重组人骨形态发生蛋白2促进髁状突囊内骨折山羊骨髓间充质干细胞的成骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1820

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (29): 4610-4616.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1820

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重组人骨形态发生蛋白2促进髁状突囊内骨折山羊骨髓间充质干细胞的成骨分化

胡娟，姚志涛，王珊，胡阿特•哈德尔，买买提吐逊•吐尔地

新疆医科大学附属口腔医学院/口腔医院颌面创伤正颌外科，新疆医科大学第一附属医院颌面创伤正颌外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

修回日期:2019-03-13 出版日期:2019-10-18 发布日期:2019-10-18
通讯作者: 买买提吐逊?吐尔地，博士，主任医师，新疆医科大学附属口腔医学院/口腔医院颌面创伤正颌外科，新疆医科大学第一附属医院颌面创伤正颌外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:胡娟，女，1990年生，四川省南部县人，汉族，在读硕士，医师，主要从事颌面创伤外科研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2016D01C249)，项目负责人：买买提吐逊•吐尔地

Recombinant human bone morphogenetic protein 2 promotes osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from intracapsular condylar fracture goats

Hu Juan, Yao Zhitao, Wang Shan, Huate•Hadeer, Maimaitituxun•Tuerdi

Department of Maxillofacial Surgery, Stomatology College/ Stomatology Hospital of Xinjiang Medical University, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2019-03-13 Online:2019-10-18 Published:2019-10-18
Contact: Maimaitituxun?Tuerdi, MD, Chief physician, Department of Maxillofacial Surgery, Stomatology College/Stomatology Hospital of Xinjiang Medical University, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Hu Juan, Master candidate, Physician, Department of Maxillofacial Surgery, Stomatology College/Stomatology Hospital of Xinjiang Medical University, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2016D01C249 (to MT)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨髓间充质干细胞的成骨分化：骨髓间充质干细胞必须借助特定的诱导剂才能使其向成骨细胞定向分化。近些年来，多种诱导剂被运用到实验研究中，骨形态发生蛋白2是转化生长因子β家族中的成员，是目前骨形成过程中唯一能独立诱导间充质干细胞分化为成骨细胞的调控因子，实验主要通过检测碱性磷酸酶活性、骨钙素含量来判断成骨细胞的分化水平。
髁突囊内骨折：是指发生在下颌骨髁突的骨折，骨折位于颞下颌关节的关节囊内。髁突呈椭圆形，前后径较内外径短，髁突顶部存在方向由内向外的骨性隆起将髁突分为前、后两个斜面，其中前斜面与关节结节的后斜面一起构成颞下颌关节的主要负重区。髁突由于其解剖及生物力学特点，在下颌骨遭受创伤时最容易发生骨折，占下颌骨骨折的25%-35%。

摘要
背景：国内外学者均认为髁状突囊内骨折后形成颞下颌关节强直的原因主要是大量成骨的过程。评估不同类型髁状突囊内骨折后骨髓间充质干细胞的成骨潜能，为创伤性颞下颌关节强直提供细胞生物学及分子学证据。
目的：探讨重组人骨形态发生蛋白2对不同类型髁状突囊内骨折山羊骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。
方法：16只健康山羊双侧关节随机分为4组，8只山羊为左侧A型髁突囊内骨折组(A组)+右侧B型髁突囊内骨折组(B组)，另外8只为左侧C型髁突囊内骨折组(C组)+右侧对照组(D组)，分别在术后1，2，3，6个月各时间点A、B组处死2只，C、D组处死2只，即每个时间点共处死4只，分离、提取第3代骨髓间充质干细胞，根据是否进行重组人骨形态发生蛋白2诱导分为诱导组和非诱导组，按照试剂盒说明检测培养7，10 d时的碱性磷酸酶活性及骨钙素含量，诱导培养1周后进行碱性磷酸酶染色。
结果与结论：与非诱导组比较，4组骨髓间充质干细胞使用重组人骨形态发生蛋白2诱导后，碱性磷酸酶活性及骨钙素含量明显升高(P < 0.05)；B组诱导后碱性磷酸酶活性及骨钙素含量较A、C、D组明显升高(P < 0.05)。结果表明，体外分离培养的山羊骨髓间充质干细胞在重组人骨形态发生蛋白2诱导作用下表现出明显的成骨活性，且B型髁突囊内骨折后的骨髓间充质干细胞成骨活性明显高于A型、C型髁突囊内骨折。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0505-0993(买买提吐逊•吐尔地)；0000-0001-7403-7891(胡娟)

