骨髓间充质干细胞移植联用山胡椒叶提取物可改善脊髓损伤区域的炎症反应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1681

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
脊髓损伤后的炎症反应：炎症反应是脊髓损伤后继发性损伤的重要因素之一，许多种细胞因子的产生已经成为判定损伤程度的重要指标。采取各种措施防止或抑制炎症过程已经成为脊髓损伤治疗的一种手段。
肿瘤坏死因子α：被认为是炎症反应过程中的重要启动因子，在机体遭受损伤和炎症过程中具有重要的作用，同时在局部炎症放大中具有重要意义，脊髓损伤后肿瘤坏死因子α持续高表达且是最早升高的细胞因子，可上调其他细胞因子的产生，参与脊髓继发性损伤过程。

摘要
背景：研究显示，骨髓间充质干细胞积极早期治疗脊髓损伤具有很高的研究价值。由于山胡椒叶富含黄酮、皂甙等物质，具有清除自由基、抗脂质过氧化等作用。两者联用治疗脊髓损伤的研究尚属罕见。
目的：观察骨髓间充质干细胞移植联合山胡椒叶提取物治疗脊髓损伤的效果，并探索其机制。
方法：将52只成年SD大鼠随机分为假手术组(n=12)、脊髓损伤组(n=14)、单纯骨髓间充质干细胞组(n=13)及联合治疗组(n=13)。脊髓损伤组、单纯骨髓间充质干细胞组及联合治疗组以Allen’s打击法建立脊髓损伤模型，假手术组仅暴露脊髓，不进行Allen’s打击。造模后即刻单纯骨髓间充质干细胞组在距损伤脊髓中线0.5 mm处注射骨髓间充质干细胞1.5×10⁵个，联合治疗组在注射骨髓间充质干细胞基础上，灌胃5 mg/kg山胡椒叶提取物，1次/d，连续7 d。在造模后1，5，7 d，每组各取4只大鼠进行BBB评分、脊髓细胞凋亡计数，免疫组化法检测脊髓中肿瘤坏死因子α表达。
结果与结论：①与脊髓损伤组相比，单纯骨髓间充质干细胞组、联合治疗组大鼠后肢功能开始逐渐恢复，BBB评分在造模后5，7 d有所上升(P < 0.05或P < 0.01)，联合治疗组造模后5，7 d的BBB评分明显高于单纯骨髓间充质干细胞组(P < 0.05)；②脊髓损伤大鼠经骨髓间充质干细胞联合山胡椒叶提取物治疗后，损伤部位的组织水肿、坏死等迹象明显减轻，凋亡细胞数量明显减少，肿瘤坏死因子α表达明显下降，上述指标均优于单纯骨髓间充质干细胞组；③结果表明，骨髓间充质干细胞移植联用胡椒叶提取物可有效治疗脊髓损伤，且其作用可能与减轻肿瘤坏死因子α介导的炎症反应有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-5532-9183(成建平)

关键词: 骨髓间充质干细胞, 山胡椒叶, 脊髓损伤, BBB评分, 细胞凋亡, 肿瘤坏死因子α, 氧化应激, 海南省自然科学基金项目

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that bone marrow mesenchymal stem cells have a high value in the early treatment of spinal cord injury. Lindera glauca leaves rich in flavonoids, saponins and other substances can scavenge free radicals and suppress lipid peroxidation. However, the combination treatment of bone marrow mesenchymal stem cells and Lindera glauca leaf extract in the spinal cord injury model is still rare.
OBJECTIVE: To observe the effect and mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation combined with Lindera glauca leaf extract on spinal cord injury.
METHODS: Fifty-two adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation (n=12), spinal cord injury (n=14), cell transplantation (n=13) and combination treatment (n=13) groups. The spinal cord injury model was established by the Allen’s method in the rats of spinal cord injury, cell transplantation and combination treatment groups. In the sham operation group, the spinal cord was only exposed but not subjected to the Allen’s striking method. The rats in the cell transplantation and combination treatment groups were administered bone marrow mesenchymal stem cells (1.5×10⁵) 0.5 mm away from the midline of the injured spinal cord. Moreover, the rats in the combination treatment group were then intragastrically given 5 mg/kg Lindera glauca leaf extract, once a day for 7 continuous days. At 1, 5, 7 days after model establishment, 4 rats from each group were used for Basso, Beattie and Bresnahan score and spinal cord cell apoptosis counting, and the expression of tumor necrosis factor-α in the spinal cord was detected by immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the spinal cord injury group, the hindlimb motor function was significantly restored in the rats of cell transplantation and combination treatment groups. The Basso, Beattie and Bresnahan scores in the cell transplantation and combination treatment groups were markedly higher than those in the spinal cord injury group at 5 and 7 days after modeling (P < 0.05 or P < 0.01). And the Basso, Beattie and Bresnahan scores in the combination treatment group were higher than those in the cell transplantation group (P < 0.05). (2) After treatment, the rats in the combination treatment group exhibited significantly reduced signs of tissue edema and necrosis at the injury site, in which the number of apoptotic cells and the expression of tumor necrosis factor α were significantly decreased. All the sighs in the combination treatment group were improved as compared with the cell transplantation group. These findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cell transplantation combined with Lindera glauca leaf extract can treat the spinal cord injury effectively, and its effect may be related to the reduction of tumor necrosis factor α-mediated inflammatory response.

