原花青素干预大负荷运动大鼠腓肠肌相关凋亡蛋白的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.022

摘要/Abstract

摘要：

背景：大负荷运动后给机体带来的损伤与运动后延迟性肌肉酸痛及运动疲劳有相关性。
目的：观察原花青素对大负荷运动后大鼠腓肠肌自由基代谢和细胞凋亡相关蛋白FAS、肿瘤坏死因子表达的影响。
方法：48只成年雌性SD大鼠随机均分为2组。给药组每日灌服10 g/L原花青素水溶液，安慰剂组灌服等量蒸馏水，再将2组大鼠随机分为安静组、运动后即刻及运动后24 h 3个亚组。2周后，除两安静组外其余各组进行一次坡度为-10°、20 m/min大负荷跑台运动。于运动前(安静时)、运动后即刻和运动后24 h断颈处死大鼠。取左后肢腓肠肌进行指标检测。
结果与结论：①运动后即刻两组超氧化物歧化酶活性有下降的趋势，其中给药组活性比安慰剂组下降的幅度小。运动后即刻两组丙二醛含量显著升高，其中安慰剂组升高的幅度高于给药组。运动后各时相给药组超氧化物歧化酶/丙二醛比值降低，幅度要明显小于安慰剂组。②运动后两组腓肠肌细胞FAS蛋白表达显著升高，安慰剂组FAS蛋白表达明显高于给药组。③运动后各时相安慰剂组肿瘤坏死因子表达明显高于给药组。表明原花青素对大鼠一次性大负荷运动后腓肠肌微损伤及凋亡在一定程度上有缓解和抑制作用。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, 大负荷运动, 原花青素, 腓肠肌, 细胞凋亡, 自由基, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: It will bring a variety of negative effects to the body after heavy load training, which is related to delayed onset muscle soreness and exercise fatigue.
OBJECTIVE: To observe the effect of procyanidins on metabolism of free radicals, apoptosis-related protein FAS, and tumor necrosis factor in the gastrocnemius after heavy load training in rats.
METHODS: Totally 48 adult female Sprague-Dawley rats were randomly divided into placebo group and medication group, and each group was divided into three subgroups, including static control group, instantly post-exercise group and 24-hour post-exercise group. Rats of the medication group were fed with 10 g/L procyanidins by intragastric administration, and those in the placebo group were given equal volume of distilled water as placebo. After 2 weeks, in all groups expect two static control groups, a heavy load running with a slope of -10° at 20 m/min was performed. Rats were decapitated before exercise, instantly and 24 hours after exercise, respectively, and then gastrocnemius from the left hind limb was taken off for detection.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The gastrocnemius superoxide dismutase activity had a decrease tendency in the two instantly post-exercise groups, and the decline in superoxide dismutase activity was slighter in the medication group than the placebo group. The content of malondialdehyde increased significantly in the two instantly post-exercise groups, but the increase was smaller in the medication group than the placebo group. The ratio of superoxide dismutase and malondialdehyde decreased significantly after exercise, but compared with the placebo group, the decrease of the medication group was lower at every phase after exercise. (2) The expression of FAS protein in both groups increased significantly after exercise, and the increase of the placebo group was higher than the medication group. (3) The expression of tumor necrosis factor α was higher in the placebo group than the medication group at different phase after exercise. These findings indicate that to a certain extent, procyanidins could relieve the injury of gastrocnemius and restrain cell apoptosis after a heavy load exercise in rats.

