mg/L、骨髓间充质干细胞移植组(0.586 3±0.033 0) mg/L均显著升高(F =72.899，P < 0.01)，骨髓间充质干细胞移植组升高幅度明显低于矽肺模型组(P < 0.01)。说明移植骨髓间充质干细胞可以减少肺组织中羟脯氨酸水平。

2.4 肺组织中白细胞介素1β及转化生长因子β1的表达 单因素方差分析各组间存在差异，有显著性意义，每两组间比较采用Bonferroni法，差异有显著性意义，见表2。mRNA 表达见图2及3，骨髓间充质干细胞移植可减少白细胞介素1β和转化生长因子β1的表达。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2010年8月至2011年3月在天津医科大学公共卫生学院中心实验室完成。
材料：
实验动物：健康雄性C57B/L小鼠36只，6-8周龄，体质量20-25 g，均为SPF级，购自中国军事科学院，许可证号：SCXK-(军)2007-004。实验过程中对动物处置参照国家科学技术部2006发布的《关于善待动物的指导性意见》的相关要求^[6]。
携带绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞为天津医科大学公共卫生学院中心实验室于敏老师惠赠。
骨髓间充质干细胞移植修复矽肺小鼠肺组织的主要试剂、仪器：
Main experimental reagents and instruments:

实验方法：
动物模型的建立及分组：恒温清洁环境，光照12 h，湿度50%，自由饮水进食，每3 d更换垫料，饲养1周后随机摸球法分为3组，每组12只：①对照组：一次性气管内注入50 μL生理盐水。②矽肺模型组：一次性气管内注入二氧化硅悬液50 μL(10⁵mg/L)建立矽肺模型，即每只造模剂量为10 mg。③骨髓间充质干细胞移植组：建立矽肺模型，6 h后每只小鼠单次尾静脉输注骨髓间充质干细胞2×10⁶个。矽肺模型的建立和细胞移植剂量的选取根据为参考文献[7-9]以及预实验。采用气管内注射的方法造模，简单步骤如下：①小鼠腹腔注射5%水合氯醛溶液，0.006 mL/g，即0.6 mg/g，肌肉松弛后固定于板上。②颈部皮肤备皮，碘伏擦拭消毒。③颈部皮肤剪开约1 cm小口，组织镊分离肌肉及结缔组织暴露气管。④将混悬液缓慢注入气管，组织复位，缝合皮肤。各组小鼠在手术后第14天统一处理、取材，并进行各指标的检测。
二氧化硅颗粒配液前置于200 ℃烤箱干烤2 h以灭活内毒素。配后加青霉素1 000 U/mL防止肺部感染。
GFP-骨髓间充质干细胞培养、扩增：含体积分数10% FBS的L-DMEM完全培养液进行细胞培养，每隔两三天更换培养液1次；5 d左右细胞铺满瓶底约90%，0.25%胰酶消化两三分钟，800 r/min，离心半径12 cm，离心 5 min，按1∶2比例传代，接种于75 cm²培养瓶中，于37 ℃，体积分数5%CO2恒温培养箱中扩增培养，四五天传代1次。
肺系数的测定：细胞移植后14 d，称量并记录小鼠体质量及全肺湿质量计算肺系数。肺组织称质量前，生理盐水冲洗3次，吸干表面水分；肺系数=肺湿质量(mg)/体质量(g)。
肺组织的形态学观察：取小鼠右肺中叶经固定、浸蜡，包埋等过程，5 μm连续切片，苏木精-伊红染色观察肺组织的形态学变化。
肺组织中羟脯氨酸的表达情况：实验采用物理化学方法得到干燥的肺脏^[10]，按比例参照试剂盒说明书采用碱水解法，分光光度计560 nm波长比色，记录吸光度值，根据试剂盒所给公式计算待测标本的羟脯氨酸含量，结果以mg/g表示。
反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)测定肺组织中白细胞介素1β和转化生长因子β1 mRNA的表达：取上述速冻处理的肺组织，快速匀浆后按Trizol说明书进行操作，进行总RNA的提取。将提取的总RNA逆转为cDNA，具体操作按说明书进行。根据Gen-Bank公布的小鼠β-actin的cDNA序列，以及C57BL/6小鼠白细胞介素1β和转化生长因子β1 的cDNA序列，设计上游引物和下游引物，按适宜的反应体系和扩增条件进行扩增。以上引物由北京奥科生物工程公司合成。
引物：

