碘乙酸钠诱导原代大鼠软骨细胞凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.011

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (2): 247-253.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.011

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 上一篇下一篇

碘乙酸钠诱导原代大鼠软骨细胞凋亡

姜丽平¹，李龙婕²，宫德正¹，耿成燕¹，姜丽杰³，仲来福¹

1 大连医科大学-中日合作医药科学研究所，辽宁省大连市 116044
2 大连医科大学附属第一医院放疗科，辽宁省大连市 116023
3 大连大学附属中山医院内科，辽宁省大连市 116001

收稿日期:2012-04-02 修回日期:2012-05-12 出版日期:2013-01-08 发布日期:2013-01-08
通讯作者: 仲来福，教授，博士生导师，大连医科大学-中日合作医药科学研究所，辽宁省大连市 116044
作者简介:姜丽平★，女，1964 年生，辽宁省大连市人，汉族，1985年扬州大学毕业，硕士，高级实验师，主要从事分子毒理学的基础研究。dljlp@ yahoo.cn

Monosodium iodoacetate induces apoptosis of primary rat chondrocytes

Jiang Li-ping¹, Li Long-jie², Gong De-zheng¹, Geng Cheng-yan¹, Jiang Li-jie³, Zhong Lai-fu¹

1 China-Japanese Joint Institute for Medical and Pharmaceutical Science, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China
2 Department of Radiotherapy Oncology, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116023, Liaoning Province, China
3 Department of Medicine, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, Liaoning Province, China

Received:2012-04-02 Revised:2012-05-12 Online:2013-01-08 Published:2013-01-08
Contact: Zhong Lai-fu, Professor, Doctoral supervisor, China-Japanese Joint Institute for Medical and Pharmaceutical Science, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China
About author:Jiang Li-ping★, Master, Senior experimentalist, China-Japanese Joint Institute for Medical and Pharmaceutical Science, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China dljlp@yahoo.cn

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年碘乙酸钠多用于诱导骨关节炎的发生，病理结果观察到软骨区域凋亡的发生，但有关碘乙酸钠诱导软骨细胞凋亡机制的研究较少。
目的：探讨不同剂量碘乙酸钠诱导原代大鼠软骨细胞凋亡的发生机制。
方法：使用酶消化法建立大鼠关节软骨细胞培养体系；荧光显微镜和流式细胞仪检测软骨细胞凋亡；激光共聚焦显微镜和荧光分光光度计评估线粒体膜电位的改变；荧光分光光度法测定活性氧水平改变；免疫印迹法检测凋亡调控蛋白细胞色素C和caspase-3的表达。
结果与结论：碘乙酸钠剂量依赖性地诱导软骨细胞凋亡，使活性氧水平显著升高(P < 0.05），线粒体膜电位水平明显降低(P < 0.05），凋亡调控蛋白的表达明显增加。提示碘乙酸钠诱导的原代大鼠软骨细胞凋亡主要与活性氧的产生及线粒体介导的caspase-3活化有关。

关键词: 组织构建, 软骨组织构建, 软骨细胞, 碘乙酸钠, 活性氧, 线粒体膜电位, 细胞色素C, Caspase-3, 凋亡, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Recently, monosodium iodoacetate is usually used to cause cartilage degradation resembling the pathological changes of human osteoarthritis. However, rate studies report the mechanisms underlying monosodium iodoacetate-induced chondrocyte apoptosis.
OBJECTIVE: To assess the apoptosis of primary rat chondrocytes induced by different concentrations of monosodium iodoacetate and to clarify the underlying mechanism.
METHODS: The primary rat chondrocytes were treated with monosodium iodoacetate for 24 hours, and the induction of apoptosis was analyzed by flow cytometry and Hoechst 33342/PI staining. The levels of mitochondrial membrane potential were evaluated using fluorescence spectrophotometer and laser scanning confocal microscope. The production of reactive oxygen species was determined by fluorescence spectrophotometer. Apoptosis-related protein cytochrome C and caspase-3 expressions were examined by western blotting.
RESULTS AND CONCLUSION: Monosodium iodoacetate induced cellular apoptosis in a dose-dependent manner. Significantly increased level of reactive oxygen species was observed in primary rat chondrocytes at higher concentration of monosodium iodoacetate (P < 0.05). Significantly decreased levels of mitochondrial membrane potential were also shown in primary rat chondrocytes (P < 0.05). Western blot assay revealed that monosodium iodoacetate significantly increased the release of cytochrome C and the protein expression of caspase-3, leading to cell apoptosis. Together these observations suggest that the mechanisms of monosodium iodoacetate-induced apoptosis are primarily via the production of reactive oxygen species and mitochondria- mediated caspase-3 activation in primary rat chondrocytes.

