骨髓间充质干细胞在骨缺损修复中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.027

摘要/Abstract

摘要：

背景：在一定条件下骨髓间充质干细胞具有分化为成骨细胞、软骨细胞的特性，成为骨组织工程中研究最为深入的种子细胞。
目的：对骨髓间充质干细胞在骨缺损中的基础研究与临床应用进展作一综述。
方法：应用计算机检索CNKI和Pubmed数据库中1999年1月至2012年1月关于骨髓间充质干细胞应用于骨缺损治疗的文章，在标题和摘要中以“骨髓间充质干细胞，骨缺损”或“ Bone mesenchymal stem cells，bone defect”为检索词进行检索。选择文章内容与骨髓间充质干细胞治疗骨缺损有关者，同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。最终选择30篇文献进行综述。
结果与结论：骨髓间充质干细胞分离获取方法成熟，具有成骨细胞定向诱导分化能力，能有效地进行骨质缺损修复，尤其随着生物支架材料和基因工程技术的发展，骨髓间充质干细胞在骨缺损治疗中的应用必将更加广泛。

关键词: 骨髓间充质干细胞, 骨组织工程, 骨缺损, 成骨细胞, 综述文献

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells have multilineage differentiation potential, which can be induced to differentiate into osteoblasts and chondrocytes under special conditions in vitro or in vivo. They are widely used for bone tissue engineering.
OBJECTIVE: To review the basic research and clinical application of bone marrow mesenchymal stem cells for repair of bone defects.
METHODS: The CNKI database and PubMed database (1999-01/2012-01) were used to search the related articles about the application of bone marrow mesenchymal stem cells for repair of bone defects. The key words are “bone marrow mesenchymal stem cells, bone defect”. Articles concerning bone marrow mesenchymal stem cells for the treatment of bone defects were included. For the articles that published recently or in the high-impact journals were preferred, and articles with repetitive contents were ruled out. Then 30 articles were suitable for further analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesechymal stem cells can be easily isolated from bone marrow. Bone marrow mesenchymal stem cells can be used to repair bone defects effectively because of their ability to differentiate into osteoblasts, especially with the development of biological scaffold materials and gene engineering technology.

中图分类号:

R318

林昭伟，李奇. 骨髓间充质干细胞在骨缺损修复中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(49): 9271-9275.

Lin Zhao-wei, Li Qi. Application of bone marrow mesenchymal stem cells in the treatment of bone defects [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2012, 16(49): 9271-9275.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞的生物学特性 20世纪70年代中期Fridenesten等^[2]发现在骨髓培养中有呈纺锤形的少量贴壁细胞，这些贴壁集落的细胞被称为成纤维细胞样-集落形成单位。后来该类细胞能分化为各种间充质组织的能力经研究报道，由此提出间充质干细胞的概念^[3]。这些来自骨髓的贴壁细胞已被应用于骨组织工程，但该类细胞缺乏表面特异标志，所以存在命名混淆，目前，称这些细胞为骨髓间充质干细胞被广泛接受^[4]。由于多分化潜能细胞能从不同的间充质组织分离得到，骨髓间充质干细胞也被称为来自骨髓的多分化潜能的间充质干细胞^[5]。

2.1.1 骨髓间充质干细胞的分离提纯骨髓间充质干细胞主要存在于骨髓窦的内腔面，骨髓中骨髓间充质干细胞的含量极少，约占骨髓中有核细胞的1/10万^[6]，使其在实际应用中受到限制，但其在体外培养中具有较强的增殖传代能力并保持良好的生物学活性，而且骨髓间充质干细胞容易分离获取^[7]。Bruder等^[8]发现培养条件下骨髓间充质干细胞在体外分裂(38±4)次，仍具有成骨潜能。目前，骨髓间充质干细胞的分离方法常用的有密度梯度离心法、贴壁细胞分离法、流式细胞仪和免疫磁珠分离法，其中后两者对骨髓间充质干细胞的分选过程中可造成细胞损伤和死亡对细胞活性影响较大，不利于获得大量的骨髓间充质干细胞，其方法的使用受到了限制。贴壁细胞分离法，也称全骨髓法，该方法培养细胞增殖快，但获得的细胞成分较多，很难获得高纯度的骨髓间充质干细胞。密度梯度离心法是根据骨髓中细胞成分比重的不同，由于多种生长因子的丢失，该方法培养细胞生长较为缓慢，但操作简便，可获得高纯度的骨髓间充质干细胞。Pittenger等^[9]的研究发现，通过密度梯度离心分离培养的骨髓间充质干细胞在第1代时纯度可以达到95%，第2代时纯度超过98%。

