诱导多功能干细胞来源肝样细胞体内抗肝纤维化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1607

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (9): 1384-1389.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1607

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诱导多功能干细胞来源肝样细胞体内抗肝纤维化

程钢，黄邓高，梁颖

中南大学湘雅医学院附属海口医院肿瘤放疗科，海南省海口市 570208

修回日期:2018-11-16 出版日期:2019-03-28 发布日期:2019-03-28
通讯作者: 梁颖，主治医师，硕士研究生，中南大学湘雅医学院附属海口医院肿瘤放疗科，海南省海口市 570208
作者简介:程钢，男，1981年生，吉林省吉林市人，2015年北华大学医学院毕业，主治医师，主要从事肿瘤放疗方面的研究。
基金资助:
2016年度海南省自然科学基金(20168315)，项目负责人：梁颖

Hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells inhibit liver fibrosis in rats

Cheng Gang, Huang Denggao, Liang Ying

Department of Radiation Oncology, Affiliated Haikou Hospital, Xiangya School of Medicine, Central South University, Haikou 570208, Hainan Province, China

Revised:2018-11-16 Online:2019-03-28 Published:2019-03-28
Contact: Liang Ying, Master candidate, Attending physician, Department of Radiation Oncology, Affiliated Haikou Hospital, Xiangya School of Medicine, Central South University, Haikou 570208, Hainan Province, China
About author:Cheng Gang, Attending physician, Department of Radiation Oncology, Affiliated Haikou Hospital, Xiangya School of Medicine, Central South University, Haikou 570208, Hainan Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Hainan Province in 2016, No. 20168315 (to LY)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
诱导多功能干细胞：2006年，Takahashi等发现小鼠成纤维细胞可诱导分化为干细胞，并且该干细胞具有与胚胎干细胞相似的特征与功能，被命名为诱导多功能干细胞。2007年，Takahashi等通过反转录病毒可将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因导入人体皮肤细胞转化为诱导多功能干细胞。2009年，Song等通过模拟人体的肝脏胚胎发育过程，在诱导分化的不同阶段添加细胞因子，首次将人诱导多功能干细胞定向诱导分化为肝细胞。
人诱导多功能干细胞向肝细胞的分化：目前获取人诱导多功能干细胞来源肝样细胞主要分3个阶段，第一阶段为内胚层分化阶段，第二阶段为内胚层向肝细胞发展阶段，第三阶段为成熟肝细胞阶段。现阶段应用较多的方法是在不同的诱导分化阶段添加生长因子、细胞因子或者小分子化合物，促进人诱导多能干细胞分化为肝样细胞。在肝细胞生长与分化过程中，多种生长因子与细胞因子参与其中，主要包括肝细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、胰岛素样生长因子和抑瘤素M等。

摘要
背景：诱导多功能干细胞具有与胚胎干细胞相似的自我更新、增殖及分化能力，无来源限制，又不存在伦理问题，有望成为治疗肝病的细胞来源。
目的：观察诱导多功能干细胞来源肝样细胞体内移植对肝纤维化的改善作用。
方法：采用三步法将诱导多功能干细胞诱导分化为肝样细胞，采用糖原染色、LDL摄取实验、免疫组织化学法检测诱导分化细胞合成糖原能力、摄取LDL能力和甲胎蛋白、白蛋白、CK18蛋白表达。取成年雄性SD大鼠45只(由中南大学湘雅医学院附属海口医院医学实验动物中心提供)，随机分为3组，分别为正常对照组、模型组、细胞移植组，每组15只。模型组、细胞移植组以腹腔注射四氯化碳方法建立肝纤维化模型，造模后第3天，细胞移植组尾静脉注射0.5 mL诱导分化21 d的肝样细胞，细胞浓度为2×10⁹ L^-1。细胞移植后4周，取静脉血与肝组织标本，分析肝功能及肝纤维化指标变化与肝病理改变。
结果与结论：①诱导分化21 d后，人诱导多能干细胞克隆团已经松散，以类圆形或多角形为主，呈铺路石样分布并密集排列，糖原染色可见细胞胞浆内有大量聚集的粉红色糖原，具备摄取LDL的能力，免疫组织化学法观察甲胎蛋白、白蛋白与CK18呈阳性表达；②细胞移植后4周，与正常组比较，模型组白蛋白水平显著降低(P < 0.05)，直接胆红素、间接胆红素、谷草转氨酶、谷丙转氨酶及Ⅳ型胶原、血清透明质酸酶、血清Ⅲ型前胶原水平均显著升高(P < 0.05)。与模型组比较，细胞移植组白蛋白水平显著升高(P < 0.05)，直接胆红素、间接胆红素、谷草转氨酶、谷丙转氨酶及Ⅳ型胶原、血清透明质酸酶、血清Ⅲ型前胶原水平均显著降低(P < 0.05)；③细胞移植后4周，细胞移植组炎性细胞浸润、肝细胞变性与坏死程度较模型组均有不同程度的改善；④结果表明，诱导多功能干细胞来源的肝样细胞对大鼠肝纤维化具有明显改善作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0355-918X(程钢)