关键词: 髁状突囊内骨折, 骨髓间充质干细胞, 重组人骨形态发生蛋白2, 碱性磷酸酶活性, 骨钙素, 成骨分化, 创伤性颞下颌关节强直, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Intracapsular fracture of the condyle may lead to traumatic temporomandibular joint ankylosis, which is mainly related to massive bone formation. Herein, we evaluated the osteogenic potential of bone marrow mesenchymal stem cells after different types of intracapsular condylar fractures, to provide cell biology and molecular evidence for traumatic temporomandibular joint ankylosis.
OBJECTIVE: To induce the osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells after different types of goat intracapsular condylar fractures in vitro by recombinant human bone morphogenetic protein-2.
METHODS: Bilateral mandibular condyles of 16 healthy goats were randomly divided into 4 groups: 8 goats were used to make models of type A intracapsular condylar fractures of the left condyle (group A) and models of type B intracapsular condylar fractures of the right condyle (group B), and the other 8 goats were used to make models of type C intracapsular condylar fractures of the left condyle (group C) and models of type D intracapsular condylar fractures of the right condyle (group D). One rat from each group was sacrificed at the following intervals, 1, 2, 3 and 6 months postoperatively. Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells were isolated, extracted and induced by recombinant human bone morphogenetic protein-2 (induction group) or not (non-induced group), and cultured according to the kit’s instruction. The alkaline phosphatase activity and osteocalcin content were measured at 7 and 10 days after induced culture, and alkaline phosphatase staining was performed at 1 week after induced culture.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the corresponding non-induced group, the alkaline phosphatase activity and the osteocalcin content in groups A, B, C, and D after induction with recombinant human bone morphogenetic protein-2 were significantly increased (P < 0.05). The alkaline phosphatase activity and osteocalcin content in group B were significantly higher than those in groups A, C, and D after induced by recombinant human bone morphogenetic protein-2 (P < 0.05). To conclude, the use of recombinant human bone morphogenetic protein-2 can trigger marked osteoblast differentiation of goat bone marrow mesenchymal stem cells. Moreover, the osteogenic activity of bone marrow mesenchymal stem cells after type B intracapsular condylar fractures was superior to that after type A and C intracapsular condylar fractures.

Key words: intracapsular condylar fracture, bone marrow mesenchymal stem cells, recombinant human bone morphogenetic protein-2, alkaline phosphatase activity, osteocalcin, osteogenic differentiation, traumatic temporomandibular joint ankylosis, Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region

中图分类号:

胡娟，姚志涛，王珊，胡阿特•哈德尔，买买提吐逊•吐尔地. 重组人骨形态发生蛋白2促进髁状突囊内骨折山羊骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(29): 4610-4616.

Hu Juan, Yao Zhitao, Wang Shan, Huate•Hadeer, Maimaitituxun•Tuerdi. Recombinant human bone morphogenetic protein 2 promotes osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from intracapsular condylar fracture goats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(29): 4610-4616.

图/表（结果） 4

2.1 术后山羊一般情况 术后所有山羊术区切口愈合良好，未发生感染情况，16只山羊均活到检测时间点，均进入实验研究。

2.2 BMSCs生长形态变化 原代接种后，呈现大小不一的单个圆形细胞与大量的悬浮红细胞混杂于培养液中；培养24 h可见少量细胞出现贴壁；培养48 h，悬浮细胞明显减少，大部分细胞沉积在瓶底，具有强折光性，多数呈单个贴壁生长分散于大量杂细胞中，贴壁细胞出现伸展变形的现象，伸出伪足，呈现多角形。随着换液，贴壁细胞逐渐增多，7-10 d后可见明显细胞集落，呈漩涡状生长。传代后，细胞得以纯化，细胞形态呈现三角形、梭形及少量的多角形，形态不规则。传至第3代时，细胞呈长梭形，细胞形态一致，贴壁及增长速度逐渐加快，传代后 4 h即可贴壁，生长密集，分布均匀，整体呈漩涡状或放射状排列，细胞膜和细胞核清晰可见，见图2。使用重组人骨形态发生蛋白2诱导剂后细胞生长速度明显减慢，体积增大，呈梭形或多角形，胞质内可见散在发布的颗粒状物质及空泡。