2.1.2 骨髓间充质干细胞的鉴别目前尚未发现骨髓间充质干细胞表面特有的标记分子，研究发现骨髓间充质干细胞表达的相对特异性表面抗原有CD105，CD73和CD90^[10]，但这些抗原具有非专一性，因此在骨髓间充质干细胞的鉴定上尚无统一方法，近期报道提出MCAM/CD146⁺可能是一种合适的标志^[11]，除了CD146，其他细胞表面标志如CD271，CD56，SSEA-4，STRO-1，间充质干细胞抗原-1(MSCA-1)和血小板源生长因子受体(PDGF-RB；CD140b)，也已被列入研究范围^[12]。通过测定细胞表面特异性标志可以作为鉴定骨髓间充质干细胞参考依据，同时，可以通过细胞形态学特征和干细胞多分化潜能的特性来辅助判断骨髓间充质干细胞。

2.1.3 骨髓间充质干细胞的体外培养骨髓间充质干细胞体外培养和扩增受多种因素的影响，如细胞分离程序、培养基、细胞接种密度、血清来源和类型、转代的次数等。合适的血清浓度有利于骨髓间充质干细胞的贴壁、扩增，自体血清更有利于保持细胞活力和好的生长状态^[13-14]。细胞接种密度高低也可影响细胞扩增的数量和质量，细胞接种密度过高会形成种子细胞在生物材料上过度堆积，营养供给不良导致过量的细胞死亡。一些细胞因子对骨髓间充质干细胞的生长也可产生影响。

2.1.4 骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化骨髓间充质干细胞在体内外能成功诱导分化成骨细胞已被大量研究所证实。骨髓间充质干细胞在体外培养扩增的过程中分化为成骨细胞需要合适的培养和诱导^[15]。Manitopoulos等^[16]研究发现大鼠骨髓间充质干细胞传代培养中加入地塞米松、ß-甘油酸钠及维生素C，利用免疫组化技术显示骨髓间充质干细胞能产生Ⅰ型胶原、骨钙蛋白阳性，表明骨髓间充质干细胞在体外适宜培养条件下可以向成骨细胞分化。虽然研究证实无诱导骨髓间充质干细胞在一定条件下体内也能异位成骨，但对一些成骨能力较低的骨髓间充质干细胞用地塞米松来诱导是有必要的^[17]。到目前为止，对骨髓间充质干细胞如何分化为成骨细胞的机制仍不清楚，其体内成骨诱导分化可能受局部各种细胞因子及力学环境的刺激。研究发现成人骨髓间充质干细胞体内传代4次后就失去成骨能力，但碱性成纤维细胞生长因子能维持骨髓间充质干细胞的成骨能力^[18]。因此，成骨诱导能提高骨髓间充质干细胞体内的成骨能力，更有利于其在骨组织工程中发挥作用。