Key words: tissue construction, cartilage tissue construction, chondrocytes, monosodium iodoacetate, reactive oxygen species, mitochondrial membrane potential, cytochrome C, Caspase-3, apoptosis

中图分类号:

R318

姜丽平，李龙婕，宫德正，耿成燕，姜丽杰，仲来福. 碘乙酸钠诱导原代大鼠软骨细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(2): 247-253.

Jiang Li-ping, Li Long-jie, Gong De-zheng, Geng Cheng-yan, Jiang Li-jie, Zhong Lai-fu. Monosodium iodoacetate induces apoptosis of primary rat chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(2): 247-253.

图/表（结果） 8

2.1 碘乙酸钠抑制软骨细胞增殖软骨细胞经不同浓度碘乙酸钠处理后，增殖能力明显下降[IC50，(8.26 ±0.10) μmol/L；95%可信限6.83-10.06]。图1显示，当碘乙酸钠浓度为3.0-12.0 μmol/L，细胞增殖能力出现明显下降(P < 0.05)；碘乙酸钠浓度达到24.0和36.0 μmol/L时，细胞死亡率接近100%( P < 0.05)。以上结果提示：碘乙酸钠诱导软骨细胞死亡并呈剂量依赖关系。

图1 碘乙酸钠抑制原代大鼠软骨细胞的增殖效应
Figure 1 Effect of monosodium iodoacetate on proliferation of primary rat chondrocytes

2.2 碘乙酸钠诱导软骨细胞凋亡不同剂量碘乙酸钠处理软骨细胞24 h，Hoechst 33342/PI染色，荧光显微镜结果显示，凋亡细胞数量呈逐渐增加的趋势，见图2。

图2 碘乙酸钠诱导原代大鼠软骨细胞凋亡(Hoechst 染色，×100)
Figure 2 Monosodium iodoacetate-induced apoptosis in primary rat chondrocytes (Hoechst staining,×100)

采用FITC-annexin V/PI染色，流式细胞仪分析结果显示，凋亡细胞的增加呈剂量依赖关系，见图3。

图3 碘乙酸钠诱导原代大鼠软骨细胞凋亡(流式细胞仪检测)
Figure 3 Monosodium iodoacetate-induced apoptosis in primary rat chondrocytes (Flow cytometry analysis)

1.5，3.0，6.0 μmol/L碘乙酸钠处理软骨细胞的凋亡率分别为(17.09±4.18)%，(19.83±1.76)%，(28.00 ±4.25)%，与0 μmol/L碘乙酸钠组(1.31±0.22)%比较差异有显著性意义(P < 0.05)。5 mmol/L N-乙酰半胱氨酸预处理+6.0 μmol/L碘乙酸钠组凋亡率为(16.24±3.60)%，与5 mmol/L N-乙酰半胱氨酸预处理比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。以上结果说明碘乙酸钠能促进软骨细胞凋亡，呈浓度依赖性，N-乙酰半胱氨酸则能抑制碘乙酸钠诱导的软骨细胞凋亡。

图4 碘乙酸钠诱导原代大鼠软骨细胞凋亡率
Figure 4 Monosodium iodoacetate-induced apoptotic rate of primary rat chondrocytes