2.3 BMSCs表面标记检测结果 免疫细胞化学染色结果显示，CD29、CD44表面抗原均呈现阳性表达，而不表达CD34等造血干细胞标志物，此次实验提取的第3代细胞纯度较高，细胞呈现梭形，胞浆呈黄褐色，见图3。

2.4 MTT比色法检测细胞增殖并绘制生长曲线 第3代BMSCs增殖能力强，第2，3天为潜伏期，在第4，5天基本进入对数生长期，第6，7天到达生长峰值，之后进入平台期，生长速度趋向于稳定。

2.5 碱性磷酸酶染色结果 碱性磷酸酶是成骨细胞的标志性酶，主要分布在成骨细胞释放的基质小泡的膜上，可以通过检测碱性磷酸酶了解成骨分化程度。经重组人骨形态发生蛋白2骨向诱导后A1-D1组碱性磷酸酶染色均为阳性，各组细胞呈蓝紫色，见图3D，提示细胞碱性磷酸酶分泌旺盛，呈典型的成骨细胞表现；未诱导的A2-D2组碱性磷酸酶染色呈阴性。

2.6 碱性磷酸酶活性及骨钙素含量 与非诱导组(A2-D2组)相比，诱导组(A1-D1组)在同时间同骨折类型的吸光度值均明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；术后1，2，3，6个月，B1组吸光度值较A1、C1、D1组高，差异有显著性意义(P < 0.05)；B1组术后1，2，3个月吸光度值明显高于术后6个月，术后6个月开始出现吸光度值下降，见表1-4。

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引言

髁状突由于解剖和生物力学上的特殊性，在颌面部遭受创伤时容易发生骨折，是下颌骨骨折中最常见的类型，其中以髁突囊内骨折多见。髁突囊内骨折形式多样、预后差异较大，骨折后可能会引起咬合紊乱、关节区疼痛及关节强直等并发症，目前髁突囊内骨折的最佳诊疗方案一直存在分歧，主要集中在开放手术治疗还是闭合性治疗^[1-2]。近年来，研究显示创伤已经成为颞下颌关节强直的主要致病原因。蔡怡华等^[3]通过回顾分析发现，导致关节强直的髁突骨折类型均为囊内骨折，其中B型占70%。然而到目前为止，髁突囊内骨折引发颞下颌关节强直的形成条件、发生机制和发展病程的相关研究有限，国内外无大量组织学样本研究证明哪一型或者哪几型的髁突囊内骨折会导致颞下颌关节强直。国内外学者均认为髁状突囊内骨折后形成颞下颌关节强直的原因主要是大量的成骨过程。

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是Friedenstein等^[4]首次在骨髓中发现的一种具有自我更新和多向分化能力的干细胞，BMSCs可以在骨形态发生蛋白2的诱导下不可逆地向成骨方向分化，促进成骨细胞的分化成熟，出现碱性磷酸酶升高、钙结节沉积、Ⅰ胶原表达等成骨细胞特定的标志^[5]。依据杨驰等^[6]在冠状位CT上髁突骨折线位置，髁突囊内骨折一共分A、B、C及M 4型，A型：骨折线位于髁突外1/3，B型：骨折线位于髁突中1/3，C型：骨折线位于髁突内1/3，M型：髁突头粉碎性骨折。该研究分别制备A、B、C类型山羊髁突囊内骨折，分离提取BMSCs，运用重组人骨形态发生蛋白2对其进行成骨定向诱导，然后进行碱性磷酸酶活性及骨钙素含量检测及对比分析，评估不同类型髁状突囊内骨折后BMSCs的成骨潜能，为创伤性颞下颌关节强直提供细胞生物学及分子学证据，从而在后期指导临床上髁突囊内骨折的诊疗。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 动物造模及细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年12月至2018年7月在新疆医科大学第一附属医院动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验试剂与仪器 DMEM培养基、胎牛血清、Percoll分离液(Gibco)；重组人骨形态发生蛋白2(Cell Science)；黄芪多糖(APS)；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、青霉素、链霉素、地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、MTT、二甲基亚砜(Sigma)；碱性磷酸酶活性试剂盒(南京建成生物工程研究所)；大鼠骨钙素酶联免疫试剂盒(CUSABIO公司)；CKX41倒置相差显微镜(Olympus)；CO₂孵箱(SanYo MCO-15AC)；离心机(Anke 70L-50B)。