2.2 骨髓间充质干细胞在骨缺损中的应用

2.2.1 支架载体材料及选择骨髓间充质干细胞要在骨组织工程中发挥种子细胞的作用势必依赖于能够发挥其生物学功能的支架载体。组织工程中用于细胞种植的支架一般应当具有以下一些性质^[19]：①良好的生物相容性。②良好的生物降解性。③具有三维多孔立体结构。④可加工性和有一定的机械强度。⑤良好的材料-细胞界面。⑥良好的消毒性能。迄今，组织工程应用的支架载体材料可分为天然类和人工合成类两大类。脱钙骨、胶原、藻酸盐等天然类材料虽然具有良好生物相容性及可降解性，但存在机械强度缺乏及难以控制降解时间的缺点。人工合成材料包括羟基磷灰石、磷酸三钙、钙磷陶瓷等无机生物陶瓷类和以聚乳酸、聚羟基乙酸及二者的共聚物为代表的高分子有机合成材料。生物陶瓷类主要是由磷、钙元素组成，为天然骨无机盐的主要成分，具有良好的生物相容性及骨传导性，但存在脆性大及难降解的缺点，高分子聚合物聚羟基乙酸、聚乳酸及其共聚物也被作为载体支架材料广泛应用于骨组织工程中，具有良好生物相容性，已被证明能支持细胞黏附、生长、分化和发挥功能。该类材料不足的是亲水性差、细胞吸附性能差、机械强度不足，无菌性炎症反应，更重要的是该类材料表面缺乏细胞识别信号，很难与细胞发生相互生物作用^[20]。单一材料作为细胞载体各有优缺点，为弥补各自的不足，通过合适的方法把两种或多种材料复合更趋向于理想的支架材料。自然骨质主要是由纳米羟基磷灰石晶体紧密地嵌入胶原机体中构成，也就是有机体中含有无机晶体双相复合材料，从仿生角度来看，利用羟基磷灰石与天然有机物如胶原、骨形成蛋白及合成高聚物复合，可望得到具有良好生物活性和生物相容性的种子细胞载体支架材料。传统的复合材料是将无机成分与有机成分通过掺混，研磨后在一定温度、压力条件下溶混压制而成的，存在分散不均匀、相互间缺乏作用力等缺陷，近年兴起的纳米技术能使材料的复合处于纳米级水平，可以赋予复合体优异的力学性能。

2.2.2 骨髓间充质干细胞复合生物材料的应用性研究国内外学者对骨髓间充质干细胞复合生物材料治疗骨缺损进行了大量的实验研究。Kdaiyala等^[21]构建 8 mm股骨骨干缺损模型，实验共分3组进行，第1组仅植入多孔羟基磷灰石/β-磷酸三钙陶瓷，第2组植入陶瓷和新鲜骨髓的复合物，第3组植入陶瓷与鼠骨髓间充质干细胞的复合物。植入8周后，载有骨髓间充质干细胞组骨形成迅速遍及整个生物基质，定量的组织学鉴定复合有骨髓间充质干细胞组早在术后4周时骨就充填了生物基质孔洞的20%，到8周时己超过40%，相比之下，未载细胞组不到10%，而载有新鲜骨髓组也不超过17%。载有骨髓间充质干细胞的植入物不仅能修复小动物骨缺损，对大动物骨缺损修复能力也得到了证实，刘阳等^[22]将富集骨髓间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石/壳聚糖植入兔股骨髁直径为7 mm、深度为10 mm的骨缺损空腔，植入12周后发现富集骨髓间充质干细胞-纳米羟基磷灰石/壳聚糖对股骨缺损修复效果较单纯纳米羟基磷灰石/壳聚糖凝胶效果好。Bruder等^[23]将复合人骨髓间充质干细胞的陶瓷植入物修复无胸腺小鼠的股骨缺损部位。植入12周后发现载有人骨髓间充质干细胞的陶瓷植入物组可完全性骨连合，而无载有人骨髓间充质干细胞的陶瓷植入物组只是在骨与陶瓷的邻接部位才出现骨重建，该项研究证实人骨髓间充质干细胞在体外纯化、培养扩增后能用于骨缺损的再生修复，另一方面也表明骨髓间充质干细胞的分化潜能具有跨种属性。同时，进行的多项临床研究也证实了骨髓间充质干细胞的临床价值。国外骨髓间充质干细胞首次应用于临床研究报道见于2004年，在该项研究中，骨髓间充质干细胞联合富含血小板移植至颌骨缺损，术后2个月结果显示骨髓间充质干细胞联合富含血小板修复骨缺损的效果明显优于松质骨颗粒与骨髓血浆^[24]，该项研究也为骨髓间充质干细胞大规模应用于临床研究奠定了基础。Quarto等^[25]用自体骨髓间充质干细胞与羟基磷灰石构建的组织工程骨修复3例肢体骨缺损，用X射线摄片及临床指标评价技术，证实移植的组织工程骨使3例患者恢复功能的时间分别为6.5个月、6个月和13个月。Dallari等^[26]以人骨髓间充质干细胞为种子细胞的组织工程骨进行临床高位胫骨截肢骨缺损治疗的研究，将28例患者分为3组，第1组单纯植入冻干骨片，第2组植入冻干骨片联合血小板胶体的复合物，第3组植入冻干骨片与自身骨髓间充质干细胞的复合物，结果显示，骨髓间充质干细胞的加入提高了冻干骨片的骨修复能力。