Key words: tissue construction, cytological experiments of tissue construction, heavy load exercise, procyanidins, gastrocnemius, apoptosis, free radical, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠48只，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 用药前后大鼠腓肠肌超氧化物歧化酶活性，丙二醛浓度及二者比值变化的比较见表1。
由表1看出，运动前两组腓肠肌超氧化物歧化酶活性差异无显著性意义(P > 0.05)，安慰剂即刻组与用药组超氧化物歧化酶活性都有下降趋势，但这两组间差异无显著性意义(P > 0.05)，与安静对照两组相比差异也无显著性意义(P > 0.05)。大鼠运动24 h后安慰剂组与用药组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，但安慰剂24 h组超氧化物歧化酶活性非常明显低于安慰剂即刻组(P < 0.01)；用药24 h组也低于安慰剂24 h组(P < 0.01)。丙二醛浓度运动前安慰剂与用药两组差异无显著性意义(P > 0.05)，安慰剂即刻组与用药组的丙二醛浓度都显著性升高(P < 0.01)，运动24 h后，两组丙二醛浓度仍处于较高水平，其中用药24 h组丙二醛浓度较安慰剂24 h组少(P < 0.01)。而安慰剂即刻组和用药即刻组之间差异无显著性意义。超氧化物歧化酶/丙二醛比值安慰剂即刻组与用药即刻组较运动前对照两组明显降低，运动后24 h两组较即刻对照组都进一步降低(P < 0.01)，但其中用药24 h组增高的幅度比安慰剂24 h组高(P < 0.01)。

2.3 用药前后大鼠腓肠肌FAS蛋白及肿瘤坏死因子表达的比较用药前后大鼠腓肠肌FAS蛋白见表2，图1。

由表2及图1看出安静时安慰剂与用药两组腓肠肌细胞FAS蛋白表达差异均无显著性意义。运动后两组蛋白表达显著升高(P < 0.01)；其中安慰剂即刻组增高的幅度要比用药即刻组大，其结果差异有显著性意义 (P < 0.05)。运动后24 h后，安慰剂与用药两组FAS蛋白表达都进一步显著性增高(P < 0.01)，期中安慰剂24 h组FAS蛋白表达明显高于用药24 h组(P < 0.01)。

图1 FAS蛋白表达的免疫组织化学染色照片(×400)
Figure 1 Immunohistochemical staining of FAS expression (×400)

用药前后大鼠腓肠肌肿瘤坏死因子表达见表3，图2。

从表3及图2看出运动前安慰剂与用药两组大鼠腓肠肌肿瘤坏死因子的表达差异均无显著性意义 (P > 0.05)，运动后即刻安慰剂组和用药组肿瘤坏死因子都表达明显升高(P < 0.01)；其中安慰剂即刻组非常明显高于用药即刻组的肿瘤坏死因子表达 (P < 0.01)。而大鼠运动24 h后安慰剂和用药两组肿瘤坏死因子表达分别较运动后即刻两组都进一步增高(P < 0.01)，但安慰剂24 h组增高的幅度明显高于用药24 h组(P < 0.01)。

图2 各组大鼠肿瘤坏死因子表达的免疫组织化学染色照片(×400)
Figure 2 Immunohistochemical staining of tumor necrosis factor alpha expression (×400)

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：2010年9月至2011年3月动物饲养在成都体育学院运动人体科学与康复实验室(省级重点实验室)，实验指标检测在四川大学华西医学院生物治疗实验室(国家级重点实验室)。

材料：

实验动物：成年雌性SD大鼠48只，体质量180- 250 g，为四川大学华西医院选购，普通级，许可证号：SCXK川2009-9。室温控制在20-25 ℃，自由饮食,每笼4只，适应性喂养3 d。

药物：纯度为95%的原花青素购于天津市尖峰天然产物研究开发有限公司，配制成10 g/L的原花青素水溶液。

实验方法：

动物分组：将大鼠随机分为2组，安慰剂组和给药组。再将这两大组根据3个时相分别再随机分为3亚组，即安静安慰剂组、安慰剂即刻组、安慰剂24 h组与安静用药组、用药即刻组、用药24 h组。每小组各8只老鼠。

实验药物：给药组按体质量以150 mg/kg灌胃给药 10 g/L的原花青素水溶液。安慰剂组按其体质量灌胃 15 mL/kg的蒸馏水。

实验动物运动模型：实验周期为14 d，每日早晨起称体质量，根据体质量变化，计算给药量和安慰剂量，正式实验那天停止给药。在正式实验前，除了2个安静组大鼠外，其余各组大鼠进行2 d的运动跑台适应(速度为10 m/min，时间为10 min/d坡度为0°)后休息2 d，在最后1 d进行正式实验。正式实验时，跑台坡度为10°的下坡运动，除2个安静组以外，所有大鼠以20 m/min的速度运动至力竭。力竭标准为：到运动末期，动物未能坚持原跑速，先后滞留跑道后1/3处达3次以上，刺激驱赶无效，停跑后体征表现为呼吸急促，神情倦怠，腹卧位对刺激反应迟钝。