关键词: 肝纤维化, 诱导多功能干细胞, 干细胞来源肝样细胞, 细胞移植, 海南省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Induced pluripotent stem cells have similar self-renewal, proliferation and differentiation abilities to embryonic stem cells. They have no source limitations, no ethical problems, and no current problems of cell xenogenesis, which are expected to be the source of cells for the treatment of liver diseases.
OBJECTIVE: To observe the effect of induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells on liver fibrosis.
METHODS: The three-step method in vitro was used to induce the differentiation of induced pluripotent stem cells into hepatocyte-like cells. Glycogen staining, immunohistochemistry and low-density lipoprotein uptake assay were used to detect the ability of induced cells to synthesize glycogen, alpha-fetoprotein, albumin, CK18 protein and low-density lipoprotein uptake. Forty-five Sprague-Dawley rats (provided by the Experimental Animal Center, the Affiliated Haikou Hospital, Xiangya School of Medicine, Central South University) were randomized into three groups: normal control group, model group and cell transplantation group (n=15 per group). The rats in the latter two groups were intraperitoneally injected with carbon tetrachloride to establish liver fibrosis models. Cell transplantation group was given intravenous injectin of hepatocyte-like cells (induced for 21 days), 0.5 mL, 2×10⁹/L, at 3 days after modeling. Four weeks after cell transplantation, venous blood and liver tissue samples were taken to analyze the changes of liver function, liver fibrosis index and liver pathology.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After 21 days of induction, human induced pluripotent stem cell clonal clusters became loose, mainly round or polygonal in shape, and presented with a dense paving stone-like arrangement. A large amount of pink glycogens could be seen in the cytoplasm, indicating that induced pluripotent stem cells have the ability to synthesize glycogen. Low-density lipoprotein uptake test showed that induced pluripotent stem cells had the ability to uptake low-density lipoprotein. Immunohistochemistry detection showed that the cells were positive for alpha fetoprotein, albumin and CK18. (2) At 4 weeks after cell transplantation, the level of albumin in the model group was significantly lower than that in the normal control group (P < 0.05), while the levels of direct bilirubin, indirect bilirubin, aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, type IV collagen, serum hyaluronidase, serum type III procollagen in the model group were significantly higher than those in the normal control group (P < 0.05). Compared with the model group, the level of albumin in the cell transplantation group was significantly increased (P < 0.05), while the levels of direct bilirubin, indirect bilirubin, aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, type IV collagen, serum hyaluronidase, serum type III procollagen in the cell transplantation group were significantly decreased (P < 0.05). (3) Four weeks after cell transplantation, inflammatory cell infiltration, hepatocyte degeneration and necrosis in the cell transplantation group were improved to different extents. Therefore, hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells could significantly improve liver fibrosis in rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Liver Cirrhosis, Induced Pluripotent Stem Cells, Hepatocytes, Tissue Engineering

中图分类号:

程钢，黄邓高，梁颖. 诱导多功能干细胞来源肝样细胞体内抗肝纤维化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(9): 1384-1389.

Cheng Gang, Huang Denggao, Liang Ying. Hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells inhibit liver fibrosis in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(9): 1384-1389.