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Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Lindera, Spinal Cord Injuries, Tumor Necrosis Factor-alpha, Tissue Engineering

中图分类号:

成建平，李华，李雄杰. 骨髓间充质干细胞移植联用山胡椒叶提取物可改善脊髓损伤区域的炎症反应[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(13): 1975-1981.

Cheng Jianping, Li Hua, Li Xiongjie. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation combined with Lindera glauca leaf extract attenutes inflammation after spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(13): 1975-1981.

图/表（结果） 3

2.1 骨髓间充质干细胞特性 第3代大鼠骨髓间充质干细胞为长梭形或者多角形，呈平行排列或漩涡样生长；采用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志物显示CD44、CD105呈阳性表达，CD34、CD45呈阴性表达，见图2。

2.2 实验动物数量分析 SD大鼠造模后2 h左右清醒，表现为下肢基本瘫痪，仅前肢可运动，BBB评分均在10分以内，剔除大于10分者。脊髓损伤组1只大鼠死亡；脊髓损伤组、单纯骨髓间充质干细胞组、联合治疗组各有1只大鼠BBB评分>10分。最终保证每组均有12只大鼠进入结果分析。

2.3 各组大鼠的后肢运动功能评分 与假手术组相比，脊髓损伤组大鼠BBB评分明显降低(P < 0.01)。与脊髓损伤组相比，单纯骨髓间充质干细胞组、联合治疗组大鼠后肢功能开始逐渐恢复，BBB评分在造模后5，7 d有所上升(P < 0.05或P < 0.01)。联合治疗组造模后5，7 d的BBB评分明显高于单纯骨髓间充质干细胞组(P < 0.05)。具体见表1，图3。

2.4 各组大鼠损伤脊髓病理形态 苏木精-伊红染色结果显示，假手术组大鼠造模后1，5，7 d，脊髓组织结构正常，未见明显病变；脊髓损伤组大鼠造模后可见脊髓灰质出现水肿、溶解、神经元坏死和出血，大量炎症细胞浸润，白质神经纤维束和神经胶质坏死；在造模后5，7 d联合治疗组大鼠神经细胞水肿明显减轻，未见细胞出血坏死，损伤结构大部分修复，单纯骨髓间充质干细胞组修复效果不如联合治疗组，见图4。

2.5 各组大鼠损伤脊髓中细胞凋亡情况 TUNEL染色结果显示，假手术组大鼠脊髓中未见凋亡细胞；脊髓损伤组大鼠损伤部位脊髓中可见较多的凋亡细胞；与模型组相比，联合治疗组及单纯骨髓间充质干细胞组大鼠损伤脊髓中凋亡细胞数量明显减少(P < 0.01或P < 0.05)，且与单纯骨髓间充质干细胞组相比，联合治疗组大鼠损伤脊髓中凋亡细胞数量较少(P < 0.05)，见图5，表2。

2.6 各组大鼠损伤脊髓中肿瘤坏死因子α的表达 免疫组化染色结果显示，肿瘤坏死因子α主要表达于胞浆或呈分泌型表达，呈褐色或黄褐色。与假手术组相比，脊髓损伤组大鼠损伤脊髓中肿瘤坏死因子α表达增加(P < 0.05)；而与脊髓损伤组相比，联合治疗组、单纯骨髓间充质干细胞组大鼠损伤脊髓中肿瘤坏死因子α表达下降(P < 0.05)，且联合治疗组大鼠损伤脊髓中肿瘤坏死因子α的表达水平低于单纯骨髓间充质干细胞组(P < 0.05)，见图6，表3。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年6月在海南西部中心医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级新生大鼠1只；SPF级雌性SD大鼠52只，鼠龄45 d，体质量约250 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号为：SCXK(沪) 2017-0005，合格证号：0355954。实验动物饲养环境为温度范围20-25 ℃，相对湿度40%-70%。大鼠在实验前适应性饲养1周。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。