上述反转得到的cDNA为模板，按如下反应体系进行PCR扩增：10×PCR缓冲液(含MgCl₂)2 μL，4×dNTP 1.3 μL，primer 11 μL(5 μm)，primer 2 1 μL (5 μm)，Template 1 μL，Taq酶0.4 μL，ddH2O补足至20 μL。
反应条件：小鼠β-actin：94 ℃预变性5 min；进入循环：94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环后再72 ℃ 10 min延伸。小鼠白细胞介素1β：94 ℃预变性5 min；进入循环：94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 s，72 ℃ 40 s，25个循环后再72 ℃ 2 min延伸。
反应结束后，1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，化学发光凝胶成像系统拍照，应用定量软件(Quantity One version 4.5)进行吸光度值扫描并作相对量分析，数值以目的条带电泳吸光度值与β-actin电泳条带吸光度值的比值表示。
主要观察指标：组织切片观察肺组织的形态学变化；各组小鼠肺组织中羟脯氨酸含量的变化；RT-PCR法检测肺组织中子白细胞介素1β和转化生长因子β1 mRNA的表达。
统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学分析，实验数据以x(_)±s表示，组间差异性比较用单因素方差分析，若有显著性意义，样本均数间的多重比较采用Bonferroni法分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞是来源于骨髓具有多向分化潜能的成体干细胞^[11-12]，在组织修复及基因治疗上有广阔的应用前景。Okamoto等^[13-14]的研究表明，当机体组织受损，外源性的骨髓间充质干细胞通过受体和配体表达的一些化学物质，可以迁移到受损伤的部位，这种能迁移能力是骨髓间充质干细胞修复损伤组织的前提。

矽肺的发病机制复杂，目前尚未完全阐明。矽肺的病理过程早期为炎症阶段，表现为：炎性细胞浸润，炎症反应和组织修复，后期为纤维化阶段，表现为：胶原蛋白沉积和矽结节的形成。由于矽肺的发病机制没有阐明，目前没有有效的治疗策略。关于移植干细胞减缓炎症、对抗纤维化的机制还没有定论。一种假说认为干细胞可替代Ⅱ型肺泡上皮细胞，发挥促进受损肺泡细胞增殖、再生和修复功能；另一种认为干细胞改变受损部位微环境。Burt等^[15]的报道称：干细胞在肺内可能通过与体细胞接触而发生融合现象，表现出相应的类上皮样组织形态学特征和功能，实现修复损伤肺组织的目的。为研究骨髓间充质干细胞减轻肺部炎症反应和纤维化的可能机制，本实验检测了白细胞介素1β和转化生长因子β1在肺组织的表达情况。

白细胞介素1β是前炎症调节因子，参与调节炎症反应和纤维化进程，在矽肺的发生前期即炎症反应阶段起关键作用。实验结果显示：对照组小鼠肺组织中白细胞介素1β的表达低于矽肺模型组，差异有显著性意义，说明矽肺模型组小鼠肺组织对外来异物即二氧化硅颗粒存在较强的吞噬排斥作用，引起肺部较强的炎症反应，而对照组小鼠肺部注入的是生理盐水，不含有对肺部有刺激作用的外来异物颗粒，所以白细胞介素1β的表达较低；同时，骨髓间充质干细胞移植组小鼠肺组织中白细胞介素1β的表达低于矽肺模型组，差异有显著性意义，说明尾静脉移植骨髓间充质干细胞可降低白细胞介素1β的表达，减弱肺部炎症反应和纤维化进程；该实验结果与以下研究者的研究结论相同。Srivastava等^[16]研究移植骨髓间充质干细胞对小鼠矽肺模型所致肺损伤的治疗作用时发现：移植骨髓间充质干细胞可降低白细胞介素1β在肺组织中的表达，减轻肺部损伤。 Ramsgaard等^[17]的研究结果与此一致，同时Lassance等^[18]的研究也证实移植骨髓间充质干细胞可降低白细胞介素1β的表达并有效改善肺通气功能。此外，Rojas等^[19]的研究表明：在博来霉素所致的肺损伤模型中，肺组织白细胞介素1β的表达增高，移植骨髓间充质干细胞后，白细胞介素1β的表达与对照组相近，可能由于细胞移植后降低了白细胞介素1β的表达，从而缩短炎症部位的反应时间并同时降低了反应的强度，为组织修复提供良好的微环境而发挥作用。这一假设与干细胞可改变损伤部位微环境的假说相吻合。

而且，Hoffman等^[4]曾在其文中提出：应用白细胞介素1β的抑制剂进行靶向性治疗可以抑制由白细胞介素1β介导的各种疾病的炎症反应。基于以上实验结果，白细胞介素1β的抑制剂同样可以应用于矽肺早期炎症阶段的治疗，具体疗效有待于进一步观察研究。可见，移植骨髓间充质干细胞可减轻炎症反应造成的损伤，可能通过下调白细胞介素1β的表达实现。

