长链非编码RNA肝癌高表达转录本促进人骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1794

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (29): 4656-4661.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1794

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长链非编码RNA肝癌高表达转录本促进人骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化

李梦¹，周云²，禹亚彬³，王超群¹，巩玉森¹

¹徐州医科大学病理学教研室，江苏省徐州市 221004；²徐州市中心医院肿瘤放疗科，江苏省徐州市 221004；³淮安市第一人民医院肝胆胰外科，江苏省淮安市 223300

修回日期:2019-04-07 出版日期:2019-10-18 发布日期:2019-10-18
通讯作者: 巩玉森，硕士，主任医师，徐州医科大学病理学教研室，江苏省徐州市 221004
作者简介:李梦，女，1992年生，江苏省淮安市人，汉族，在读硕士，主要从事长链非编码RNA的研究。
基金资助:
徐州市科技计划项目(KC17111)，项目负责人：周云

Long-chain non-coding RNA highly up-regulated in liver cancer promotes the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytes

Li Meng¹, Zhou Yun², Yu Yabin³, Wang Chaoqun¹, Gong Yusen¹

¹Department of Pathology, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China;²Department of Radiation Oncology, Xuzhou Central Hospital, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; ³Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, Huaian First People’s Hospital, Huaian 223300, Jiangsu Province, China

Revised:2019-04-07 Online:2019-10-18 Published:2019-10-18
Contact: Gong Yusen, Master, Chief physician, Department of Pathology, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China
About author:Li Meng, Master candidate, Department of Pathology, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Science and Technology Research Project of Xuzhou City, No. KC17111 (to ZY)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
长链非编码RNA：是长度大于 200个核苷酸的非编码 RNA，种类、数量、功能都不明确。研究表明, 长链非编码RNA在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，成为遗传学研究热点。
肝癌高表达转录本：课题组在熟练掌握骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的基础上，通过RT-PCR技术检测了分化前后几种常见长链非编码RNA的表达，并且发现了肝癌高表达转录本在分化过程中表达量逐渐增多，因此提出假说：肝癌高表达转录本可能参与了分化过程。肝癌高表达转录本最初在人肝细胞肝癌中被众人熟知，在肝癌细胞中呈高度表达，后来在人胰腺癌、食管癌以及骨肉瘤等组织中也陆续检测到肝癌高表达转录本的异常表达。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞在体外可以被诱导分化为肝样细胞，但是细胞功能不成熟。研究表明，长链非编码RNA可以影响间充质干细胞的分化，但是关于长链非编码RNA肝癌高表达转录本是否能够参与骨髓间充质干细胞向肝细胞分化还未有报道。
目的：探讨长链非编码RNA肝癌高表达转录本在人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化中的作用。
方法：体外添加细胞因子诱导人骨髓间充质干细胞(购自上海中科院细胞库)向肝样细胞分化，诱导4周后倒置显微镜观察细胞的形态学变化，免疫荧光技术检测肝细胞特异性蛋白的表达，qRT-PCR检测分化过程中肝癌高表达转录本的表达；然后通过慢病毒转染构建稳定表达肝癌高表达转录本的人骨髓间充质干细胞株，以转染阴性对照病毒作为对照组，两组同时添加细胞因子进行肝向细胞诱导分化，qRT-PCR、Western blot检测过表达组与对照组肝细胞特异性基因、蛋白表达的差异。
结果与结论：①人骨髓间充质干细胞在体外添加细胞因子下可以成功被诱导分化为肝样细胞，在分化过程中肝癌高表达转录本的表达逐渐增高；②过表达肝癌高表达转录本后促进了人骨髓间充质干细胞诱导分化后肝细胞特异性基因及蛋白的表达；③结果表明，肝癌高表达转录本在人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化中发挥着至关重要的作用，将为细胞治疗肝脏疾病奠定坚实的理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-5386-3147(李梦)

关键词: 长链非编码RNA, 肝癌高表达转录本, 骨髓间充质干细胞, 肝细胞, 细胞分化, 肝细胞特异性基因

Abstract:

BACKGROUND: Human bone marrow mesenchymal stem cells can be induced to differentiate into hapatocytes without mature function. Long-chain non-coding RNA (lncRNA) plays an important part in the differentiation of mesenchymal stem cells. To date, there is still no report on whether the lncRNA highly up-regulated in liver cancer (HULC) is involved in the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytes.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism of lncRNA HULC in the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells.
METHODS: Human bone marrow mesenchymal stem cells were purchased from the Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China and were cultured in the hepatic differentiation medium containing cytokines in vitro. After 4 weeks of induction, cell morphology was observed under inverted microscope. Hepatocyte specific proteins were analyzed by immunofluorescence. The expression of IncRNA HULC was examined by qRT-PCR. Bone marrow mesenchymal cell lines stably expressing IncRNA HULC were then produced through lentiviral transfection. Bone marrow mesenchymal stem cells transfected with negative lentivirus were used as controls. Two groups of cells were concurrently induced with the hepatic differentiation medium containing cytokines. The expressions of hepatocyte specific genes and proteins were detected and compared between the two groups by qRT-PCR and western blot, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Human bone marrow mesenchymal stem cells could be successfully induced into hepatocytes in vitro through the addition of cytokines. The expression of IncRNA HULC was gradually increased during the differentiation. Overexpression of IncRNA HULC caused a marked increase in the expression of hepatocyte specific genes and proteins. To conclude, IncRNA HULC plays an important role in the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytes. It will provide a theoretical basis for the application of cell therapy in liver diseases.