2.3 骨髓间充质干细胞的基因修饰研究证实在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化及促进成骨细胞的增殖代谢方面需要许多活性生物因子参与其中，如转化生长因子β、骨形态发生蛋白、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子和肿瘤坏死因子等，而成体内这些细胞因子缺乏，如果将骨髓间充质干细胞单独植入缺损部位，定向诱导效率不佳，骨化过程较慢^[27]。骨髓间充质干细胞联合生物活性因子应用于骨缺损是一种可行的办法，但生物活性因子在体内半哀期短，容易被体液冲走或稀释，因此难以保持局部有效治疗浓度，不能持续发挥作用，为了解决这个问题，许多学者采取了基因治疗的手段，应用基因修饰种子细胞使其较稳定、生理表达所需的生长因子，从而提高骨髓间充质干细胞的成骨潜能，使其更适宜于作为组织工程种子细胞。目前，修饰骨髓间充质干细胞采用的基因主要为可以使其分化、增殖、分泌基质的一些特定蛋白基因，如：骨形态发生蛋白、转化生长因子β、胰岛素样生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等，另外能促进局部血运重建的活性因子如血管内皮生长因子、血管紧张素1等基因也常用来修饰骨髓间充质干细胞。应用腺病毒或反转录病毒载体，骨形态发生蛋白2、4、7已经被成功转染骨髓间充质干细胞并显示细胞分泌的骨形态发生蛋白能在体内外促进骨髓间充质干细胞成软骨和成骨分化，还发现转染基因短期表达的骨形态发生蛋白2 能在体内异位成骨细胞^[28]。Xiao等^[29]把血管内皮生长因子基因转染至骨髓间充质干细胞，结果表明能高度的表达血管内皮生长因子蛋白并具有较强的生物活性。近年来许多实验证明，多个基因的联合传递更能促进骨修复，如Jiang等^[30]将联合基因骨形态发生蛋白与血管内皮生长因子转染骨髓间充质干细胞细胞复合磷酸三钙人工骨进行体外实验，结果发现，联合应用更能提高成骨活性。

参考文献

[1] Deng W, Obrocka M, Fischer I,et al. In vitro differentiation of human marrow stromal cells into early progenitors of neural cells by conditions that increase intracellular cyclic AMP. Biochem Biophys Res Commun. 2001;282(1):148-152.

[2] Friedenstein AJ, Chailakhjan RK, Lalykina KS.The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells.Cell Tissue Kinet. 1970;3(4):393-403.

[3] Kagami H, Agata H, Tojo A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation. Int J Biochem Cell Biol. 2011;43(3):286-289.

[4] Prockop DJ. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Mol Ther. 2009;17(6):939-946.

[5] Horwitz EM, Le Blanc K, Dominici M,et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2005;7(5):393-395.

[6] Charbord P. Bone marrow mesenchymal stem cells: historical overview and concepts. Hum Gene Ther. 2010;21(9):1045- 1056.

[7] Nardi NB, Camassola M. Isolation and culture of rodent bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells. Methods Mol Biol. 2011;698:151-160.