图/表（结果） 5

2.1 人诱导多能干细胞向肝样细胞诱导分化的形态变化 经肝向诱导分化至第21天，人诱导多能干细胞克隆团已经松散，以类圆形或多角形为主，呈铺路石样分布并密集排列，见图1A；糖原染色可见细胞胞浆内有大量聚集的粉红色糖原，见图1B；LDL摄取实验显示细胞胞质内有大量红色的荧光，见图1C；免疫组织化学法观察甲胎蛋白、白蛋白与CK18呈阳性表达，见图1D-F。人诱导多能干细胞向肝细胞诱导分化过程中的甲胎蛋白、白蛋白与CK18表达阳性率，见表1。

2.2 动物体内移植实验结果 入选45只SD大鼠，其中30只大鼠建立肝纤维化模型，3只造模失败，造模成功率为90%，随后采用相同方法造模，将实验动物补齐。

2.2.1 肝功能指标检测结果 与正常组比较，模型组、细胞移植组白蛋白显著降低，直接胆红素、间接胆红素、谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平均显著升高，差异均有显著性意义(P < 0.05)。与模型组比较，细胞移植组白蛋白显著升高，直接胆红素、间接胆红素、谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平均显著降低，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.2.2 肝纤维化指标检测结果 与正常组比较，模型组Ⅳ型胶原、血清透明质酸酶、血清Ⅲ型前胶原水平均显著升高，差异均有显著性意义(P < 0.05)。与模型组比较，细胞移植组Ⅳ型胶原、血清透明质酸酶、血清Ⅲ型前胶原水平均显著降低，差异均有显著性意义(P < 0.05)。细胞移植组Ⅳ型胶原、血清透明质酸酶水平仍高于正常组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表3。

2.2.3 肝脏病理观察结果 细胞移植后4周苏木精-伊红染色、Masson染色显示，正常组肝组织肝小叶轮廓清晰，未见炎性细胞浸润，肝细胞形态正常，肝细胞索排列规则，肝窦无扩张；模型组肝小叶轮廓模糊不清，肝细胞疏松、肿胀，可见大量炎性细胞浸润，大量脂肪细胞呈空泡状改变，呈典型的肝纤维化改变；细胞移植组可见炎性细胞浸润、肝细胞变性与坏死，但程度较对照组明显减轻，病理改变介于正常组与对照组之间，见图2。

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引言

材料方法

1.1 设计 体外与体内观察实验。

1.2 时间与地点 实验于2015年1月至2016年7月在中南大学湘雅医学院附属海口医院完成。

1.3 材料 人诱导多能干细胞(北京赛贝生物技术有限公司提供)；Knockout^TM DMEM培养基(南京信帆生物技术有限公司)；Knockout^TM血清替代物、非必需氨基酸、β-巯基乙醇(上海索宝生物科技有限公司)；HBM培养基、RPMI 1640培养基、碱性成纤维细胞生长因子(北京泽平科技有限责任公司)；胎牛血清、Wnt3a、激活素A (浙江天杭生物科技有限公司)；鼠抗人甲胎蛋白、白蛋白及CK18单克隆抗体(北京奥维亚生物技术有限公司)；免疫组织化学试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)；DiI-AC-LDL(广州奕源生物科技有限公司)；四氯化碳(天津东旺科技发展有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人诱导多能干细胞的培养 取液氮冻存的人诱导多能干细胞，复苏后，加入含有24%Knockout^TM血清替代物、1×谷氨酰胺替代物、1×非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、100 U/mL青霉素/链霉素和4.8 µg/L碱性成纤维细胞生长因子的Knockout^TMDMEM培养基，接种于24孔培养板，放置于37 ℃，含体积分数5%的CO₂培养箱中培养。

1.4.2 人诱导多能干细胞向肝样细胞的诱导分化 当人诱导多能干细胞贴壁后，去除原有的培养基，换为含有1×谷氨酰胺替代物、体积分数0.5%胎牛血清、20 µg/L Wnt3a、100 µg/L激活素A的RPMI 1640培养基，培养6 d，此阶段诱导其分化为特定性内胚层；然后更换为含1×谷氨酰胺替代物、0.5 g/L牛血清白蛋白、10 µg/L人成纤维生长因子4的HBM培养基，培养5 d，此阶段诱导其分化为肝祖细胞；最后更换为含体积分数5%胎牛血清、10 µg/L人成纤维生长因子4、10 µg/L肝细胞生长因子、10 µg/L重组抑瘤素M、10^-7 mol/L地塞米松的HBM培养基，培养10 d，此阶段诱导其分化为肝细胞^[9]。倒置显微镜下观察细胞形态。

