去除脂肪型脂肪酸结合蛋白4阳性干细胞可影响肺部无纤毛(clara)细胞的增殖与自我更新

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1702

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (17): 2734-2738.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1702

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去除脂肪型脂肪酸结合蛋白4阳性干细胞可影响肺部无纤毛(clara)细胞的增殖与自我更新

杨瑞晨，刘述越，刘慧娟

上海交通大学Bio-X研究院，上海市 200240

修回日期:2019-01-15 出版日期:2019-06-18 发布日期:2019-06-18
通讯作者: 刘慧娟，博士，副研究员，上海交通大学Bio-X研究院，上海市 200240
作者简介:杨瑞晨，女，1994年生，汉族，山东省济宁市人，在读硕士，主要从事间充质干细胞的增殖、分化与衰老研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(91749201)，项目参与人：杨瑞晨

Removal of fatty acid-binding protein 4 positive stem cells affects the proliferation and self-renewal capability of clara cells in the lung

Yang Ruichen, Liu Shuyue, Liu Huijuan

Bio-X Institutes, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

Revised:2019-01-15 Online:2019-06-18 Published:2019-06-18
Contact: Liu Huijuan, PhD, Associate researcher, Bio-X Institutes, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
About author:Yang Ruichen, Master candidate, Bio-X Institutes, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 91749201 (to YRC)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脂肪型脂肪酸结合蛋白4(fatty acid-binding protein 4，FABP4)：脂肪型脂肪酸结合蛋白4是脂肪酸结合蛋白家族中研究比较多的一种亚型，主要参与细胞内脂质的代谢和信号转导，并且是细胞生长分化及炎性反应的关键递质。
Clara细胞：是一种无纤毛上皮细胞，主要分布于终末细支气管和呼吸性细支气管上皮。Clara细胞具有活跃的增殖分化特性，参与支气管上皮损伤的修复过程。Clara细胞分泌蛋白是clara细胞最主要的分泌产物，具有抗炎、抗纤维化的生物学特性。

摘要
背景：近年来关于脂肪型脂肪酸结合蛋白4(fatty acid-binding protein 4，FABP4)的研究已经很多，但肺中FABP4的表达情况与功能仍不明确。
目的：探究FABP4在肺中的表达情况和功能。
方法：利用FABP4 Cre; Rosa26-tdTomato小鼠示踪红色荧光蛋白表达以及免疫荧光染色共定位系统性地研究了FABP4在肺中的表达情况，并构建FABP4 Cre; iDTR转基因小鼠通过注射白喉毒素特异性去除肺部表达FABP4的细胞，初步探究FABP4在肺中的功能。
结果与结论：FABP4能标记成年小鼠肺部的巨噬细胞、无纤毛(clara)细胞、Ⅱ型肺泡细胞、PDGFRα和vimentin阳性间质细胞，但不能标记平滑肌细胞和纤毛(ciliated)细胞。另外，当去除肺部表达FABP4阳性细胞时会出现小鼠无纤毛(clara)细胞及纤毛(ciliated)细胞比例减少的表型，推测可能是去除了FABP4阳性干细胞特性细胞后影响了肺部无纤毛(clara)细胞的增殖与自我更新。该研究比较全面地揭示了FABP4在小鼠肺中的表达情况，并初步探究了FABP4在肺中的作用，为肺的免疫反应及稳态维持等相关研究奠定了一定的基础，并可能成为肺部疾病治疗的潜在靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-0981-0520(杨瑞晨)

关键词: 脂肪型脂肪酸结合蛋白4, FABP4, 肺, 巨噬细胞, 间质细胞, clara细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, there have been many studies about fatty acid-binding protein 4 (FABP4); however, few studies focus on the expression and function of FABP4 in the lung.
OBJECTIVE: To systematically explore the expression and function of FABP4 in the lung.
METHODS: FABP4 Cre; Rosa26-tdTomato mice were selected to trace red fluorescent protein expression and immunofluorescence co-localization analysis was used to systematically detect the expression of FABP4 in the lung. We made a further study on function of FABP4 in lung by constructing FABP4 Cre; iDTR transgenic mice injected with diphtheria toxin to remove the FABP4⁺ cells from the lung.
RESULTS AND CONCLUSION: FABP4 could label macrophages, clara cells, type II alveolar cells, PDGFRα⁺ and vimentin⁺ mesenchymal cells in the lung of adult mice, and could not label smooth muscle cells and ciliated cells. In addition, percentages of clara cells and ciliated cells decreased when the FABP4⁺ cells were removed from the lung. We supposed that removal of FABP4⁺ cells with stem cell characteristics could influence the proliferation and self-renewal of clara cells in the lung. This study comprehensively revealed the expression pattern of FABP4 in lung of mice and preliminarily explored the FABP4 function in the lung, laying a foundation for the study of pulmonary immune response and homeostasis maintenance. Moreover, FABP4 may become a potential target for the treatment of lung diseases.