[8] Bruder SP, Jaiswal N, Haynesworth SE. Growth kinetics, self-renewal, and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation. J Cell Biochem. 1997;64(2): 278-294.

[9] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC,et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science. 1999;284(5411):143-147.

[10] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-317.

[11] Sacchetti B, Funari A, Michienzi S,et al. Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment.Cell. 2007;131(2):324-336.

[12] Bernardo ME, Locatelli F, Fibbe WE. Mesenchymal stromal cells. Ann N Y Acad Sci. 2009;1176:101-117.

[13] Salem HK, Thiemermann C. Mesenchymal stromal cells: current understanding and clinical status. Stem Cells. 2010; 28(3):585-596.

[14] Schecroun N, Delloye Ch. In vitro growth and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells supported by autologous plasma. Bone. 2004;35(2):517-524.

[15] Agata H, Watanabe N, Ishii Y,et al. Feasibility and efficacy of bone tissue engineering using human bone marrow stromal cells cultivated in serum-free conditions. Biochem Biophys Res Commun. 2009;382(2):353-358.

[16] Maniatopoulos C, Sodek J, Melcher AH. Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res. 1988;254(2):317-330.

[17] Mendes SC, Tibbe JM, Veenhof M,et al. Bone tissue-engineered implants using human bone marrow stromal cells: effect of culture conditions and donor age. Tissue Eng. 2002;8(6):911-920.

[18] Agata H, Asahina I, Watanabe N,et al. Characteristic change and loss of in vivo osteogenic abilities of human bone marrow stromal cells during passage. Tissue Eng Part A. 2010;16(2): 663-673.

[19] Burg KJ, Porter S, Kellam JF. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials. 2000;21(23):2347- 2359.

[20] Webster TJ, Ergun C, Doremus RH,et al. Enhanced functions of osteoblasts on nanophase ceramics. Biomaterials. 2000; 21(17):1803-1810.

[21] Fialkov JA, Holy CE, Shoichet MS,et al. In vivo bone engineering in a rabbit femur. J Craniofac Surg. 2003; 14(3):324-332.

[22] Kadiyala S, Young RG, Thiede MA,et al. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro. Cell Transplant. 1997;6(2):125-134.

[23] 刘阳,朱立新,杨宏,等.可注射性纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合骨髓间充质干细胞促进骨缺损的修复[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(34):6278-6282.

[24] Yamada Y, Ueda M, Hibi H,et al. Translational research for injectable tissue-engineered bone regeneration using mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma: from basic research to clinical case study. Cell Transplant. 2004;13(4): 343-355.

[25] Bruder SP, Kraus KH, Goldberg VM,et al. The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental bone defects. J Bone Joint Surg Am. 1998;80(7):985-996.

[26] Quarto R, Mastrogiacomo M, Cancedda R,et al. Repair of large bone defects with the use of autologous bone marrow stromal cells. N Engl J Med. 2001;344(5):385-386.

[27] Dallari D, Savarino L, Stagni C,et al. Enhanced tibial osteotomy healing with use of bone grafts supplemented with platelet gel or platelet gel and bone marrow stromal cells. J Bone Joint Surg Am. 2007;89(11):2413-2420.

[28] Volk SW, Diefenderfer DL, Christopher SA,et al. Effects of osteogenic inducers on cultures of canine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res. 2005;66(10):1729-1737.

[29] Noël D, Gazit D, Bouquet C,et al. Short-term BMP-2 expression is sufficient for in vivo osteochondral differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 2004;22(1):74-85.

[30] Xiao HB, Mei J, Zhang BR,et al. Study of adenovirus-mediated vascular endothelial growth factor 165 gene transfer into bone marrow stromal cells and its expressive product promoting proliferation of endothelial cells. Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 2005;43(2):92-96.

[31] Jiang J, Fan CY, Zeng BF. Experimental Construction of BMP2 and VEGF Gene Modified Tissue Engineering Bone in Vitro. Int J Mol Sci. 2011;12(3):1744-1755.