维甲酸诱导骨质疏松模型大鼠骨髓间充质干细胞的特征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1703

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (17): 2637-2643.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1703

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维甲酸诱导骨质疏松模型大鼠骨髓间充质干细胞的特征

龙燕鸣^1，2，谢梦生^1，2，薛文利¹，黄加洁^1，2，李晓捷¹

¹广西医科大学附属口腔医院修复科，广西壮族自治区南宁市 530021；²广西口腔颌面修复与重建研究自治区级重点实验室，广西颅颌面畸形临床医学研究中心，颌面外科疾病诊治研究重点实验室(广西高校重点实验室)，广西壮族自治区南宁市 530021

修回日期:2019-01-15 出版日期:2019-06-18 发布日期:2019-06-18
通讯作者: 李晓捷，副教授，硕士生导师，广西医科大学附属口腔医院修复科，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:龙燕鸣，女，1991年生，广西壮族自治区梧州市人，汉族，广西医科大学在读硕士，主要从事口腔修复方面的研究。
基金资助:
广西自然科学基金(2013GXNSFBA019162)，项目负责人：李晓捷；广西高校中青年教师基础能力提升项目(2017KY0092)，项目负责人：李晓捷

Characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells in a rat model of retinoic acid-induced osteoporosis

Long Yanming^{1, 2}, Xie Mengsheng^{1, 2}, Xue Wenli¹, Huang Jiajie^{1, 2}, Li Xiaojie¹

¹Department of Prosthodontics, Affiliated Hospital of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; ²Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction, Guangxi Clinical Research Center for Craniofacial Deformity, Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Surgery Disease Treatment, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Revised:2019-01-15 Online:2019-06-18 Published:2019-06-18
Contact: Li Xiaojie, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Prosthodontics, Affiliated Hospital of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Long Yanming, Master candidate, Department of Prosthodontics, Affiliated Hospital of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction, Guangxi Clinical Research Center for Craniofacial Deformity, Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Surgery Disease Treatment, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2013GXNSFBA019162 (to LXJ); the Basic Ability Improving Project of Young Teachers in Guangxi Universities, No. 2017KY0092 (to LXJ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨质疏松大鼠模型：骨质疏松研究需构建骨质疏松模型，目前常用的大鼠骨质疏松模型构建方式有5种：去势模型、维甲酸干预模型、糖皮质激素干预模型、失用模型以及营养不良模型；该实验采用的是维甲酸干预法构建大鼠骨质疏松模型，具有操作简单、造模时间短、骨质疏松典型等优点。
维甲酸：是一种维生素A的衍生物，主要用于皮肤科疾病和肿瘤等疾病的治疗，但是研究发现，维甲酸对骨代谢产生明显的影响。通常在使用维甲酸治疗过程中伴有骨质疏松。该实验中，维甲酸诱导的骨质疏松模型大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力减弱，成脂能力增强，其病理性分化与骨质疏松患者以及去卵巢骨质疏松大鼠来源骨髓间充质干细胞相似，说明其适合研究骨质疏松。

摘要
背景：应用维甲酸直接体外干预骨髓间充质干细胞的研究较多，而维甲酸诱导骨质疏松模型大鼠骨髓间充质干细胞的相关研究尚未见报道。
目的：建立维甲酸诱导的大鼠骨质疏松模型，观察模型大鼠骨髓间充质干细胞的体外特征。
方法：将SD大鼠随机分为2组，实验组用维甲酸70 mg/(kg•d)连续灌胃2周快速建立骨质疏松模型，对照组灌胃等体积生理盐水。采用全骨髓贴壁法体外培养两组大鼠骨髓间充质干细胞，观察两组细胞体外特征，包括细胞形态、生长曲线、成骨诱导后体外矿化能力和碱性磷酸酶分泌能力、成脂诱导后向脂肪细胞分化能力。
结果与结论：①两组骨髓间充质干细胞各时期形态基本一致，第9天时实验组增殖能力强于对照组；②实验组碱性磷酸酶活力弱于对照组(P < 0.05)，茜素红染色、碱性磷酸酶染色亦支持碱性磷酸酶活力检测结果；③实验组脂滴数量和油红O吸光度值高于对照组(P < 0.05)；④结果表明，维甲酸灌胃法成功构建大鼠骨质疏松模型，其骨髓间充质干细胞成骨能力降低，成脂能力增强。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9756-2787(龙燕鸣)