Key words: long-chain non-coding RNA, highly up-regulated in liver cancer, bone marrow mesenchymal stem cells, hepatocytes, cell differentiation, hepatocyte specific genes

中图分类号:

李梦，周云，禹亚彬，王超群，巩玉森. 长链非编码RNA肝癌高表达转录本促进人骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(29): 4656-4661.

Li Meng, Zhou Yun, Yu Yabin, Wang Chaoqun, Gong Yusen . Long-chain non-coding RNA highly up-regulated in liver cancer promotes the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytes [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(29): 4656-4661.

图/表（结果） 1

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引言

肝脏是人体最大的消化器官，在解毒、代谢及蛋白合成等方面发挥着至关重要的作用^[1-2]。目前世界范围内成千上万的患者面临着终末期肝病的威胁，肝移植是治疗终末期肝病的唯一有效手段。但是诸如供者缺乏、价格昂贵、长时间服用免疫抑制剂等问题严重限制了肝移植的临床应用^[3-5]。干细胞技术的飞速发展使其成为良好的细胞治疗来源，可以作为肝病治疗的替代手段。间充质干细胞是一类多能干细胞，可来源于骨髓、脂肪组织、胎盘、脐带、外周血、肝脏以及其他组织，具有免疫原性低、扩增速度快、分化能力强等优点^[6-8]。骨髓间充质干细胞作为间充质干细胞家族的一员，具有向肝细胞分化的能力^[9-11]，但是具体机制不明。近年来长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA，LncRNA)被报道参与了间充质干细胞分化^[12-18]，但是尚无研究关注其在骨髓间充质干细胞向肝细胞分化中的作用。

肝癌高表达转录本(highly up-regulated in liver cancer，HULC)是长链非编码RNA的一种，位于染色体6p24.3上，在灵长类动物中高度保守^[19]。肝癌高表达转录本的转录产物长500个核苷酸，是拼接和聚腺苷酸化的非编码RNA，其定位于细胞质^[20]，被发现在多种恶性肿瘤中表达上调。目前关于肝癌高表达转录本在干细胞分化中的作用还未有报道。该研究探讨长链非编码RNA肝癌高表达转录本在人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化中的作用，为进一步应用于细胞治疗肝脏疾病奠定坚实的理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年2至10月在徐州医科大学病理学与病理生理学实验室完成。

1.3 材料 人骨髓间充质干细胞(上海中科院细胞库)；L-DMEM培养基、IMDM培养基及胎牛血清(美国Gibco公司)；酸性成纤维生长因子和肝细胞生长因子(美国Peprotech公司)；慢病毒肝癌高表达转录本(上海吉码公司)；qRT-PCR相关试剂(日本Takara公司)；引物(上海捷瑞生物工程公司)；一抗ALB、CYP3A4、G6P、AFP及二抗(美国Santa Cruze公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人骨髓间充质干细胞的扩增培养及向肝样细胞分化 第4代人骨髓间充质干细胞接种于培养瓶中，细胞浓度为1×10⁸ L^-1，培养瓶内为含体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM培养基，置于含体积分数为5%CO₂、37 ℃培养箱中，次日换液，待细胞达70%-80%汇合度时用胰酶消化，收集细胞后均匀种植于6孔板中，细胞浓度为1×10⁸ L^-1，当细胞达60%-70%汇合度时进行诱导分化，去除原培养基，PBS洗涤2遍后更换为含20 mg/L酸性成纤维生长因子和20 μg/L肝细胞生长因子的IMDM培养基继续培养，每3 d换液1次。对照组仍在L-DMEM培养基中培养。

11.4.2 免疫荧光染色 诱导分化4周，收集细胞后滴加在盖玻片上继续培养，次日用PBS洗2次，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，加入0.1%Triton X-100破膜 20 min，然后加入小鼠抗人ALB、CYP3A4、G6P一抗于4 ℃过夜，次日加入二抗Dylight594山羊抗小鼠IgG孵育 2 h，DAPI复染细胞核，荧光共聚焦显微镜观察。

1.4.3 qRT-PCR实验检测肝癌高表达转录本的表达 诱导分化0-6周，收集细胞后采用Trizol方法提取总RNA，根据Takara反转录说明书将RNA反转录为cDNA，应用ABI7900系统进行PCR扩增，95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s， 60 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，共40个循环。引物序列见表1。基因表达的相对倍数变化通过2^-^??Ct方法进行评估。

