芍药苷促椎间盘纤维环细胞增殖的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.012

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (2): 254-258.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.012

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芍药苷促椎间盘纤维环细胞增殖的作用

陈少清^{1, 2}，林建平^{1, 3}，王诗忠^{1, 2}，洪钰¹，陈乐春²

1.福建中医药大学，福建省福州市 350003
2.教育部省部共建中医骨伤及运动康复重点实验室，福建省福州市 350003
3.福建省运动功能康复重点实验室，福建省福州市 350003

收稿日期:2012-06-27 修回日期:2012-07-28 出版日期:2013-01-08 发布日期:2013-01-08
通讯作者: 王诗忠，博士，教授，主任医师，福建中医药大学，福建省福州市 350003；教育部省部共建中医骨伤及运动康复重点实验室，福建省福州市350003
作者简介:陈少清★，男，1983年生，福建省漳州市人，汉族，2009年福建中医药大学毕业，硕士，助教，医师，主要从事脊柱病康复研究。chenshaoqd@163.com
基金资助:
国家自然科学基金(30973764)；福建省卫生教育联合攻关计划项目(WKJ2008-2-48)；福建省科技厅国际合作项目(2009I0010)。

Paeoniflorin accelerates annulus fibrosus cells proliferation

Chen Shao-qing^{1, 2}, Lin Jian-ping^{1, 3}, Wang Shi-zhong^{1, 2}, Hong Yu¹, Chen Le-chun²

1 Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China
2 Key Laboratory of Orthopedics and Exercise Rehabilitation of Ministry of Education, Fuzhou 350003, Fujian Province, China
3 Fujian Rehabilitation Laboratory of Motor Function, Fuzhou 350003, Fujian Province, China

Received:2012-06-27 Revised:2012-07-28 Online:2013-01-08 Published:2013-01-08
Contact: Wang Shi-zhong, Doctor, Professor, Chief physician, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; Key Laboratory of Orthopaedics and Exercise Rehabilitation of Ministry of Education, Fuzhou 350003, Fujian Province, China
About author:Chen Shao-qing★, Master, Assistant teacher, Physician, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; Key Laboratory of Orthopaedics and Exercise Rehabilitation of Ministry of Education, Fuzhou 350003, Fujian Province, China chenshaoqd@163.com
Supported by:
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30973764*; Fujian Joint Research Project of Health Education, No. WKJ2008-2-48*; International Cooperation Projects of Fujian Provincial Department of Science and Technology, No. 2009I0010

摘要/Abstract

摘要：

背景：芍药在颈椎病治疗中使用频率超过30%，其主要单体之一芍药苷具有抗炎、抗凋亡等作用，芍药苷对椎间盘纤维环细胞是否有保护作用，国内外未见报道。
目的：探讨芍药苷对椎间盘纤维环细胞的增殖和保护作用。
方法：采用酶消化法体外培养椎间盘纤维环细胞。取第3代纤维环细胞，培养过程中加入20 μg/L Fas配体诱导建立纤维环细胞凋亡模型，通过MTT法测定芍药苷干预纤维环细胞的最适宜浓度，Annexin V/FITC-PI法观察芍药苷对椎间盘纤维环细胞的保护作用。
结果与结论：芍药苷浓度20.8和2.08 μmol/L对椎间盘纤维环细胞具有明显的促增殖作用。20 μg/L Fas配体能诱导细胞凋亡，20.8 μmol/L芍药苷对Fas配体诱导椎间盘纤维环细胞有保护作用。