2.3 碘乙酸钠诱导软骨细胞活性氧产生为了探讨碘乙酸钠诱导软骨细胞凋亡形成的机制，采用荧光分光光度计检测碘乙酸钠对细胞内活性氧生成的影响，见图5。细胞荧光强度随碘乙酸钠浓度增大而增高，当碘乙酸钠浓度为6.0 μmol/L时，细胞荧光密度明显增强(P < 0.05)，提示细胞内活性氧水平显著增加。5 mmol/L N-乙酰半胱氨酸预处理+6.0 μmol/L碘乙酸钠组与 6.0 μmol/L碘乙酸钠组比较，活性氧的生成明显减少，其差异有显著性意义(P < 0.05)。

图5 碘乙酸钠对原代大鼠软骨细胞活性氧生成的影响
Figure 5 Effect of monosodium iodoacetate on the production of reactive oxygen species in primary rat chondrocytes

2.4 碘乙酸钠降低软骨细胞线粒体跨膜电位不同剂量碘乙酸钠处理后的软骨细胞，采用罗丹明123荧光染料染色，荧光分光光度计检测结果显示，线粒体跨膜电位水平随碘乙酸钠浓度增大而下降；当碘乙酸钠浓度为6.0 μmol/L，线粒体跨膜电位明显下降(P < 0.05)。 5 mmol/L N-乙酰半胱氨酸预处理+6.0 μmol/L碘乙酸钠组与6 μmol/L碘乙酸钠组比较，线粒体跨膜电位的升高具有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

图6 碘乙酸钠诱导软骨细胞线粒体跨膜电位的改变
Figure 6 Monosodium iodoacetate-induced changes of mitochondrial membrane potential in primary rat chondrocytes

同时采用激光扫描共聚焦显微镜观察Rho123沿线粒体膜的分布。随着碘乙酸钠浓度的增加，Rho123在线粒体膜的累积减少，细胞的荧光染色强度逐渐降低，5 mmol/L N-乙酰半胱氨酸预处理+6.0 μmol/L碘乙酸钠组细胞的荧光染色强度明显大于6.0 μmol/L碘乙酸钠组，见图7。结果提示碘乙酸钠致软骨细胞线粒体跨膜电位降低呈剂量依赖性关系，N-乙酰半胱氨酸则能抑制线粒体跨膜电位降低。

图7 罗丹明123在碘乙酸钠损伤的原代大鼠软骨细胞线粒体膜累积的典型图片(×100)
Figure 7 Representative confocal images of accumulation of Rho123 in the mitochondrial membrane of primary rat chondrocytes induced by monosodium iodoacetate (×100)

2.5 碘乙酸钠诱导细胞色素C的释放和Caspase-3的蛋白表达为了解碘乙酸钠是否通过细胞色素C的释放启动凋亡，检测不同剂量碘乙酸钠对细胞色素C释放的影响。当碘乙酸钠浓度为3.0和6.0 μmol/L时，细胞色素C蛋白表达与0 μmol/L碘乙酸钠组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图8A。此外，碘乙酸钠处理后的细胞，caspase-3蛋白表达呈剂量依赖式增加，与0 μmol/L碘乙酸钠组比差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图8B。N-乙酰半胱氨酸能够有效抑制细胞色素C的释放(P < 0.05)和caspase-3的蛋白表达(P < 0.05)。

图8 碘乙酸钠对原代大鼠软骨细胞caspase-3和细胞色素C蛋白表达水平的影响
Figure 8 Western blot showing changes in the levels of cytochrome C and caspase-3 in primary rat chondrocytes induced by monosodium iodoacetate

参考文献

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引言

材料方法

设计：随机区组设计对照实验。

时间及地点：实验于2011年7月在大连医科大学-中日合作医药科学研究所完成。

材料：

实验动物：4周龄雄性SD大鼠20只，体质量130-150 g，由大连医科大学动物实验中心提供。实验中对动物处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准^[5]。