1.4.4 慢病毒转染 取对数生长期骨髓间充质干细胞，胰酶消化后收集细胞并均匀种在6孔板中，细胞浓度为1×10⁸ L^-1，加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基，在含体积分数为5% CO₂、37 ℃的培养箱中培养，待细胞达到50%-60%汇合时去除原培养基，PBS洗涤2次，每孔加入2 mL不含胎牛血清的L-DMEM培养基以及4 μL 1×10⁸ TU/mL的肝癌高表达转录本慢病毒，同时加入聚凝胺，使得终质量浓度达到5 mg/L，转染24 h换液，之后每隔2 d换液1次，转染后使用嘌呤霉素筛选至少7 d，挑选单克隆细胞进行扩增，最终得到稳定转染的细胞株。对照组细胞转染阴性对照LV5-NC病毒。获得稳转骨髓间充质干细胞株后按照前述添加细胞因子诱导分化步骤进行肝向诱导分化。

1.4.5 qRT-PCR实验检测ALB、CYP3A4、G6P、AFP的mRNA表达 诱导分化4周，收集细胞后采用Trizol方法提取总RNA，根据Takara反转录说明书将RNA反转录为cDNA，应用ABI7900系统进行PCR扩增，95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s， 60 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，共40个循环。引物序列见表1。基因表达的相对倍数变化通过2^-^??Ct方法进行评估。

1.4.6 Western blot实验检测ALB、CYP3A4、G6P、AFP的蛋白表达 诱导分化4周，收集细胞，PBS洗涤2次，加入RIPA裂解液，总体积为100 μL，然后加入5×Loading Buffer 20 μL，充分混合后在95 ℃煮沸5 min，于-20 ℃保存。蛋白浓度测定参照南京凯基蛋白浓度测定试剂盒进行。实验时，取30 μg煮沸变性的蛋白样品加入预先制好的SDS-PAGE胶的加样孔中，经过电泳后，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗后4 ℃摇床过夜，TBST洗3次加入二抗孵育2 h，TBST再次洗3次，ECL显影、曝光，用Image J软件进行灰度分析，计算蛋白相对表达量。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化过程中肝癌高表达转录本的表达；②过表达肝癌高表达转录本对骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的影响。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0分析数据，计量资料采用x(_)±s表示，两组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

在体外添加合适的细胞因子诱导下，骨髓间充质干细胞可以向肝样细胞分化，但是此诱导方法缺点在于诱导周期长、效率低、肝细胞功能低下，不能满足临床上需要^[21]，因此迫切地需要寻求一种高效的诱导分化方法。

长链非编码RNA是非编码RNA中的一员，长度大于200个核苷酸。最近研究表明，长链非编码RNA在细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等过程中均扮演着重要的角色^[22-23]。研究表明长链非编码RNA影响了间充质干细胞的分化，例如HOTAIR通过衰老相关DNA的甲基化来影响间充质干细胞的分化^[24]，NONHSAT009968通过促进葡萄球菌蛋白A的表达抑制了间充质干细胞向骨细胞分化^[25]，长链非编码RNA H19通过表观遗传学调控抑制了骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化^[13]。但是目前关于长链非编码RNA在骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中的作用还未有报道。课题组在熟练掌握骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的基础上，通过RT-PCR技术检测了分化前后几种常见长链非编码RNA的表达，并且发现了肝癌高表达转录本在分化过程中表达量逐渐增多，因此提出假说：肝癌高表达转录本可能参与了分化过程。肝癌高表达转录本最初在人肝细胞肝癌中被众人熟知，在肝癌细胞中呈高度表达^[26-32]，后来在人胰腺癌、食管癌以及骨肉瘤等组织中也陆续检测到肝癌高表达转录本的异常表达^[33-40]。目前关于肝癌高表达转录本参与骨髓间充质干细胞的分化还未有报道。

该研究通过慢病毒转染后获取稳定表达肝癌高表达转录本的人骨髓间充质干细胞株，进而在体外采用同样的诱导方案进行分化培养。过表达肝癌高表达转录本的人骨髓间充质干细胞株同样可以被诱导分化为肝样细胞。采用qRT-PCR技术比较过表达组与对照组分化后肝细胞特异性基因的表达。结果发现，过表达组与对照组相比，肝细胞特异性基因ALB，CYP3A4以及G6P的水平明显增高，提示了过表达组更具有肝细胞特征。AFP亦是反映肝细胞成熟度的重要标志，例如肝癌分化程度低，AFP表达异常增高。过表达组AFP水平表达明显降低，再次证实了过表达组分化后细胞成熟度更高。在蛋白层面上，Western blot结果显示过表达组肝细胞特异性蛋白ALB，CYP3A4以及G6P的水平也高于对照组，而AFP亦低于对照组，此结果与qRT-PCR结果一致。以上结果提示了过表达肝癌高表达转录本人骨髓间充质干细胞分化后具有更高的肝细胞成熟度、功能更强，肝癌高表达转录本促进了骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化。当然，课题组还将进一步通过敲低肝癌高表达转录本的表达来观察其对肝细胞分化的影响。另外，肝癌高表达转录本是在转录前、转录还是转录后水平影响细胞分化也有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

长链非编码RNA肝癌高表达转录本促进人骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化

Long-chain non-coding RNA highly up-regulated in liver cancer promotes the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytes

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