关键词: 维甲酸, 骨质疏松模型, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化, 成脂分化, 大鼠, 广西自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Retinoic acid has been directly used to intervene with bone marrow mesenchymal stem cells in vitro; however, there is still a lack of research on in vitro characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells in an osteoporosis rat model induced by retinoic acid.
OBJECTIVE: To establish the osteoporosis rat model induced by retinoic acid and to observe the characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells from the rat model in vitro.
METHODS: Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups. The experimental group was treated with retinoic acid, 70 mg/kg per day for 2 weeks, in order to quickly establish osteoporosis models, while the control group was given an equal volume of normal saline. Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured using the whole bone marrow culture method in vitro and their characteristics (cell morphology, growth curve and surface antigens) were observed. After osteogenic induction, the in vitro mineralization capacity and alkaline phosphatase secretion capacity of the cells were measured. After adipogenic induction, the adipogenic ability of cells was detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Morphology of bone marrow mesenchymal stem cells was basically the same in the two groups. The proliferation capacity of the cells in the experimental group was higher than that in the control group at 9 days after culture. (2) After osteogenic induction, the alkaline phosphatase activity in the experimental group was lower than that in the control group (P < 0.05), which was consistent with the results of alizarin red staining and alkaline phosphatase staining. (3) After adipogenic induction, larger number of lipid droplets and higher absorbance value for oil red O could be observed in the experimental group than the control group (P < 0.05). To conclude, bone marrow mesenchymal stem cells from the osteoporosis rat model induced by retinoic acid have lower osteogenic capacity but higher adipogenic capacity than the normal cells.

Key words: retinoic acid, osteoporosis model, bone marrow mesenchymal stem cells, osteogenic differentiation, adipogenic differentiation, rat, Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region

中图分类号:

龙燕鸣，谢梦生，薛文利，黄加洁，李晓捷. 维甲酸诱导骨质疏松模型大鼠骨髓间充质干细胞的特征[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(17): 2637-2643.

Long Yanming, Xie Mengsheng, Xue Wenli, Huang Jiajie, Li Xiaojie. Characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells in a rat model of retinoic acid-induced osteoporosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(17): 2637-2643.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 参加实验的20只雌性SD大鼠，实验组10只，对照组10只，进入结果分析的数量仍为20只，两组大鼠均无脱落。

2.2 大鼠体质量变化 实验组灌胃第2天后出现体质量下降，对照组大鼠体质量稳定上升，灌胃14 d时，实验组大鼠体质量明显低于对照组(P < 0.05)，差异有显著性意义，见图1。

2.3 大鼠骨密度值变化 大鼠灌胃2周后测量实验组和对照组全身骨密度值，实验组的骨密度值低于对照组(P < 0.05)，差异有显著性意义，见图2。

2.4 苏木精-伊红染色结果 实验组大鼠股骨干骺端骨小梁纤细，骨髓腔增宽，骨小梁分离度大，见图3A；对照组骨小梁粗大，结构清晰完整，排列规则而较致密，交织成网状，见图3B；从苏木精-伊红染色结果得出实验组骨量明显少于对照组。

2.5 骨髓间充质干细胞形态 实验组和对照组骨髓间充质干细胞原代培养第5天，镜下观察细胞多呈星形、多角形，细胞集落样生长，见图4A，B；传3代骨髓间充质干细胞姬姆萨染色显示实验组细胞以短梭形为主，排列成漩涡状和放射状，见图4C；对照组姬姆萨染色结果显示细胞形态与实验组基本一致，见图4D。

2.6 生长曲线 两组骨髓间充质干细胞都呈S形生长，1-3 d处于潜伏期，3-7 d为快速生长期，前7 d两组细胞生长速度无明显差异，第7天后对照组细胞逐渐进入平台期，实验组细胞继续生长，第9天实验组细胞数量明显大于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.7 细胞表面抗原表达 实验组和对照组骨髓间充质干细胞均一表达CD90、CD44，表达率均在85%以上，阴性表达CD34，表达率不足1%，见图6。

2.8 茜素红染色结果 骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后，细胞呈铺石路样生长，可见钙盐沉积形成钙结节，茜素红染色后钙结节呈橘红色；实验组钙结节体积小，见图7A；对照组钙结节体积大，染色深，见图7B。