1.3.2 实验用主要试剂及仪器 山胡椒叶由海南西部中心医院药剂科提供；生理盐水注射液(山东齐都药业有限公司，生产批号3B15101404)；注射用青霉素钠(华北制药集团动物保健品有限公司，批准文号030201248)；戊巴比妥钠(上海上药新亚药业有限公司，批准文号国药准字H31021724)；兔抗肿瘤坏死因子α抗体(Abcam公司，工作浓度1∶100，货号ab6671，批号GR235155-18)；山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号PV-6001，批号K167722B)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZLI-9019)；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(ROCHE公司，货号11684817910，批号11906800)；蛋白酶K(Tiangen公司，货号RT403-01，批号M2011)；苏木精(Sigma公司，货号H9627，批号SLBN3249VS)；伊红(Sigma公司，货号E6003，批号62R80915X)；电子天平(南京苏测计量仪器有限公司，型号SC-DC-1200AS)；BX43型显微镜(Olympus公司)；BCD-211KD3型冰箱(TCL公司)；PYX-DHS500BS-Ⅱ型隔水式恒温培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)；RM2235型轮转式切片机(Leica公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 山胡椒叶提取物的制备 取新鲜清洁山胡椒叶，自然风干，105 ℃灭活10 min，70 ℃烘干至恒质量，研磨成粗粉，0.25 mm金属网过滤。取粗粉100 g，用500 mL丙酮、500 mL甲醇在80 ℃水浴中回流6 h，4 000 r/min离心10 min，取上清液，旋转蒸发浓缩，定容至100 mL，药液浓度为1 g∶1 mL，4 ℃保存备用^[11]。

1.4.2 骨髓间充质干细胞的提取与鉴定 取新生大鼠，以空气栓塞法处死，无菌条件下取双侧股骨与胫骨，去骨骺端，DMEM/F12培养基冲洗骨髓腔，充分吹打混匀，过滤去杂质，以1×10¹⁰L^-1细胞浓度接种于培养瓶，37 ℃、体积分数5% CO₂、饱和湿度环境培养3 d，全量换液，而后每隔2 d或3 d半量换液1次，约7 d时细胞融合达80%以上，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2传代扩增^[12-14]。倒置相差显微镜观察细胞形态，以流式细胞术检测CD34、CD44、CD45、CD105表达情况。取第3代骨髓间充质干细胞用于后续研究^[15-16]。

1.4.3 实验动物分组 将52只成年大鼠随机分为4组：假手术组(n=12)、脊髓损伤组(n=14)、单纯骨髓间充质干细胞组(n=13)及骨髓间充质干细胞联合山胡椒叶提取物治疗组(联合治疗组，n=13)。

1.4.4 Allen’s打击法建立脊髓损伤模型 将脊髓损伤组、单纯骨髓间充质干细胞组、联合治疗组大鼠以俯卧位固定，腹腔注射3%戊巴比妥钠(60 mg/kg)麻醉，剥开椎板，暴露T_8-9脊髓，垫片，以自制10 g重物5 cm高处自由落体击中垫片，建立脊髓损伤模型^[17]，见图1。假手术组仅剥开椎板，暴露脊髓，而不进行Allen’s打击。模型制备后，腹腔注射5 mL生理盐水，以防止脱水，腹腔注射青霉素2×10⁴ U/kg，2次/d，连续3 d。大鼠饲养于SPF房间，自由饮食。每日膀胱按压排尿3次，直至恢复排尿。以BBB评分检验模型，评分>10分鼠予以剔除。

1.4.5 细胞及药物干预 单纯骨髓间充质干细胞组在造模后即刻以微量注射器将骨髓间充质干细胞悬液(1.5×10⁹ L^-1)缓慢注入距离损伤脊髓中线0.5 mm处的脊髓实质内，损伤脊髓头尾两处每处各注射50 μL，每只大鼠移植细胞1.5×10⁵个。联合治疗组造模后即刻注射骨髓间充质干细胞，同时灌胃5 mg/kg山胡椒叶提取物，1次/d，连续7 d。

1.4.6 行为学评价 分别在造模后1，5，7 d，每组各取4只大鼠进行BBB评分。BBB评分总分为21分，正常为21分，分数越低大鼠后肢运动功能越差^[18]。