指标检测：①腓肠肌超氧化物歧化酶：采用黄嘌呤氧化酶法检测。②腓肠肌丙二醛：采用硫代巴比妥酸法法检测。③腓肠肌FAS蛋白、肿瘤坏死因子：采用免疫组织化学染色(苏木精-伊红染色方法。免疫组织化学中棕黄色颗粒和棕黄色面积代表蛋白的阳性表达。每张切片随机选取10个视野(不重复、不重叠)，采用低倍与高倍相结合的办法采用观察与拍照，低倍选准位置，高倍观察形态结构并拍照。用Image-Pro Plus图像分析系统测定每个视野中阳性表达的积分吸光度(IA)以检测蛋白表达。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，用SPSS 17.0进行统计分析，经双因素方差分析进行组间差异比较。当方差齐性时，用LSD post-hoc检验；当方差不齐时，用Tamhane post-hoc检验。

讨论

3.1 原花青素对运动后大鼠腓肠肌自由基代谢的影响大量研究表明一次性大强度运动后，体内会产生大量的活性氧^[5-6]，而活性氧的大量堆积会介导和引起组织细胞的多个损伤环节，如细胞膜脂质过氧化、ATP合成减少、以及Ca离子超载。

从实验结果看出，大鼠一次性大强度运动即刻后，给药组和安慰剂组腓肠肌丙二醛含量都显著增高，此结果与之前的研究报道相一致^[7-8]，说明一次性大负荷运动后活性氧的大量产生会导致细胞膜的脂质过氧化损伤。对于大强度运动后组织超氧化物歧化酶活性的变化研究报道并不一致^[9]，实验发现大鼠运动过后腓肠肌超氧化物歧化酶活性成下降趋势，但还是维持在较高水平，与运动前相比不具有显著性差异，造成这样结果的原因可能与运动量有关^[10]，过大的运动负荷会导致活性氧过量的产生和堆积从而限制了抗氧化酶的活性。而运动 24 h后，超氧化物歧化酶活性呈显著性下降(P < 0.01)，而丙二醛浓度进一步显著性增高，超氧化物歧化酶/丙二醛的比值也显著降低，这可能与运动后24 h腓肠肌由于缺血再灌注导致活性氧进一步增加有关^[11]。另外由实验结果看出，服用原花青素的大鼠在运动后即刻和24 h两个时相时丙二醛浓度都显著低于同时相的安慰剂对照组；然而用药组和安慰剂组超氧化物歧化酶活性在运动后即刻和24 h后没有明显差异，但用药两时相组活性略高于安慰剂组，造成这样结果可能是和给药剂量有关^[12]。但结合超氧化物歧化酶/丙二醛的比值来看，可以发现用药组两时相比值明显高于安慰剂两时相组。因此通过本实验可以说明在一次性大强度运动过后原花青素在一定程度上能减缓超氧化物歧化酶活性下降和减少丙二醛的生成从而达抗肌纤维活性氧损伤和维持细胞完整性的作用。

3.2 原花青素对运动后大鼠腓肠肌FAS蛋白及肿瘤坏死因子的影响 FAS蛋白是细胞凋亡的重要调控蛋白，它能和免疫细胞表面的FAS蛋白配体结合成FAS/FAS配体复合体共同诱导细胞的凋亡^[13]。肿瘤坏死因子是一种具有多种生物学效应的细胞因子，它是细胞凋亡的诱导信号^[14]，除此之外，肿瘤坏死因子还具有增强细胞对FAS配体的敏感性，参与FAS/FAS配体凋亡途径的调控^[15]。