2.9 碱性磷酸酶染色结果 骨髓间充质干细胞成骨诱导14 d，碱性磷酸酶染色可见胞膜和胞浆颗粒染色呈蓝黑色，实验组块状深染颗粒较少，见图8A，对照组块状深染颗粒较多，染色深，见图8B。

2.10 碱性磷酸酶活力 骨髓间充质干细胞成骨诱导7 d和14 d检测碱性磷酸酶活力，第7天实验组和对照组细胞碱性磷酸酶活力无明显差异；第14天实验组碱性磷酸酶活力低于对照组(P < 0.05)，差异有显著性意义，见图9。

2.11 油红O染色结果 骨髓间充质干细胞成脂诱导28 d后，经油红O染色，脂滴被染成鲜红色，细胞核蓝色深染，实验组脂肪细胞数量多，合并成串珠状，见图10A；对照组脂肪细胞散在，数量少，见图10B；实验组油红O吸光度值高于对照组(P < 0.05)，差异有显著性意义，见图11。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外特征观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年7月至2018年7月在广西医科大学附属口腔医院科研实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 20只清洁级雌性SD大鼠，SPF级，3月龄，体质量(289±33) g，由广西医科大学医学实验动物中心提供。

1.3.2 实验用主要试剂和仪器 维甲酸(陕西森弗生物技术有限公司，纯度99.12%，批号081210)；胎牛血清、低糖型DMEM/F12(维森特，加拿大)；CD90、CD44、CD34(ebioscience，美国)；BDAccuri C5型流式细胞仪(BD，美国)；Prodigy型骨密度仪(GE，美国)；iMark型自动酶标仪(BIO-RAD，美国)；BX53型正置显微镜(OLYMPUS，日本)；BCA试剂盒(杭州弗德生物科技有限公司)；碱性磷酸酶测定试剂盒(微板法)(南京建成科技有限公司)；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；茜素红S染色液、饱和油红O染色液、吲哚美辛和胰岛素(北京索莱宝科技有限公司)；地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠(Sigma，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨质疏松症造模 将20只雌性SD大鼠随机分为2组(n=10)：实验组用维甲酸70 mg/(kg•d)连续灌胃2周，对照组灌胃等体积生理盐水，隔天记录两组大鼠的体质量，2周后使用骨密度仪检测两组大鼠的平均骨密度值。

1.4.2 苏木精-伊红染色 造模后两组各取6只大鼠，麻醉后处死，分离双侧股骨近骺端骨组织，去除周围软组织，EDTA脱钙1个月，以探针刺入为脱钙终点，流水冲洗过夜，脱水，石蜡包埋，切片，进行常规苏木精-伊红染色，显微镜下观察并拍照。

1.4.3 骨髓间充质干细胞分离培养及细胞形态学观察 采用全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞。两组各取1只大鼠麻醉后处死，体积分数为75%乙醇浸泡10 min，分离四肢，无菌条件下用DMEM/F12冲出骨髓，过滤，离心，重悬，用含体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养，72 h进行全量换液，传代后换成含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养。取生长良好的传3代细胞以1×10⁵细胞密度种于6孔板，待细胞长至60%后进行吉姆萨染色，显微镜下拍照观察。

1.4.4 生长曲线 取生长良好的两组传3代骨髓间充质干细胞，消化离心，以4×10⁴细胞密度接种于6孔板，于1，3，5，7，9 d各取3个副孔，500 μL 0.25%胰酶-EDTA消化2 min，加入终止液，用细胞计数板进行计数，取平均值，以时间为横轴，细胞数值为纵轴绘制生长曲线。

1.4.5 流式细胞仪检测细胞表面抗原 取生长良好的两组传3代骨髓间充质干细胞，消化离心，PBS清洗2次，计数，每管分别加入CD90-PE抗体、CD44-PE抗体、CD34-PE抗体，同时设立同型对照组，避光冰上孵育30 min，PBS(含1%BSA)清洗2次后再重悬，流式细胞仪检测分析。