碘乙酸钠：购自上海阿拉丁试剂公司(CAS No.305-53-3，纯度98%)，分子式：ICH₂COONa，相对分子质量：207.93。

实验方法：

原代大鼠软骨细胞分离及培养^[6]：无菌处死大鼠，取出股骨头，用无菌Hank’s冲洗预防污染，去除结缔组织，并用手术刀切成1 mm³左右的小片。用含EDTA的胰酶消化15 min(37 ℃水浴摇床)，离心弃上清。加入5倍沉淀体积的0.2%Ⅱ型胶原酶(用无血清MEM配制)消化 1 h(37 ℃水浴摇床)，取出消化液上清，离心，将该沉淀用含体积分数为10%胎牛血清MEM重悬，将离心后的消化液上清重新加入未消化的软骨碎片中，重复3次，合并3次重悬液，用100目尼龙筛网过滤后分装入培养瓶中，在37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度条件下培养。所有的实验均采用3代以内的软骨细胞，软骨细胞活性采用锥虫蓝排除法检测。

除了MTT实验，其他实验的软骨细胞经氧自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸(5 mmol/L)预处理1 h后，暴露碘乙酸钠的浓度设为0，1.5，3.0，6.0 μmol/L，在37 ℃培养24 h。碘乙酸钠储备液用无血清MEM配制，在4 ℃保存，使用时间不超过1周。

MTT法检测细胞增殖能力：消化细胞，调整细胞浓度为3×10⁸ L^-1，以每孔100 μL接种于96孔板。细胞贴壁后，加入不同浓度的碘乙酸钠溶液(0，1.5，3.0，6.0，12.0，24.0，48.0 μmol/L)培养24 h，以0 μmol/L碘乙酸钠为对照组。弃去培养基，每孔加入含0.5 g/L MTT的培养液，37 ℃培养2 h，弃去培养液，每孔加酸化异丙醇溶液 100 μL，充分溶解后，检测A_{595 nm}。

细胞凋亡的形态学检测：收集对照组及碘乙酸钠处理组细胞，加10 μL Hoechst 33342和5 μL PI，37 ℃温育10 min，混匀，吸1滴混合液滴于载玻片上，盖玻片，封固，置于荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态学变化。

流式细胞仪检测细胞凋亡率：收集对照组及碘乙酸钠处理组细胞，用4 ℃预冷PBS洗涤细胞1次，沉淀重悬于Binding Buffer(结合缓冲液)中，加5 μL荧光标记的Annexin V，室温避光孵育15 min，上机前5 min再加入5 μL PI染色，补加200 μL Binding Buffer，流式细胞仪检测。

细胞内活性氧水平测定：参照文献[7]方法，采用荧光探针DCFH-DA 测定碘乙酸钠作用于软骨细胞后产生的细胞活性氧水平。消化收集处理后细胞(5×10⁵)，用PBS漂洗3次，再加入终浓度为5 μmol/L 的DCFH-DA，40 min后，将细胞和上清液一起用荧光比色计测定荧光强度。激发波长为485 nm，发射波长为550 nm，狭缝 4 nm。结果以处理组与对照组活性氧比值表示。

细胞线粒体跨膜电位检测：收集对照组及碘乙酸钠处理组细胞5×10⁵个，用PBS洗涤细胞2次，重悬于罗丹明123染色液(终浓度1.5 μmol/L)中，于37 ℃在水浴摇床上避光孵育15 min，离心，用荧光分光光度计检测上清中罗丹明123含量的改变，检测的激发波长为490 nm，发射波长为520 nm。结果以处理组与对照组线粒体跨膜电位比值表示。同时采用激光扫描共聚焦显微镜检测碘乙酸钠处理后软骨细胞内罗丹明123分布的变化。

Western blot 分析：收集不同浓度碘乙酸钠作用24 h后的软骨细胞，按蛋白提取试剂盒说明书提取细胞浆蛋白(用于细胞色素C检测)和总蛋白(用于caspase-3检测)。等量蛋白于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转膜，加入单克隆抗体(caspase-3，Cyt C，1∶200，β-actin，1∶400稀释)4 ℃过夜，加相应的辣根过氧化酶标记的二抗(1∶2 000稀释)室温摇床孵育2 h，ECL检测，扫描，于凝胶自动成像分析系统下成像，测定条带的平均积分吸光度值。以目的蛋白和β-actin条带密度的比值表示目的蛋白的相对含量，对照组的相对表达量为1，实验组的相对表达量用与对照组比较的倍数表示。