转化生长因子β1是正常损伤修复及病理性异常修复的主要调节因子。它的表达变化存在于整个矽肺发生发展过程中。实验结果显示：对照组和骨髓间充质干细胞移植组小鼠肺组织中转化生长因子β1的表达低于矽肺模型组，可能原因同白细胞介素1β在肺组织的表达。在小鼠矽肺和博来霉素模型中，移植骨髓间充质干细胞均可降低转化生长因子β1的表达^[10,19-20]。在矽肺早期炎症阶段转化生长因子β1主要诱导炎症因子的表达，协同加重炎症应答反应；在后期纤维化阶段对胶原蛋白的影响更为显著，激活并促进成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的合成，同时抑制胶原蛋白的降解，造成细胞外基质蛋白大量堆积在肺泡间隔和矽结节内，导致纤维化^[15]，影响肺通气功能。

羟脯氨酸是机体胶原蛋白中主要并相对恒定的氨基酸，因此羟脯氨酸的含量可以表示胶原的代谢情况，从而判断组织纤维化程度。实验结果显示：骨髓间充质干细胞移植组小鼠肺组织羟脯氨酸的含量低于矽肺模型组，移植骨髓间充质干细胞后降低了羟脯氨酸的含量，与Rojas等^[5,19,21]的研究结果一致，说明移植骨髓间充质干细胞可以减慢肺纤维化的程度，可能通过下调转化生长因子β1的表达实现。存在炎症和致纤维化刺激的肺脏，相同质量的情况下，其内部各成分的含量(如水肿可能使肺脏水含量的比重增加)可能存在较大差别，造成羟脯氨酸检测结果不准确。因此，实验通过物理化学方法得到干燥肺脏，去除影响检测的不相关因素，实验结果比较准确、可靠。

国内外研究报道中，建立小鼠矽肺模型使用二氧化硅颗粒的剂量存在很大差别^[4-6,14-15]，从2.5-20 mg不等，模型形成时间也不尽相同。小剂量造模时间长，可以很好观察各时间点肺组织形态及功能的变化，但实验周期较长；大剂量造模时间短，但对肺脏的刺激较强，加重肺组织的损伤程度，不能很好的模拟矽肺的病理过程。鉴于以上原因，本实验选取对二氧化硅敏感的C57B/L小鼠，造模剂量根据预实验选用10 mg，相比文献中的 5 mg和20 mg，分别有效缩短了造模成型时间并降低了动物死亡率，细胞移植的数量文献中大都采用2×106或107两个数量级，且在106数量级已能达到预期效果，所以本实验沿用2×106的移植剂量。经肺组织切片苏木精-伊红染色观察，在成功建立矽肺模型的基础上，缩短了实验周期，可为其他研究者提供参考。该造模剂量可能为骨髓间充质干细胞移植组肺组织中白细胞介素1β和转化生长因子β1 的表达高于对照组的原因，即造模剂量较大造成肺部损伤较重，细胞移植可在一定程度上改善肺损伤，而不能痊愈如初。

实验采用携带绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞进行移植，理论上，若骨髓间充质干细胞能够通过血液循环到达肺部并定居在损伤组织处发挥作用，则骨髓间充质干细胞移植组小鼠的肺组织切片在荧光显微镜下可观察到发绿色荧光的骨髓间充质干细胞，但本实验未观察到绿色荧光，可能原因为肺组织切片的处理不当，即在制作及存放过程中存在问题，实验中肺组织固定的时间过长很可能是未观察到荧光的主要原因。另一可能原因为观察时间点不恰当，细胞内的绿色荧光蛋白可能随着细胞的分裂传代而逐渐减弱，移植后经过一系列微环境的变化及适应，至本实验观察点第14天时很可能观察不到荧光。

综上认为，在小鼠矽肺模型早期，尾静脉移植外源性骨髓间充质干细胞对损伤的肺组织具有修复作用，可能通过下调肺组织中免疫相关因子的表达即旁观者效应而发挥作用，即可以减轻肺部炎症，减慢肺纤维化进程。相信随着科学研究的不断深入，骨髓间充质干细胞应用治疗矽肺的研究将更加全面，届时将为矽肺的治疗提供新的方法和途径。

致谢：感谢天津医科大学公共卫生学院中心实验室提供的技术支持。
基金资助：天津医科大学校局级基金(2011KY40)：尾静脉回输骨髓间充质干细胞对小鼠矽肺纤维化的抑制作用及其机制的研究。
作者贡献：实验设计为第二作者，实验实施为第一作者，实验评估为第一、二、三作者，资料收集为第一作者。第一作者成文，第二作者审校，第二作者对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

骨髓间充质干细胞移植治疗矽肺小鼠肺炎及肺纤维化

Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells for treatment of pneumonitis and pulmonary fibrosis in silicosis mice

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