1.4.6 茜素红染色 取生长良好的两组传3代骨髓间充质干细胞，以1×10⁵细胞密度接种于6孔板，各设置3个副孔，待细胞长至80%时，将培养液换为成骨诱导液(100 nmol/L地塞米松，50 μmol/L抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸钠)，隔天换液，诱导21 d后进行茜素红染色，PBS清洗3次，多聚甲醛固定30 min，PBS清洗，加入1 mL茜素红染色液染30 min，PBS清洗3次，显微镜下观察并拍照。

1.4.7 碱性磷酸酶染色 取生长良好的两组传3代骨髓间充质干细胞，以1×10⁵细胞密度接种于6孔板，待细胞长至80%时，换为成骨诱导液，于诱导14 d时各取3个副孔进行碱性磷酸酶染色，PBS清洗3次，多聚甲醛固定30 min，PBS清洗，每孔加入1 mL染色工作液(按照试剂盒配置染色工作液)，室温避光孵育30 min，直至显色至预期深浅，去除染色工作液，用蒸馏水洗涤2次终止显色反应，显微镜下观察并拍照。

1.4.8 碱性磷酸酶活力检测 取生长良好的两组传3代骨髓间充质干细胞，以1×10⁵细胞密度接种于6孔板，待细胞长至80%时，换为成骨诱导液，分别于诱导7 d和14 d时各取3个副孔进行蛋白提取，采用BCA法得到两组细胞的蛋白浓度(根据BCA试剂盒操作)，最后根据碱性磷酸酶测定试剂盒操作步骤进行碱性磷酸酶活力检测。

1.4.9 油红O染色 取生长良好的两组传3代骨髓间充质干细胞，以1×10⁵细胞密度接种于6孔板，各设置3个副孔，待细胞长至80%时，将培养液换为成脂诱导液(1 μmol/L地塞米松，10 mg/L胰岛素，0.2 mmol/L吲哚美辛，0.5 mol/L IBMX)，隔天换液，诱导28 d后进行油红O染色，显微镜下观察并拍照；然后进行半定量分析：每孔加入700 μL异丙醇溶解油红O染料，室温静置5 min，每孔吸出600 μL，各加入200 μL至96孔板的3个孔中，酶标仪检测吸光度值。

1.5 主要观察指标 骨质疏松组和对照组骨髓间充质干细胞的体外特征，包括细胞形态、生长曲线、细胞成骨诱导后体外矿化能力差异和碱性磷酸酶分泌能力差异、细胞成脂诱导后向脂肪细胞分化能力差异。

1.6 统计学分析 使用SPSS 17.0统计软件处理各组数据，其中骨密度值、油红O吸光度值和碱性磷酸酶活性值用x(_)±s表示。采用两样本t 检验进行组间比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

根据张雅蓉等^[12]总结，构建骨质疏松模型的方法有5种：去势模型、维甲酸干预模型、糖皮质激素干预模型、废用模型以及营养不良模型。经典的去势大鼠骨质疏松模型，通过切除双侧卵巢，引起雌激素水平下降，从而影响骨代谢，但造模时间长，需要3个月才能得到稳定的骨质疏松模型，且手术造模是创伤性操作，会引起机体应激反应^[13-14]。维甲酸干预模型构建时间短，维甲酸处理2周即可出现明显的骨质疏松，优点是操作简单、造模时间短、骨质疏松典型等；缺点是模型可逆，停用维甲酸后骨质疏松状态可逐渐恢复^[15-16]。有学者认为维甲酸导致骨质疏松的作用机制是通过激活体内的维甲酸受体相关孤儿受体，进而影响骨代谢^[17]。目前，有学者研究了维甲酸诱导骨质疏松模型状态下成骨细胞的体外特征^[18]，但未见有研究维甲酸诱导的骨质疏松模型状态下骨髓间充质干细胞的体外特征。该实验研究了维甲酸诱导大鼠骨质疏松模型骨髓间充质干细胞的体外特征，结果发现其体外特征与人类骨质疏松和去势大鼠骨质疏松模型骨髓间充质干细胞相似^[19-20]，证明该模型可用于骨质疏松相关研究。

