犬脐带间充质干细胞来源外泌体修复皮肤创伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0959

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (25): 4021-4027.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0959

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犬脐带间充质干细胞来源外泌体修复皮肤创伤

詹小舒，罗冬章，王丙云，卢瑜，冼伟杭，蓝奕琦，郭建波，罗惠娜，白银山，计慧琴，陈胜锋，陈志胜，刘璨颖

佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东省佛山市 528231

修回日期:2018-06-22 出版日期:2018-09-08 发布日期:2018-09-08
通讯作者: 王丙云，男，博士，教授，佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东省佛山市 528231
作者简介:詹小舒，女，1993年生，广东省饶平县人，硕士研究生，主要从事动物干细胞研究。
基金资助:
广东省自然科学基金(2017A030313171)；广东省教育厅预防兽医学重点实验室项目(2014KTSPT037)；国家级大学生创新创业计划训练项目；2017年度佛山科学技术学院学术基金项目

Effects of exosomes derived from canine umbilical cord mesenchymal stem cells on canine skin wound

Zhan Xiao-shu, Luo Dong-zhang, Wang Bing-yun, Lu Yu, Xian Wei-hang, Lan Yi-qi, Guo Jian-bo, Luo Hui-na, Bai Yin-shan, Ji Hui-qin, Chen Sheng-feng, Chen Zhi-sheng, Liu Can-ying

School of Life Science and Engineering, Foshan University, Foshan 528231, Guangdong Province, China

Revised:2018-06-22 Online:2018-09-08 Published:2018-09-08
Contact: Wang Bing-yun, M.D., Professor, School of Life Science and Engineering, Foshan University, Foshan 528231, Guangdong Province, China
About author:Zhan Xiao-shu, Master candidate, School of Life Science and Engineering, Foshan University, Foshan 528231, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2017A030313171; the Project of the Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine of Guangdong Provincial Education Department, No. 2014KTSPT037; the National Undergraduate Innovation and Entrepreneurship Training Program; the Academic Foundation of Foshan University in 2017

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
外泌体：是活细胞分泌的具有生物活性的胞外囊泡，大小在30-200 nm之间，由于其包含了丰富的生物活性分子，如蛋白质、miRNA、lncRNA等，因此参与多项生命活动，在信息的传递、疾病的诊断及治疗方面发挥较大作用。
外泌体的分离方法：主要有低温超高速离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、超滤离心法等，低温超高速离心法作为最常用的方法，具有分离样品量大且较纯净的特点，因此实验选用此方法分离得到外泌体。

摘要
背景：研究发现，间充质干细胞来源的外泌体具有抑制炎症、促进皮肤细胞增殖和血管再生、减少肌成纤维细胞积累的作用，表明间充质干细胞主要通过旁分泌方式修复损伤，给皮肤损伤治疗提供了新方法。但应用犬脐带间充质干细胞来源外泌体治疗皮肤创伤的研究甚少。
目的：研究犬脐带间充质干细胞来源的外泌体对犬皮肤创伤的修复作用，并探讨其作用机制。
方法：选取年龄相近的健康中华田园犬12只，在背部正中肩胛骨下方皮肤做4 cm×4 cm正方形切口，然后随机分成外泌体组和模型组，每组6只。外泌体组在创口周围注射1 mL质量浓度为300 mg/L犬脐带间充质干细胞来源外泌体溶液，模型组注射等量生理盐水。造模前后每天观察犬的精神状况和创面愈合情况，定时检测血常规和创口面积，并于第1，2，4周进行病理组织观察。
结果与结论：在造模后第1周，模型组出现了明显炎症反应，白细胞数量也较造模前升高了30%，而外泌体组炎症反应不明显，白细胞总数和中性粒细胞升高速度较模型组慢；两组的淋巴细胞数和红细胞数无明显差异。治疗组肉芽组织生长和伤口愈合速度较模型组快，但无显著性差异。结果提示，犬脐带间充质干细胞来源外泌体具有一定抑制炎症和促进皮肤创面愈合的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8205-3338(詹小舒)

关键词: 犬脐带间充质干细胞, 外泌体, 皮肤创伤, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that mesenchymal stem cell-derived exosomes can inhibit inflammation,
promote skin cell proliferation and angiogenesis, and reduce myofibroblast accumulation. In other words, the injury repair by mesenchymal stem cells is mainly implemented via paracrine mechanism, providing a new method for the treatment of skin injuries. However, there are few studies on the treatment of skin wounds using canine umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes.
OBJECTIVE: To investigate the repair effect of umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes on canine skin wounds and the underlying mechanisms.
METHODS: Twelve healthy dogs with the same age and growth status were selected. A 4 cm×4 cm square full-thickness incision was made under the medial scapula of the dog back and these 12 dog models were randomly divided into two groups, with 6 rats in each group. The treatment group was injected with 1 mL of saline containing 300 mg/L exosomes, while the model group was injected with the same volume of normal saline as a control. Before and after the modeling, the dog’s mental status and wound healing were observed daily. The blood routine and the wound area were measured regularly and the callus tissues were taken to make pathological observation in the 1st, 2nd and 4th week after modeling.
RESULTS AND CONCLUSION: In the 1st week, there was a marked inflammatory reaction in the model group, and the number of white blood cells was also increased by 30% compared with the baseline data. The inflammatory response in the treatment group was not obvious, and the number of white blood cells and neutrophils was increased slowly as compared with the model group. There was no significant difference in the number of lymphocytes and red blood cells between the two groups. The growth of granulation tissue and wound healing in the treatment group were faster compared with the model group, but no significant differences were detected. These results suggest that canine umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes, to some extent, inhibit inflammation and promote skin wound healing.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cells, Exosomes, Skin, Stem Cells

中图分类号:

R394.2

詹小舒，罗冬章，王丙云，卢瑜，冼伟杭，蓝奕琦，郭建波，罗惠娜，白银山，计慧琴，陈胜锋，陈志胜，刘璨颖. 犬脐带间充质干细胞来源外泌体修复皮肤创伤[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(25): 4021-4027.