主要观察指标：大鼠股骨软骨细胞增殖情况、凋亡发生、活性氧和线粒体膜电位改变及蛋白表达的分析。

统计学分析：所有数据用x(_)±s表示，采用SPSS 11.5软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)和t 检验。实验均重复3次，P < 0. 05为差异有显著性意义。

讨论

碘乙酸钠可明显影响软骨细胞代谢并能引起软骨下骨病变和软骨细胞死亡，这些改变与人类骨关节炎的病理改变非常相似^[4]。据报道，碘乙酸钠能导致软骨基质的降解和软骨细胞的的凋亡^[8]。本文研究了碘乙酸钠所致软骨细胞凋亡及可能的分子机制。使用不同的方法检测碘乙酸钠诱导的原代大鼠软骨细胞凋亡。荧光显微镜和流式细胞仪检测结果显示，碘乙酸钠诱导的软骨细胞凋亡具有以下特征：DNA凝聚和碎裂，质膜通透性增加和磷脂酰丝氨酸暴露。上述结果提示，碘乙酸钠诱导原代大鼠软骨细胞凋亡且呈剂量依赖关系。

最近的研究显示，软骨细胞的凋亡或坏死都与细胞外基质合成代谢和分解代谢的紊乱有关，在骨关节炎发病的进程中起重要的作用^[9]。诱发凋亡的主要途径是：受体(外在)途径和线粒体(内在)途径。在前一途径，死亡受体直接触发caspase-8而启动下面的级联反应^[10]；在后一途径，则通过各种应激信号启动凋亡^[11-12]。通过线粒体改变产生细胞凋亡的信号包括能量产生的减少，线粒体跨膜电位的降低^[13-15]，线粒体膜渗透性的增加，以及促凋亡因子细胞色素C等的释放^[16]。许多研究已经表明，细胞色素C可触发caspase-3活化^[17]。本实验结果显示，碘乙酸钠引起线粒体跨膜电位降低，细胞色素C释放，caspase-3活化，最终导致原代大鼠软骨细胞凋亡。

活性氧的产生能够引起关节软骨炎症、细胞凋亡，最终导致关节炎^[18]。也有文献报道，活性氧能够活化介导抗凋亡途径的各种蛋白，例如核因子κB、热休克蛋白70和热休克蛋白27^[19-20]。此外，活性氧作为细胞内信号转导的第二信使在凋亡中起重要作用，它可能直接损伤线粒体，也可能是线粒体损伤后产生活性氧^[21]。在本实验中，碘乙酸钠促使活性氧水平增加，致使线粒体跨膜电位水平降低，从而提示原代大鼠软骨细胞经碘乙酸钠处理后活性氧的形成是线粒体跨膜电位改变的原因，氧化应激可以诱导软骨基质代谢的改变，从而导致骨关节炎的发生。Yudoh等^[22]的研究结果显示：抗氧化剂可以阻止氧化应激诱导的软骨细胞功能障碍以及软骨的降解。N-乙酰半胱氨酸是氧自由基的清除剂。本文结果显示，N-乙酰半胱氨酸能够抑止活性氧的产生，细胞色素C的释放，caspase-3的活化以及凋亡率的下降。作者推测，氧化应激在碘乙酸钠诱导的原代大鼠软骨细胞凋亡过程中起了重要的上调作用。因此，减轻关节软骨氧化损伤的干预措施，可能延缓或阻止骨关节炎的发生和发展。

碘乙酸钠可诱发软骨细胞凋亡，但其诱发凋亡的机制迄今尚未见报道。采用大鼠软骨细胞的体外实验发现，碘乙酸钠促进活性氧的产生，导致线粒体跨膜电位去极化，进一步加强细胞色素C的释放，增加caspase-3的活性，最终导致软骨细胞凋亡。本实验建立的体外大鼠软骨细胞模型，可用于骨关节炎药物的筛选。

碘乙酸钠诱导原代大鼠软骨细胞凋亡

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