实验选择维甲酸干预构建骨质疏松模型，衡量一种骨质疏松模型成功与否，需要评价骨密度、生物化学、骨形态学和生物力学4个方面指标；骨密度和骨形态学是两项主要的评价指标^[21-24]。维甲酸干预3周后利用双能X射线骨密度仪测量实验组和对照组大鼠全身骨密度值，结果显示实验组大鼠骨密度明显降低。股骨干骺端苏木精-伊红染色观察骨形态学指标，同样得出实验组骨量明显少于对照组，说明模型构建成功，并且在停药后1个月仍存在差异，甚至更大(数据未显示)。维甲酸干预构建的骨质疏松模型，皮质骨和松质骨都表现出不同程度的骨量丢失，但松质骨的骨量丢失更明显和持久^[15]，这就解释了实验组和对照组的骨形态学指标主要表现为骨小梁的变化，与贾婷婷等^[25]实验结果相似。在维甲酸干预骨质疏松造模期间，实验组体质量呈下降趋势，其可能原因为维甲酸药物反应导致厌食而引起的体质量下降^[21]。

骨质疏松微环境可能影响骨髓间充质干细胞的增殖，该研究发现，第9天时实验组骨髓间充质干细胞数量明显大于对照组，这说明实验组骨髓间充质干细胞增殖能力有可能强于对照组，与Liu等^[19]结果相似；另有研究发现人骨髓间充质干细胞以及骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞增殖能力与正常组比较是降低的，其具体机制还不十分清楚^[26-27]。因此，对于影响骨质疏松模型大鼠骨髓间充质干细胞增殖的具体机制需要进一步研究。

骨质疏松患者骨髓中成骨细胞减少，脂肪细胞增多，两种细胞存在此消彼长的关系，因此骨质疏松患者骨量减少与脂肪组织含量增加有密切关系^[28]。有研究指出，骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨能力降低的同时伴随着成脂相关基因水平的上升，这可能与骨质疏松的发生有关^[20]。研究发现去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力较对照组减弱，成脂能力增强，与人骨质疏松骨髓间充质干细胞特性相同^[19]。骨髓间充质干细胞的成骨能力与细胞矿化和分泌碱性磷酸酶有关，而碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期标志^[29-30]。在该实验中，采用维甲酸诱导的骨质疏松模型，其细胞矿化能力减弱，胞膜和胞浆颗粒碱性磷酸酶染色较对照组浅，并且碱性磷酸酶活力下降，说明其成骨能力下降；油红O染色及油红O半定量检测结果显示实验组成脂能力明显强于对照组，这与Liu等^[19]研究结果相似。维甲酸诱导的骨质疏松模型大鼠骨髓间充质干细胞成骨能力减弱，成脂能力增强，其病理性分化与骨质疏松患者以及去卵巢骨质疏松大鼠来源骨髓间充质干细胞相似^[19-20]，说明其适合研究骨质疏松，但其病理学机制需进一步研究。

目前未见有维甲酸诱导的骨质疏松模型大鼠骨髓间充质干细胞的相关研究，但应用维甲酸直接体外干预骨髓间充质干细胞却多有报道，Wang等^[31]研究发现维甲酸抑制了骨髓间充质干细胞的成骨分化并促进了脂肪细胞的形成，与作者实验结果一致，何倩婷等^[32]亦得到相同的结论。维甲酸对骨髓间充质干细胞成骨分化和成脂分化的影响也有相反的报道，黄帆等^[33]发现维甲酸能增强骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化，其机制可能与促进Smad信号传导活性有关。维甲酸体外处理骨髓间充质干细胞，被证实能抑制向脂肪细胞分化^[34-35]。该实验首次研究维甲酸诱导的骨质疏松模型大鼠骨髓间充质干细胞的体外特征，其成骨分化和成脂分化的相关分子机制有待进一步研究。

综上所述，实验采用维甲酸干预构建大鼠骨质疏松模型，通过骨密度值检测和股骨干骺端苏木精-伊红染色，表明大鼠骨质疏松模型构建成功；体外培养实验组和对照组骨髓间充质干细胞，对两组细胞进行细胞形态学观察和生长曲线绘制，发现两组细胞各时期形态无明显差异，实验组骨髓间充质干细胞增殖能力强于对照组，另外检测两组骨髓间充质干细胞的成骨和成脂能力，结果发现实验组骨髓间充质干细胞成骨能力弱于对照组，成脂能力增强。该实验初步了解了维甲酸诱导的骨质疏松模型大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特点，为干细胞应用于基因治疗骨质疏松骨缺损提供实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

维甲酸诱导骨质疏松模型大鼠骨髓间充质干细胞的特征

Characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells in a rat model of retinoic acid-induced osteoporosis

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