1.4.7 脊髓病理形态评价 在行为学评价后，将各组大鼠以过量戊巴比妥钠麻醉处死，取T_8-9脊髓，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，-20 ℃冷冻保存。切片，厚度4 μm；65 ℃恒温孵育6-12 h；二甲苯及梯度乙醇脱蜡复水，自来水浸洗，苏木精染液常温染色，自来水洗；1%盐酸乙醇快速浸润，自来水返蓝，伊红染液染色，自来水洗去浮色；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；光镜下观察。

1.4.8 脊髓中细胞凋亡的检测 以TUNEL法检测细胞凋亡的差异。取大鼠脊髓石蜡切片，常规脱蜡至水，PBS冲洗3×5 min；蛋白酶K 37 ℃消化20 min，PBS冲洗3×3 min；TUNEL反应混合液37 ℃作用30 min，PBS冲洗3×3 min；DAB显色；苏木精复染数秒，水洗；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固：光镜下观察。由于样本较小，统计各样本切片上的所有凋亡细胞数。

1.4.9 脊髓中肿瘤坏死因子α表达的检测 以免疫组化法检测肿瘤坏死因子α表达的差异。取大鼠脊髓石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，体积分数3%H₂O₂ 37 ℃孵育15 min阻断及灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗3×3 min；0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)水煮修复10 min，自然冷却至室温，PBS冲洗3×3 min；一抗4 ℃孵育过夜，室温平衡30 min，PBS冲洗3×5 min；二抗37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3×5 min；DAB显色，自来水充分冲洗；苏木精复染，显微镜下每张切片随机选择5个不重叠的200倍视野观察，判读肿瘤坏死因子α的阳性表达情况。染色结果采用半定量分析方法：以染色强度结合阳性细胞数百分比进行评分。染色强度：无明显着色为0分，轻微为1分，中度为2分，重度为3分。阳性细胞百分比：0-5%为0分，6%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，>75%为4分。最终评分为阳性细胞百分比与染色强度评分的总和。

1.5 主要观察指标 损伤脊髓的病理变化、细胞凋亡情况以及肿瘤坏死因子α表达。

1.6 统计学分析 结果以x(_)±s表示。采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，以单因素方差分析及t 检验比较组间差异。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

骨髓间充质干细胞具有取材方便、培养简易、无伦理道德问题等优势，在诸多干细胞实验中常作为首选种子细胞。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在适宜条件下可分化为包括神经元细胞在内的多种细胞，还可分泌多种神经营养因子，有助于损伤脊髓的恢复^[19-21]；同时其还能改善脊髓的缺血缺氧状况，有效恢复神经元线粒体功能，减轻氧化应激等继发性反应^[22-24]。尽管骨髓间充质干细胞具有一定的抗炎、抗凋亡作用，但其本身也极易受到各种有害因素的影响，尤其是脊髓损伤后炎性级联反应产生大量具有神经毒性作用的细胞因子，不仅引起神经细胞的凋亡、坏死，而且影响骨髓间充质干细胞的增殖和迁移，如何使骨髓间充质干细胞在脊髓损伤区域中发挥更大的作用是目前的研究热点。山胡椒广泛分布于秦岭-淮河以南各省区，资源十分丰富，其提取物易于获取。山胡椒提取物虽然是一种混合物，但是含有黄酮、皂甙等多种植物活性成分，具有抗炎、减轻氧化损伤的作用^[25-29]。实验拟以骨髓间充质干细胞移植联用山胡椒叶提取物对脊髓损伤大鼠模型进行治疗，在观测指标上除了从炎症反应入手观察炎症因子肿瘤坏死因子α在脊髓组织表达的变化，另外选择BBB评分及脊髓细胞凋亡计数作为检测脊髓功能恢复的指标。

BBB评分是评估脊髓损伤后动物后肢运动功能最常用的方法之一，较其他方法具有明显优势^[30-31]。实验结果显示，BBB评分可以很好地区分Allen’s打击法造成脊髓损伤后单纯骨髓间充质干细胞组、联合治疗组的运动恢复情况。单纯骨髓间充质干细胞组、联合治疗组大鼠后肢功能逐渐恢复，BBB评分在造模后5，7 d有所上升。联合治疗组造模后5，7 d的BBB评分明显高于单纯骨髓间充质干细胞组(P < 0.05)，说明山胡椒叶提取物联合骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤能促进大鼠行为学能力改善，有助于其运动功能的恢复。