1.4.3 诱导分化结果的鉴定

糖原染色检测糖原合成能力：取诱导分化21 d的细胞，制备细胞爬片24 h后，以无菌PBS洗涤3次，3 min/次；去除PBS，加入40 g/L多聚甲醛固定15 min，以无菌PBS洗涤3次，3 min/次；去除PBS，加入高碘酸氧化10 min；去除高碘酸，蒸馏水洗涤细胞5次，3 min/次；雪夫试剂染色15 min；取出盖玻片，温和流水冲洗，显微镜下观察染色情况。

免疫组织化学法观察甲胎蛋白、白蛋白及CK18的表达：取诱导后7，14，21 d的细胞，以40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS清洗细胞3次，5 min/次；68 ℃烤片20 min，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水；加入体积分数3%H₂O₂孵育10 min，PBS清洗细胞；以0.01 mol/L枸橼酸缓冲液进行抗原修复；正常羊血清工作液封闭10 min；滴加一抗(鼠抗人甲胎蛋白、白蛋白及CK18单克隆抗体)，4 ℃冰箱孵育过夜，PBS清洗细胞，以PBS代替一抗作阴性对照，滴加生物素标记二抗，37 ℃孵育30 min，PBS清洗细胞；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液孵育30 min，PBS清洗细胞；DAB/H₂O₂反应染色，自来水充分冲洗，苏木精复染，常规脱水，透明，干燥，封固。显微镜下观察染色情况。每张切片随机选择9个视野，每个视野观察100个细胞，计数阳性细胞数。

LDL摄取实验：取诱导前及诱导分化后21 d的细胞，弃原培养基，以PBS清洗2次；将含有20 mg/L DiI-AC-LDL的DMEM完全培养基加入细胞中，孵育4 h；弃掉含有DiI-AC-LDL的培养基，以PBS清洗细胞3次，5 min/次；显微镜下观察染色情况。

1.4.4 动物体内移植实验

肝纤维化模型的建立和细胞移植：取成年雄性SD大鼠(SPF级，体质量200-220 g，常规饲养，自由进食水，由中南大学湘雅医学院附属海口医院医学实验动物中心提供)45只，随机分为3组，分别为正常组、模型组、细胞移植组，每组15只。模型组和细胞移植组腹腔注射1 mL/kg的40%四氯化碳橄榄油溶液，2次/周，共注射4周，经病理组织学观察，肝组织出现典型的肝细胞坏死、空泡化和大量胶原纤维沉积等肝纤维化病理特征，判定造模成功。如造模过程中有动物死亡，采用相同方法造模。动物实验中对动物的处理严格依照动物伦理学标准进行。造模成功后第3天，细胞移植组尾静脉注射0.5 mL诱导分化21 d的人诱导多能干细胞，细胞浓度为2×10⁹ L^-1，模型组注射等量生理盐水。

标本采集：细胞移植后4周，常规麻醉大鼠，抽取静脉血3 mL，同时打开腹腔，取肝组织。

肝功能及肝纤维化指标检测：取静脉血分离血清，采用溴甲酚紫法检测血清白蛋白水平^[10]，采用重氮法检测直接胆红素、间接胆红素水平^[11]，采用速率法检测谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平^[12]，采用化学发光法检测血清透明质酸酶、Ⅳ型胶原、血清Ⅲ型前胶原水平^[13]。

肝脏病理观察：取肝脏组织，体积分数10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，进行苏木精-伊红染色和Masson染色，光学显微镜下观察肝脏组织病理改变。

1.5 主要观察指标 诱导多功能干细胞来源肝样细胞移植后4周，各组大鼠肝功能、肝纤维化指标变化及肝脏组织病理形态。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0进行统计学处理，计量资料采用x(_)±s形式表示，进行组间独立的t 检验，检验水准为α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

2006年，Takahashi等^[14]发现小鼠成纤维细胞可分化为干细胞，并且该干细胞具有与胚胎干细胞相似的特征与功能，被命名为诱导多功能干细胞。2007年，Takahashi等^[15]发现通过反转录病毒可将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因导入人体皮肤细胞转化为诱导多功能干细胞。2009年，Song等^[16]通过模拟人体的肝脏胚胎发育过程，在诱导分化的不同阶段添加细胞因子，首次将人诱导多功能干细胞定向诱导分化为肝细胞。此后，研究者采用细胞因子、特定基因、三维培养、细胞分选或共培养方法，不断提高人诱导多功能干细胞来源肝样细胞的诱导效率及诱导分化后肝样细胞功能^[17-19]。