关键词: 组织构建, 脊柱组织构建, 颈椎病, 芍药苷, FasL, 纤维环细胞, 细胞凋亡, 细胞增殖, 细胞保护, 椎间盘退变, 国家自然科学基金, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Chinese herbaceous peony has been usually used in the treatment of cervical spondylosis in a frequency of over 30%. Paeoniflorin, known as one of the main monomers, has cell-protective abilities against inflammation and apoptosis. Despite these compelling observations, whether paeoniflorin protects annulus fibrosus cells is not reported.
OBJECTIVE: To explore the proliferative and protective effects of paeoniflorin on intervertebral disc annulus fibrosus cells.
METHODS: Annulus fibrosus cells derived from the intervertebral disc were digested with trypsin and collagenase type Ⅱ for the further culture in vitro. The third-passage annulus fibrosus cells were selected to establish an apoptosis model in response to Fas ligand (20 μg/L) and were interfered with paeoniflorin. The appropriate concentration of paeoniflorin was detected by the method of MTT. Apoptotic rate was evaluated with Annexin V/FITC double staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The 20.8 and 2.08 μmol/L paeoniflorin significantly promoted the proliferation of annulus fibrosus cells. The apoptotic rate of annulus fibrosus cells in vitro was significantly increased after induction with the 20 μg/L Fas ligand. 20.8 μmol/L paeoniflorin could protect annulus fibrosus cells against Fas ligand-induced apoptosis.

Key words: cervical spondylosis, tissue construction, paeoniflorin, FasL, annulus fibrosus cells, apoptosis, proliferation, cytoprotection, disc degeneration, National Natural Science Foundation of China, tissue construction phothograhs-containing paper

中图分类号:

R318

陈少清，林建平，王诗忠，洪钰，陈乐春. 芍药苷促椎间盘纤维环细胞增殖的作用[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(2): 254-258.

Chen Shao-qing, Lin Jian-ping, Wang Shi-zhong, Hong Yu, Chen Le-chun. Paeoniflorin accelerates annulus fibrosus cells proliferation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(2): 254-258.

图/表（结果） 3

2.1 椎间盘纤维环细胞形态观察与鉴定细胞接种后随即在倒置显微镜下观察，培养液中存在着大小不等的圆形细胞和组织块，见图1a。随着培养时间延长，1 d后细胞开始散在贴壁，见图1b。4 d后，细胞发生明显变化，贴壁的基质细胞伸出突起变为梭形，三角形不等，体积增大，细胞数增多，见图1c。7-9 d后细胞开始融合，逐渐长满瓶底，见图1d。传代细胞为圆形，接种4- 6 h即迅速贴壁，伸展，重新恢复梭形，三角形不等。甲苯胺蓝染色可见细胞周围有少量紫色异染色颗粒，细胞核以圆形或椭圆形为主，呈深蓝色，见图1e。

图1 体外鼠椎间盘纤维环细胞培养和鉴定(×200)
Figure 1 Morphology and characterization of rat annulus fibrosus cells in vitro (×200)

2.2 Fas配体诱导及芍药苷对椎间盘纤维环细胞的保护作用见图2。
细胞凋亡率检测结果显示：对照组[(8.762 0 ±0.283 4)%]与Fas配体(20 μg/L)组[(21.536 0 ±0.544 6 )%]比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，芍药苷(20.8 μmol/L)+FasL(20 μg/L)组[(10.124 0± 0.320 5)%]与Fas配体(20 μg/L)组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，芍药苷(20.8 μmol/L)+Fas配体 (20 μg/L)组与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。可见Fas配体(20 μg/L)就能有效诱导细胞凋亡，且芍药苷(20.8 μmol/L)对Fas配体(20 μg/L)诱导细胞有一定的保护作用。
镜下观察Fas配体(20 μg/L)组纤维环细胞明显皱缩、变圆、脱落。芍药苷干预组与对照组无明显差异，大部分细胞贴壁生长，呈梭形或三角形，少数变圆、脱落。

图2 用质量浓度20 μg/L Fas配体诱导细胞，芍药苷 20.8 μmol/L干预椎间盘纤维环细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡率
Figure 2 The Annexin V/FITC assays for observing the apoptosis of annulus fibrosus cells treated with 20.8 μmol/L paeoniflorin, induced by 20 μg/L Fas ligand