Key words: fatty acid binding protein 4, FABP4, lung, macrophage, interstitial cells, clara cells, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

杨瑞晨，刘述越，刘慧娟. 去除脂肪型脂肪酸结合蛋白4阳性干细胞可影响肺部无纤毛(clara)细胞的增殖与自我更新[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(17): 2734-2738.

Yang Ruichen, Liu Shuyue, Liu Huijuan. Removal of fatty acid-binding protein 4 positive stem cells affects the proliferation and self-renewal capability of clara cells in the lung[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(17): 2734-2738.

图/表（结果） 1

2.1 FABP4在成年小鼠肺中示踪 使用成年FABP4 Cre; Rosa26-tdTomato小鼠，通过红色荧光蛋白来示踪FABP4在肺中的表达。结果显示，FABP4在小鼠肺泡区域可见红色荧光的表达，见图1A；在终末支气管周围也有表达，见图1B，尤其在肺泡区域表达较多。根据Tomato阳性细胞表达的位置可以判断，FABP4标记了肺中几种不同类型的细胞，提示其在肺中可能扮演了重要的角色。

2.2 FABP4能标记Ⅱ型肺泡细胞和clara细胞等上皮细胞 实验研究了FABP4阳性细胞与肺中上皮细胞的共定位情况，图2中所示 PPC标记的Ⅱ型肺泡细胞在肺中分布比较均匀，排列在肺泡的边缘角落，细胞形态比较规则，FABP4阳性细胞与Ⅱ型肺泡细胞有部分共定位；同时检测了SCGB1A1标记的clara细胞与FABP4阳性细胞的共定位，观察到clara细胞特异性表达在支气管内部，排列整齐，FABP4只标记了一小部分clara细胞。作者推测肺支气管中的clara细胞来源于不同的谱系，而这群被标记的细胞与其他clara细胞不同。

2.3 FABP4能标记肺中间质细胞 实验使用了两种间质细胞标记物PDGFRα和Vimentin来显示肺中的间质细胞，两种来源的间质细胞在肺中分布存在一些差异，其中PDGFRα阳性细胞分布在终末支气管和血管的周围，主要呈细丝状，Vimentin作为一个骨架蛋白在肺中呈现弥散性广泛分布。免疫荧光结果显示与Vimentin阳性间质细胞共标的FABP4阳性细胞比与PDGFRα阳性间质细胞共标的更多，见图3。

2.4 FABP4能标记肺中的巨噬细胞 F4/80可以特异性标记巨噬细胞，图4显示肺巨噬细胞主要分布于肺泡与肺间质中，偶见少量在支气管中游离存在。FABP4可以标记部分肺巨噬细胞，推测FABP4可能参与肺部的免疫应激反应。

2.5 FABP4不能标记肺平滑肌细胞和ciliated细胞 经过与α-SMA和Tubulin免疫荧光染色分析发现，平滑肌表达在血管周围，呈现连续分布，在支气管周围也有间断存在的平滑肌层，但FABP4在这群细胞中无表达，见图5。FABP4来源细胞也没有标记支气管的纤毛细胞，说明FABP4这类细胞在肺的发育过程中可能没有参与肺中平滑肌细胞与支气管中纤毛细胞的形成。