实验通过IA值的比较运动即刻安慰剂和用药组大鼠腓肠肌FAS蛋白和肿瘤坏死因子的表达都明显高于安静对照组，其中肿瘤坏死因子的表达有非常显著性差异，并且运动后24 h安慰剂和用药组FAS蛋白和肿瘤坏死因子的表达进一步增高，造成这种原因可能机制是因为大量运动过后活性氧的产生会介导组织多环节的损伤其中包括促进FAS蛋白的表达。大强度运动过后还可刺激体内免疫细胞的增多和活化使肿瘤坏死因子的表达增加^[16]；运动24 h后由于肌细胞缺血再灌注，FAS蛋白和肿瘤坏死因子在组织中表达进一步增加^[17]，黄颖峰等^[18]检测发现，在运动后即刻，骨骼肌细胞凋亡数无明显变化；在运动后24 h，骨骼肌细胞凋亡数明显增多,提示运动导致的凋亡有延迟性的，但此机制有待进一步的证实。另外，从实验结果可以看出服用原花青素的大鼠在一次性大强度运动后即刻和24 h后FAS蛋白和肿瘤坏死因子都明显比服用安慰剂的大鼠表达低。这说明原花青素可能具有抑制凋亡蛋白和凋亡因子从而达到抗细胞凋亡损伤的功能。

3.3 原花青素对缓解细胞微损伤与抑制细胞凋亡的可能机制从病理生理学角度上看，引起细胞凋亡主要有两条途径介导^[11]：①线粒体途径介导。②死亡受体途径介导。第一种途径是由于线粒体呼吸链脱偶联，大量活性氧聚集在细胞内从而导致细胞的凋亡；第二种途径是由于体内相关死亡信号及受体表达增多从而导致细胞的凋亡。从实验看出，原花青素可以维持细胞内超氧化物歧化酶的活性，抑制大负荷运动后细胞膜脂质过氧化，从细胞内来达到防止肌细胞凋亡的目的；另外，它还可以降低大负荷运动后死亡信号(肿瘤坏死因子)和死亡受体(FAS蛋白)的表达，起到在细胞外抑制肌细胞凋亡的作用。综上所述，原花青素可以通过细胞内及细胞外途径缓解运动引起的肌细胞凋亡。

从实验结果分析看，无论是用药组还是安慰剂组运动后大鼠腓肠肌超氧化物歧化酶活性与丙二醛含量的比值都较运动前有明显的降低，运动24 h后这一比值进一步降低；而FAS蛋白及肿瘤坏死因子也随时间的推移而增加。这说明大负荷运动后的肌细胞损伤是一个不断加重的发展过程。但在这个过程中，细胞内还存在一些能够缓冲损伤的物质如抗氧化酶和抗凋亡蛋白等，这些缓冲物质可以阻止肌细胞损伤的发展。值得注意的是不同类型肌纤维的缓冲能力可能具有差异性^[19]。然而，当运动后自由基产生的越来越多、ATP含量的进一步下降等致损因素超过细胞的缓冲能力时，细胞损伤会以一种反馈联级的方式随时间的延续而加重加快，最终导致肌细胞的严重损伤——细胞凋亡。以运动后自由基损伤为例，大负荷运动后机体处于缺氧复氧的状态，自由基会在细胞内大量的产生，这不但直接引起基因损伤，而且还会引起ATP合成减少和脂质过氧化后细胞膜通透性的改变，ATP的减少和细胞膜脂质过氧化又可导致Ca²⁺超载，Ca²⁺超载又可反过来增大细胞膜的损伤和促进ATP的减少，Ca²⁺超载又会合并加强自由基对细胞基因的损伤，从而加重加快肌细胞的凋亡。因此推断肌细胞凋亡也有可能是细胞损伤加重到一定程度后的产物。实验用药组大鼠运动后即刻及24 h丙二醛浓度较安慰剂对照组低，而肿瘤坏死因子、FAS蛋白也比安慰剂对照组低，说明原花青素通过抑制细胞膜脂质过氧化损伤以及降低死亡受体蛋白和死亡信号的表达来减缓肌细胞从轻微损伤到细胞凋亡的发展过程。