目前获取人诱导多功能干细胞来源肝样细胞主要分3个阶段，第一阶段为内胚层分化阶段，第二阶段为内胚层向肝细胞发展阶段，第三阶段为成熟肝细胞阶段。现阶段应用较多的方法是在不同的诱导分化阶段添加生长因子、细胞因子或者小分子化合物，促进人诱导多能干细胞分化为肝样细胞。在肝细胞生长与分化过程中，多种生长因子与细胞因子参与其中，主要包括肝细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、胰岛素样生长因子和抑瘤素M等^[17-22]。早期有研究发现Wnt家族成员直接参与调节内胚层的形成，尤其是Wnt3a信号^[23-24]。另外，有研究证实在肝脏的不同发育阶段均有Wnt3a的表达，并且Wnt3a也被诱导表达在肝细胞再生过程中^[25-26]。因此，该研究将激活素A与Wnt3a在诱导分化的首阶段合用，以更有效地将人诱导多功能干细胞诱导分化为肝样细胞。研究显示诱导21 d后，倒置显微镜下可见人诱导多能干细胞呈现肝样细胞形态，初步断定肝样细胞形成。体外获得的肝细胞不仅应具有肝细胞的形态和表型，还应具有肝细胞功能，这样才能替代肝细胞发挥其研究和应用价值。因此接下来对诱导分化的肝样细胞特征及功能进行了分析。一般来说，评价肝样细胞特征的指标主要包括细胞形态、特异性基因及蛋白表达、细胞色素P450s酶及酶代谢活性等^[27]，对肝细胞功能的评价主要有尿素合成、糖原合成、脂储存、吲哚青绿等^[28-29]。实验主要进行了甲胎蛋白、白蛋白、CK18蛋白检测，糖原染色实验，结果显示：诱导21 d后的肝样细胞阳性表达肝细胞特征性蛋白甲胎蛋白、白蛋白、CK18蛋白，具备合成糖原能力，以上结果提示诱导分化的细胞具有肝样细胞功能。下一步需要与其他诱导方式作比较，以评价其诱导分化效果，以更一步优化人诱导多功能干细胞来源肝样细胞的诱导分化效率。同时对于各细胞因子在诱导分化中的分子机制还需更进一步的研究。

诱导多功能干细胞的建立与应用不存在伦理限制，在条件允许的情况下，甚至可以建立自身诱导多功能干细胞，通过诱导使其定向分化，产生特定类型的细胞，用于各器官的组织工程或细胞移植，可以避免免疫排斥现象^[30-37]。体外实验已经成功地采用三步诱导法获得了人诱导多功能干细胞来源肝样细胞，接下来进行了动物体内移植实验，进一步观察人诱导多功能干细胞来源肝样细胞对肝纤维化的改善作用。该研究结果发现细胞移植后4周，肝纤维化大鼠肝细胞变性、坏死等情况较对照组明显减轻，炎性细胞浸润明显减少，同时肝功能指标直接胆红素、间接胆红素、谷草转氨酶、谷丙转氨酶及肝纤维化指标Ⅳ型胶原、血清透明质酸酶、血清Ⅲ型前胶原水平均较模型组有明显改善，这些结果表明人诱导多功能干细胞来源肝样细胞对肝纤维化大鼠的肝功能及肝纤维化具有一定的改善作用，提示诱导多功能干细胞来源肝样细胞有望成为临床肝脏疾病治疗的细胞产品。但是对于人诱导多功能干细胞来源肝样细胞的作用机制还有待进一步研究。同样Asgafi等^[38]研究也认为诱导多功能干细胞来源肝样细胞对肝损伤具有治疗作用，可明显提高肝损伤大鼠存活率与肝功能。

尽管实验采用三步诱导法成功诱导分化出诱导多功能干细胞来源肝样细胞，并证实其对肝纤维化具有明显改善作用，但距离其应用于临床还有很长的路要走，如何高效获得更成熟的肝细胞以及合理有效地利用获得的肝细胞，是诱导多能干细胞向肝细胞诱导分化研究的努力方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

诱导多功能干细胞来源肝样细胞体内抗肝纤维化

Hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells inhibit liver fibrosis in rats

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