2.6 FABP4阳性细胞去除的分析 FABP4 Cre;iDTR小鼠注射白喉毒素去除FABP4阳性细胞后，利用免疫荧光染色观察肺中上皮细胞和间质细胞的改变，结果显示：Vimentin阳性间质细胞略有下降，支气管中clara细胞和ciliated细胞均有不同程度的减少，见图6A，B，其对照iDTR小鼠肺中clara细胞比例为(60.73±2.82)%，FABP4 Cre;iDTR小鼠clara细胞比例下降至(53.62±3.10)%，P < 0.01，见图6C；对照iDTR小鼠ciliated细胞比例为(34.86±2.89)%，FABP4 Cre;iDTR小鼠ciliated细胞比例下降至(25.38±3.57)%，P < 0.01，见图6D，说明FABP阳性的这群clara细胞在肺中扮演极其重要的角色，对肺中clara细胞的再生与分化产生了影响。

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引言

材料方法

1.1 设计 小鼠体内荧光报告基因示踪与细胞生物学实验。

1.2 时间及地点 2018年1至11月在上海交通大学Bio-X研究院骨骼干细胞信号转导实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 实验中所用FABP4 Cre和Rosa26- tdTomato小鼠均购于美国杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)，iDTR条件性敲除小鼠由Waisman实验室提供。所有实验小鼠均饲养在无特定病原体环境中，按常规方式饲养和繁殖。实验均使用8周龄雄鼠，体质量21-23 g，其中FABP4 Cre; tdTomato小鼠共5只，FABP4 Cre; iDTR小鼠(实验组)与iDTR小鼠(对照组)各4只。

1.3.2 实验仪器与设备 Leica RM2235石蜡切片机；Leica CM3050s冰冻切片机；Nikon ECLIPSE 80i正置荧光显微镜；Olympus正置扫描显微镜。

1.3.3 实验试剂 PPC、SCGB1A1、Vimentin、F4/80等抗体均购自Abcam公司；α-SMA、Acetylated α Tubulin等抗体购自Sigma公司；PDGFRα抗体购自R&D公司；Avertin麻醉剂购自Sigma公司；石蜡购自Thermo Scientific；OCT购自Leica公司；蔗糖、乙醇、二甲苯、多聚甲醛等购自国药。

1.4 实验方法

1.4.1 FABP4阳性细胞去除实验 FABP4 Cre; iDTR小鼠(实验组)与iDTR小鼠(对照组)成年后腹腔注射白喉毒素(6.7 μg/kg)，隔日注射，持续1个月后取材。

1.4.2 琼脂糖凝胶电泳 配制2%琼脂糖凝胶，吸取PCR产物于胶孔内上样，并加入5 μL DNA Marker Ⅰ，200 V恒压开始电泳，定时35 min。使用凝胶成像仪拍照，根据条带判断小鼠基因型。

1.4.3 小鼠取材及组织固定 实验中所有小鼠用Avertin麻醉剂(0.2 g/kg)腹腔注射，打开胸腔由心脏左心室灌注生理盐水，将肺组织分离后置于40 g/L多聚甲醛中，4 ℃过夜。

1.4.4 组织包埋及切片 肺组织经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡浸润后进行石蜡包埋，常规石蜡切片。肺组织经过蔗糖梯度脱水后进行OCT冰冻包埋，常规冰冻切片。

1.4.5 免疫荧光染色 组织切片用2%BSA封闭，室温孵育1 h，一抗4 ℃过夜，第二天二抗37 ℃孵育1 h，DAPI孵育后封固，显微镜下观察并拍照。检测肺Ⅱ型肺泡细胞标志物PPC^[5]、Clara细胞标记物SCGB1A1^[6]、间质细胞标记物Vimentin和PDGFRα^[7-8]、巨噬细胞标记物F4/80^[9]、平滑肌标记物α-SMA^[10]、Ciliated细胞标记物Acetylated α Tubulin(后简称为Tubulin)。

1.5 主要观察指标 ①小鼠肺中PPC、SCGB1A1、Vimentin、PDGFRα、F4/80、α-SMA、Tubulin的表达以及FABP4阳性细胞与各种细胞标记物的共定位情况；②FABP4 Cre; iDTR小鼠(实验组)与iDTR小鼠(对照组)肺中clara细胞和ciliated细胞的变化。

1.6 统计学分析 实验中所有数据均至少分析了3对以上小鼠，统计分析和绘图用Graphpad Prism7处理，实验数据用x(_)±s表示，每组之间的差异性分析采用t-test，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

FABPs在体内分布很广^[11]，主要参与调控细胞内脂类代谢、信号传导及细胞生长等多种生化反应过程^[12]。FABP4是FABPs家族中研究的最详细的一种亚型，研究证实FABP4能够参与细胞内信号转导和免疫防卫的调节^[13-14]，可能会成为治疗肿瘤、心血管疾病及糖脂代谢等的潜在靶点^[15]。