1.3.2 实验动物的选择、分组 16只山羊，6-8个月龄(相当于人类6-8岁)，体质量10-12 kg，雌雄不限，由新疆医科大学第一附属医院动物实验室提供。实验经过新疆医科大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准通过。实验前山羊圈养1周，观察无全身性疾病、缺失牙、颞下颌关节疾病及营养状况良好者纳入实验。山羊双侧颞下颌关节随机分4组：8只山羊为左侧髁突A型囊内骨折组(A组)+右侧髁突B型囊内骨折组(B组)，另外8只为左侧髁突C型囊内骨折组(C组)+右侧对照组(D组)，分别在术后1，2，3，6个月各时间点A、B组处死2只，C、D组处死2只，即每个时间点共处死4只。后期实验提取的细胞，根据是否加重组人骨形态发生蛋白2，将A、B、C、D分组分为：A1、B1、C1、D1组(加重组人骨形态发生蛋白2)+A2、B2、C2、D2组(不加重组人骨形态发生蛋白2)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型制备 实验前山羊颗粒饲料喂养1周，术前24 h禁食水，麻醉前称质量，用30 g/L氯胺酮-速眠新按1.5 mL/kg行腹腔注射麻醉。所有山羊关节区手术均由同一实验员完成。麻醉生效后，山羊仰卧位固定于实验台上，双侧耳前区备皮、消毒、铺无菌巾，在颧弓下0.5 cm设计4.0 cm的平行切口，逐层切开至肌层表面，钝性分离至髁状突颈部，不分离关节囊附着的情况下切开关节囊小口，暴露部分髁突，然后用小骨刀敲击，分别形成A型、B型、C型髁突囊内骨折，见图1，对照组(D组)仅切开皮肤及皮下组织，显露并打开关节囊上、下腔。造模成功后止血，大量生理盐水冲洗术区，分层缝合创面，留置橡皮片，术毕肌注庆大霉素2×10⁴ U，术区加压包扎，术后即刻CT等影像学检查明确手术效果。山羊麻醉苏醒后送回圈养，术后48 h拆除术区加压包扎装置及引流片，术后7 d拆除术区缝线。术后先用颗粒软饲料喂养，2周后改用正常颗粒饲料喂养。

1.4.2 BMSCs的分离及培养 手术后不限制山羊下颌运动，分别在术后1，2，3，6个月通过过量注射麻醉剂处死，在无菌条件下解剖分离 A、B、C、D各组的髁状突，提取髁状突骨髓腔内骨髓15 mL，加入肝素抗凝，转至超净工作台，取1支15 mL离心管，先加入DMEM培养液(体积分数为20%胎牛血清+0.1%青、链霉素)5 mL，然后加入刚刚提取的骨髓6 mL，摇匀，2 200 r/min离心25 min，弃上清液，在离心管中加入DMEM培养液5 mL，轻轻摇匀，即山羊的骨髓悬浮液。另取1支15 mL离心管，加入1.073 g/mL的Percoll细胞分离液5 mL，然后缓慢加入山羊骨髓悬浮液，2 200 r/min离心25 min，吸取白膜层，使用DMEM培养液洗2遍，弃上清液，混匀离心管，加入DMEM培养液1 mL，调整细胞浓度接种到一次性50 mL培养瓶中，标记为原代，置37 ℃、体积分数5%CO₂的细胞培养箱中孵育，48 h首次换液，此后每2 d或3 d换液1次，逐渐去除非贴壁细胞，当细胞80%-90%融合时，用0.25%胰蛋白酶以1∶2比例进行消化传代，记为第1代，以后细胞以1∶3比例进行传代，倒置相差显微镜下观察BMSCs形态及生长变化，并照相作记录。

1.4.3 BMSCs鉴定 取各组第3代细胞，按文献[7]方法检测细胞表面抗原标记物CD29、CD34、CD44的表达。

1.4.4 BMSCs生长曲线的测定 取各组第3代对数生长期细胞，0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞浓度分别为3×10⁴ L^-1，5×10⁴ L^-1，7×10⁴ L^-1，接种于96孔板中，采用MTT法测定细胞增殖情况，用酶标仪测定波长490 nm 时每孔的吸光度值，重复3次并取平均值，了解细胞的生长状况并选择最佳接种浓度。实验发现细胞浓度为3×10⁴ L^-1时细胞生长状态最好，均呈现典型的“S”型曲线，故以下实验选择细胞浓度为3×10⁴ L^-1。