众所周知，细胞凋亡是基因控制的细胞自主性死亡方式，其过程又称为细胞程序性死亡。凋亡异常激活会导致细胞呈现凋亡性死亡，使组织器官结构破坏、功能障碍，甚至引起各种疾病发生。脊髓损伤是一种破坏性的神经系统损伤，由于脊髓神经元和轴突的丧失而导致功能缺陷。细胞凋亡是急性脊髓损伤后神经细胞的主要死亡形式，也是加重脊髓损伤的一个重要因素。因此，抑制细胞凋亡的发生，对受损组织可能具有积极的修复作用。TUNEL染色结果显示，脊髓损伤后，损伤周围存在大量的神经细胞凋亡，凋亡所导致的神经细胞死亡是扩大脊髓损伤范围的一个因素。单纯骨髓间充质干细胞组凋亡的神经细胞数目明显少于脊髓损伤组，这提示脊髓损伤后局部移植骨髓间充质干细胞能够抑制损伤周围组织内神经细胞的凋亡，这一发现与于德水等^[32]的研究结果相一致，作者分析骨髓间充质干细胞可能是通过产生直接对神经细胞具有营养和保护作用的细胞因子和营养因子，保护损伤脊髓组织内的神经细胞免受或逆转脊髓继发损伤所导致的伤害^[33-35]。实验还发现联合治疗组凋亡细胞进一步减少，说明山胡椒叶提取物中含有的黄酮、皂甙等多种植物活性成分可能有助于骨髓间充质干细胞在移植区成活发挥减少脊髓细胞凋亡的作用。

肿瘤坏死因子α被认为是炎症反应过程中的重要启动因子，在机体遭受损伤和炎症过程中具有重要的作用，同时在局部炎症放大中具有重要意义^[36-37]，脊髓损伤后血中肿瘤坏死因子α持续高表达且是最早升高的细胞因子，可上调其他细胞因子的产生，参与脊髓继发性损伤的过程^[38]，实验结果显示，脊髓损伤后，损伤脊髓组织血管充血，细胞水肿，组织内肿瘤坏死因子α表达明显增加，弥散分布在损伤区周围，因此，控制肿瘤坏死因子α的高表达对减轻脊髓损伤有重要意义。已有学者证实了采用甲强龙可协同降低局部肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β表达水平，从而促进脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复^[39]；康聪等^[40]研究表明雌激素与骨髓间充质干细胞联合应用治疗脊髓损伤具有协同作用，能更有效抑制神经细胞凋亡，降低脊髓组织肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平，促进脊髓功能恢复；Li等^[41]研究表明促红细胞生成素可以通过上调SDF-1/ CXCR4轴的表达动员骨髓间充质干细胞向脊髓损伤部位迁移，降低受损脊髓中肿瘤坏死因子水平，并促进骨髓间充质干细胞对脊髓损伤的修复作用。该实验采用免疫组化法检测肿瘤坏死因子α表达，以明确骨髓间充质干细胞移植联用胡椒叶提取物治疗脊髓损伤是否与抑制肿瘤坏死因子α过度表达有关。免疫组化染色结果显示，与脊髓损伤组相比，联合治疗组、单纯骨髓间充质干细胞组大鼠损伤脊髓中肿瘤坏死因子α的表达水平下降，联合治疗组下降更明显。以上结果说明山胡椒叶提取物与骨髓间充质干细胞移植起到协同治疗作用，通过降低脊髓损伤后肿瘤坏死因子α的表达水平，从而减轻脊髓损伤后的炎症反应，山胡椒叶提取物能够改善骨髓间充质干细胞本身或其生存的环境，二者对损伤脊髓有保护作用。

由于预实验结果显示与脊髓损伤模型组相比，单独应用山胡椒叶提取物大鼠BBB评分虽有升高，但差异无显著性意义，因此，此次实验仅设立联合治疗组，未设立山胡椒叶提取物单独治疗组。未来将进一步研究山胡椒叶提取物联合骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤相关作用中的分子生物学机制及山胡椒叶提取物是否有助于骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。另外，该实验只观察了骨髓间充质干细胞移植联用胡椒叶提取物对单一炎症因子表达的影响，其中的具体机制尚需进一步实验研究。

结论：骨髓间充质干细胞移植联用胡椒叶提取物可有效治疗脊髓损伤，脊髓损伤大鼠损伤部位的组织水肿、坏死等迹象明显减轻，且后肢运动功能明显恢复，其作用可能与减轻肿瘤坏死因子α介导的炎症反应有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程