肺是人体中与外界环境接触的最大器官，在免疫防卫中也起重要的作用。巨噬细胞在器官免疫反应中扮演了重要角色^[16]，其中肺巨噬细胞在肺中广泛分布，有重要的防御功能^[5，17-18]。已有研究报道FABP4在脂肪细胞和巨噬细胞中高表达^[19]。研究中Rosa-26tdTomato小鼠在该基因前具有Loxp-stop-Loxp序列，在正常情况下不会表达，当构建FABP4 Cre; Rosa-26tdTomato小鼠后，FABP4启动子调控下的Cre重组酶会特异性识别两个Loxp位点并将终止序列切除^[20-21]，该小鼠即可以在FABP4表达的细胞中表达tomato红色荧光蛋白来示踪FABP4阳性细胞的位置。作者利用FABP4 Cre; Tomato小鼠发现FABP4阳性细胞中部分为巨噬细胞，与前人的研究结果一致，这说明FABP4阳性细胞部分表达了巨噬细胞的特性，FABP4可能是通过巨噬细胞参与了肺部免疫反应。有研究发现肺纤维化是一类死亡率高于癌症的严重肺疾病^[22]，而成纤维细胞和Vimentin阳性间质细胞正是纤维化的重要参与者^[23-24]，肺中间质细胞主要用Vimentin和PDGFRα标记^[25]。作者的研究发现FABP4阳性细胞标记了肺中大部分成纤维细胞和间质细胞，这说明FABP4在肺纤维化中可能也会起至关重要的作用。

肺中支气管是气体的通道，同时也承担着杂质外排的功能。Clara细胞是支气管中一种排列在肺细支气管黏膜上的上皮细胞，有研究表明其具有干细胞特性，还能够分泌有免疫调节和肿瘤抑制等多种生物学活性的分泌蛋白^[26-27]。研究发现肺末端支气管内约有5% clara细胞表达FABP4，推测clara细胞可能存在不同的亚群，FABP4标记了其中重要的一类。研究中Rosa-26iDTR小鼠在该基因前具有Loxp-stop-Loxp序列，iDTR基因在正常的情况下不会表达，当合笼得到FABP4 Cre; iDTR小鼠时，FABP4启动子调控下的Cre重组酶会特异性识别两个Loxp位点并将终止序列切除，iDTR称为诱导性白喉毒素受体，该小鼠即可以在FABP4表达的细胞中表达白喉毒素受体，当注射白喉毒素时其与白喉毒素受体结合^[28]，能够特异性去除FABP4表达的细胞^[29]。肺中clara细胞的比例应该是恒定的，为60%-70%^[30]。实验中特异性去除FABP4阳性细胞后，clara细胞比例比正常小鼠减少了约7%，并且在足够长的恢复时期内该比例没有回升，意味着受损的这部分clara细胞没有再生。这群FABP4阳性的clara细胞受到了损伤，说明影响了clara细胞的增殖能力。ciliated细胞的比例也应该是稳定不变的，保持在30%-40%，去除FABP4阳性细胞的小鼠支气管中ciliated细胞的比例也减少了约10%。因此当这类细胞去除后，clara细胞向纤毛细胞分化的能力也受到了影响。以上说明FABP4标记的肺中clara细胞可能是一类比较重要且干性较强的一类clara细胞。

综上所述，FABP4在肺中巨噬细胞、clara细胞、Ⅱ型肺泡细胞、间质细胞中均有表达，在肺中FABP4可能通过巨噬细胞和间质细胞参与器官免疫反应，并且可能影响clara细胞增殖与我更新。FABP4不仅参与细胞内脂肪酸生存与代谢、调解内分泌，还在维持肺内环境的稳态中做出了重要的贡献。该研究阐明了FABP4在肺中表达的特殊生物学意义，并且为肺内上皮细胞的自我更新、稳态维持以及免疫应激反应相关过程进一步深入探究奠定了理论基础，可能成为肺部纤维化相关疾病的治疗潜在的靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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Removal of fatty acid-binding protein 4 positive stem cells affects the proliferation and self-renewal capability of clara cells in the lung

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