2.3 芍药苷对椎间盘纤维环细胞活力的影响 MTT分析表明，芍药苷浓度为20.8和2.08 μmol/L作用24，36，48 h吸光度值与对照组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，芍药苷浓度为20.8和2.08 μmol/L之间差异无显著性意义(P > 0.05)。其他浓度组与对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，其他浓度组间差异也无显著性意义(P > 0.05)。可见芍药苷浓度为20.8和2.08 μmol/L对纤维环细胞具有明显的促增殖作用，见表1。

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引言

材料方法

设计：细胞水平实验。

时间及地点：实验于2009年9月至2011年9月在福建中医药大学康复医学研究所完成。

材料：

实验动物：取1月龄清洁级SD大鼠2只，雌雄不拘，体质量120 g左右，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号SCXX (沪) 2008-0005。

方法：

细胞培养鉴定：取1月龄SD大鼠，麻醉处死，无菌手术条件下，剖取背部颈椎，剔除脊椎周围肌肉韧带等组织，用眼科剪取下椎间盘，立即置入盛有PBS的培养皿中，小心去除髓核，清理干净纤维环上附着韧带肌肉等组织，将纤维环于PBS中漂洗3遍，然后用眼科剪剪成 1 mm³的小块，置0.25%胰蛋白酶，37 ℃恒温摇床中消化15 min，使其充分消化，1 000 r/min (离心半径 13.5 cm)离心5 min，去除胰蛋白酶，加入0.2%的Ⅱ胶原酶溶液，37 ℃恒温摇床中消化4 h，1 000 r/min(离心半径13.5 cm)离心5 min，除去剩余的Ⅱ型胶原酶溶液，PBS进行酶液清洗，1000 r/min(离心半径13.5 cm)离心5 min；DMEM液(含体积分数20%的胎牛血清)稀释，将细胞连同组织接种到25 cm²培养瓶中。通过细胞贴壁分离，获取纤维环细胞。置37 ℃、体积分数为5%CO₂的培养箱中培养。当细胞生长至近培养瓶底面积的80%时(原代细胞培养8-10 d)传代，培养条件同原代培养。

纤维环细胞的鉴定：

形态学鉴定：光镜观察细胞的形态。

纤维环细胞甲苯胺蓝染色：将第3代细胞接种在放有预处理盖玻片的6孔培养板中进行细胞爬片，待细胞长成单层时，进行甲苯胺蓝染色。中性树胶封固，显微镜下观察，拍照记录。

MTT比色实验：取第3代纤维环细胞接种到96孔板中，每孔细胞数4×10³-5×10³，待细胞贴壁后，弃去上清液，洗去未贴壁细胞。用含不同浓度芍药苷的DMEM培养液(2 080，208，20.8，2.08，0.208， 0.020 8 μmol/L)干预细胞，干预24，36，48 h后，加入MTT溶液(5 g/L) 10 μL，37 ℃孵育4 h，终止培养，吸弃培养板中的液体，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶标仪上以490 nm波长测定各孔吸光度值。

细胞凋亡率检测：取第3代细胞接种到6孔板，每孔细胞数3×10⁵个。先用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液培养，待细胞长满80%后，改为含体积分数为1%的胎牛血清的DMEM培养液培养8 h后，弃掉上清液，分别用体积分数为1%的胎牛血清配成的20 μg/L Fas配体^[8]单独干预以及体积分数为1%的胎牛血清配成的20 μg/L Fas配体+体积分数为1%的胎牛血清配成的20.8 μmol/L芍药苷联合干预24 h后，用冷的PBS清洗2遍，消化收集细胞，分别加入100 μL buffer液悬浮细胞后，加Annexin V–FITC 5 μL和PI 10 μL，避光孵育 15 min后，加入400 μL buffer液重悬细胞，随即用流式细胞仪进行凋亡率检测。以正常细胞为对照组。

统计学分析：计量资料均以x(_)±s表示，进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义，以上数据分析均由SPSS13.0统计软件包完成。

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Paeoniflorin accelerates annulus fibrosus cells proliferation

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