1.4.5 BMSCs的骨向诱导 取体外扩增且生长活力旺盛的第3代BMSCs，0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，调整细胞浓度为3×10⁴ L^-1，接种于96孔板，每孔100 μL，每组各时间点接种6孔，每组6个实验复孔。待细胞生长至80%以上融合时，弃培养液，A1、B1、C1、D1组中加入诱导培养基(含200 mg/L重组人骨形态发生蛋白2、体积分数为10%胎牛血清、0.1%青、链霉素、L-DMEM培养基)，A2、B2、C2、D2组继续用DMEM培养基(含体积分数为10%胎牛血清、0.1%青、链霉素)，于37 ℃、体积分数为5%CO₂的标准培养箱进行培养，每3 d换液1次，每日于倒置显微镜下观察细胞形态变化及生物学特性检测。

1.4.6 细胞碱性磷酸酶活性检测及碱性磷酸酶染色 上述各组细胞培养7，10 d时，弃培养液，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液后收集细胞，使用碱性磷酸酶染色试剂盒按说明书进行碱性磷酸酶活性检测，于波长405 nm处测定各孔吸光度。采用钙钴法进行碱性磷酸酶染色，将各组诱导1周的细胞爬片取出，40 g/L多聚甲醛固定30 min，2%硝酸钴5 min，1%硫化铵5 min，1%中心红染色1 min，冲洗后干燥，封固，显微镜下观察并拍照。

1.4.7 骨钙素含量检测 上述各组细胞培养7，10 d时，吸取各组培养液上清，离心，取上清标本，使用骨钙素酶联免疫试剂盒进行骨钙素含量检测，于波长450 nm处测定各孔吸光度值。

1.5 主要观察指标 各组各时间点BMSCs的碱性磷酸酶活性及骨钙素含量。

1.6 统计学分析 应用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据均以x(_)±s表示，采用多因素方差分析并进行方差齐性检验，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

由于颞下颌关节解剖结构及骨折后微环境比较复杂，目前对创伤性颞下颌关节强直的发病机制掌握有限，其治疗仍是颌面外科疾病治疗中的一大难点。在临床上，创伤是颞下颌关节强直的首要病因，占62.82%-98.5%^[8]。以往的研究显示，髁突骨折中只有约0.4%会发展成颞下颌关节强直，这说明创伤性颞下颌关节强直形成与骨折的类型有关，并不是所有的骨折都会形成关节强直。Zhang等^[9]通过回顾性病例分析发现，髁状突矢状骨折及髁突粉碎性骨折是颞下颌关节强直的危险类型。此外，髁突骨折联合颏部或颏旁骨折显著增加了关节强直的风险。Duan等^[10]通过回顾性病例研究发现，关节盘移位不明显且相对完整可有效避免髁状突与关节面的成骨，从而降低颞下颌关节强直的发生概率。Yan等^[11]利用生长期山羊进行实验，发现颞窝严重损伤山羊术后出现了张口受限，在关节间隙出现了大量的异位骨形成。因此可以推断，关节面开放性骨折、关节盘的移位及颞窝严重损伤是创伤性颞下颌关节强直形成的重要因素。

早期创伤性颞下关节强直被认为是创伤后关节内血肿导致的^[12-13]，但后来的动物实验发现单纯的关节内血肿并不会导致关节强直^[14]。近年来，研究发现创伤性颞下颌关节强直与肥大性骨不连相似，在两者的强直组织透射带中都发现了具有多向分化潜能的间充质干细胞^[15]，成骨能力弱于正常的骨折愈合，高于纤维性强直^[16]。有学者利用绵羊动物模型实验发现，翼外肌的牵拉在髁突矢状骨折后形成颞下颌关节强直过程中起重要的作用^[17]。Yan等^[18]通过分子学研究发现，骨形态发生蛋白家族及Wnt信号通路均与颞下颌关节强直形成有关。与纤维性颞下颌关节强直相比，骨性颞下颌关节强直在Wnt2b、Wnt5a、β-Catenin、Lef1、CyclinD1、Runx2、Osterix、Sox9、Col10a1、Alp、Ocn、BMP-2和BMP-7中表现出更高的mRNA表达趋势，呈现高水平的骨形成相关基因表达^[19]。

骨形态发生蛋白2是转化生长因子β家族中的成员，是一种重要的成骨调节因子，具有较强的促进成骨细胞分化功能。BMSCs是一种存在骨髓基质中易于贴壁的纺锤状细胞^[20]，由于其取材容易、易于体外培养及体内回植、具有多向分化潜能等特性，被广泛作为种子细胞应用于骨组织及软骨组织工程^[21-22]。BMSCs必须借助特定的诱导剂才能使其向成骨细胞定向分化。近些年来，多种诱导剂被运用到实验研究中^[23]，骨形态发生蛋白2是目前骨形成过程中唯一能独立诱导间充质干细胞分化成骨细胞的调控因子^[24]。天然的骨形态发生蛋白获取及纯化比较困难，目前主要通过基因重组技术获得重组人骨形态发生蛋白2。碱性磷酸酶是一种生物活性蛋白质，具有间接促进羟基磷灰石形成的特点，参与骨、软骨组织等钙化组织代谢和再生，在BMSCs骨化过程中发挥了重要作用，可以通过检测碱性磷酸酶的活性反映成骨细胞的分化程度。骨钙素是一类γ-羧谷氨酸蛋白，是骨基质中非胶原酸性蛋白，仅有成骨细胞可以合成和分泌骨钙素，主要出现在矿化形成期。因此，骨钙素含量是检测成骨细胞功能及成熟的一种标志性酶^[25]。

目前，制备髁突骨折动物模型的方法大致分为2种，一种是利用致伤工具撞击下颌骨造成髁突囊内骨折，此方法的优点是比较接近临床，但实验个体间的差异较大，复制性差，无法对不同类型髁突囊内骨折后的病理生理机制进一步研究；另有一种方法是利用手术人为造成髁囊内骨折，此方法克服了前一种方法的困难，但人为破坏了关节的封闭性，与临床上的髁状突囊内骨折尚存在一定的差异^[26-27]。此次实验中，为了更加接近临床上颞下颌关节损伤的真实情况，采用在不分离关节囊附着的情况，在关节囊上切取小口，制备开放性的髁突囊内骨折模型。实验还成功从山羊髁突中提取骨髓，采用全骨髓贴壁法与密度梯度离心法分离单核细胞，在体外培养获得了形态及表面标志物均一的BMSCs，并在特定的诱导剂重组人骨形态发生蛋白2的作用下诱导其定向分化，结果显示经重组人骨形态发生蛋白2诱导后BMSCs碱性磷酸酶活性明显增高，说明重组人骨形态发生蛋白2对BMSCs增殖及分化均有促进作用，碱性磷酸酶染色阳性结果说明细胞已向成骨细胞分化，这与以往的研究结果一致^[28-29]。在该研究中，B型髁突囊内骨折山羊BMSCs在使用重组人骨形态发生蛋白2诱导后，其碱性磷酸酶活性及骨钙素含量均高于A型骨折组、C型骨折组及对照组。

骨髓为造血干细胞和间充质干细胞提供壁龛，在骨折愈合过程中具有重要功能^[30]。因此，有学者认为髁突骨折后形成颞下颌关节强直的原因，可能是由于BMSCs具有较高的成骨潜能并在髁突骨折后大量的成骨过程。但He等^[31]研究发现，在骨性关节强直组织中，BMSCs的成骨潜能和破骨细胞的数量以及骨髓中单核细胞的破骨细胞生成速率均下降，关节强直的高密度骨球形成可能是由于其破骨细胞的数量减少。因此，髁突BMSCs的高成骨潜能不能完全解释关节强直的高密度骨球形成。

综上所述，B型髁突囊内骨折的髁突BMSCs在术后1，2，3，6个月表现出较高的成骨活性，但由于使用大动物实验，实验中尚存在不足，例如样本量偏小、追踪时间偏短，后续会进一步完善。髁突骨折后关节强直的形成是比较缓慢、复杂的过程，虽然大量的动物实验及临床研究为创伤性颞下颌关节强直的发病机制提供了新的证据，但创伤后形成关节强直过程的细胞生物及分子机制仍未被完全明确，其发病机制还有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

重组人骨形态发生蛋白2促进髁状突囊内骨折山羊骨髓间充质干细胞的成骨分化

Recombinant human bone morphogenetic protein 2 promotes osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from intracapsular condylar fracture goats

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