Zhan Xiao-shu, Luo Dong-zhang, Wang Bing-yun, Lu Yu, Xian Wei-hang, Lan Yi-qi, Guo Jian-bo, Luo Hui-na, Bai Yin-shan, Ji Hui-qin, Chen Sheng-feng, Chen Zhi-sheng, Liu Can-ying. Effects of exosomes derived from canine umbilical cord mesenchymal stem cells on canine skin wound[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(25): 4021-4027.

图/表（结果） 2

2.1 犬脐带间充质干细胞的培养与鉴定 细胞贴壁24 h后进行第1次换液，可见散在的短梭形细胞贴壁，部分增殖形成细胞集落，呈玫瑰花状(图1A)。原代培养7 d后，细胞增殖速度加快，密度明显增加，此时细胞呈长梭形生长(图1B)。培养至第10天时，细胞长满至90%，此时细胞形态均一，活性良好，可进行传代(图1C)。传代后细胞快速增殖，2∶1传代时每一两天可传代1次。由生长曲线图可看出，犬脐带间充质干细胞在P3代时活性最好，增殖最快，随着代数的增加，其增殖速率降低(图2)。P3、P6、P9群体倍增时间分别为23 h、37 h和70 h。免疫荧光检测，犬脐带间充质干细胞的细胞表面CD44呈阳性表达(图3A-C)，CD34呈阴性表达(图3D-F)，符合间充质干细胞特性；将P3代细胞进行成骨分化10 d后形成大量钙结节，用茜素红染色可染成红色(图4B)，成脂分化21 d后形成透亮脂滴，用油红O可染成红色(图4D)。

2.2 犬UC-MSC-EXO的鉴定结果 透视电镜下观察，分离和提纯的犬UC-MSC-EXO呈杯托状(图5)，NTA粒径检测显示其大小在30-200 nm，集中在84 nm(图6)。Western Blotting结果显示，犬UC-MSC-EXO表达特异性的外泌体表面蛋白CD81、CD63和CD9(图7)。以上特性表明，分离获得的囊泡体即为外泌体。

2.3 犬UC-MSC-EXO治疗犬皮肤创伤情况 犬全层皮肤损伤模型造模后，未见明显红肿热痛现象，饮食和精神状态均正常。在第3天时，模型组伤口处出现较多黄色浓稠炎症产物，而外泌体组伤口则无明显炎症反应；治疗12 d后，两组伤口面积均大幅变小，肉芽组织增生填满伤口，并从四周向中央开始上皮化，但外泌体组较模型组上皮化更为明显；治疗3周后，外泌体组的犬只伤口开始愈合，且伤口较为光滑、平整(图8)。

2.4 犬UC-MSC-EXO治疗后犬血液常规指标的变化 从表1可知，造模前两组白细胞总数无差异。造模后3 d 模型组的白细胞数迅速上升，较造模前提高了33%，而外泌体组只升高了10.3%；从第8天开始，模型组的白细胞总数下降，以后一直与外泌体组相近；模型组中性粒细胞数在造模第3天快速升高，而后缓慢降低，而外泌体组在治疗过程中升高较缓慢；两组在治疗过程中淋巴细胞数量和红细胞数量均无显著差异(见表1)。

2.5 犬UC-MSC-EXO对犬皮肤创伤面积和愈合速度的影响 从表2可见，从伤口愈合情况来看，在治疗第8和12天时，外泌体组创面面积较模型组小，愈合速度较快，但两组的创面面积和愈合速度无显著差异(P > 0.05)。

2.6 犬UC-MSC-EXO治疗后犬皮肤创伤病理组织学观察 从图9可见，第1周时伤口均被结缔组织增生形成的肉芽组织填满，此时增生组织中存在大量纤维细胞，开始形成形状较不规则的单个胶原纤维，由于表皮组织的再生能力远弱于结缔组织，此时还未见表皮层形成。模型组增生组织较外泌体组生长状况差，表面粗糙不平，有较多炎性细胞堆积，并且开始有脂肪细胞出现；第2周时两组伤口表皮均开始生长，均未见角质层及毛囊、皮脂腺、汗腺等皮肤附属结构，但外泌体组伤口再上皮化程度优于模型组；第4周时两组伤口均完全愈合，形成真皮层和表皮层，外泌体组胶原纤维排列成束较模型组更规则，外泌体组可见有汗腺导管再生，两组均未见明显皮脂腺、毛囊再生和角质层形成。

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引言

随着国内人民生活水平的提高以及人口老龄化趋势的加剧，犬作为人类的重要伴侣动物，饲养量大幅增加。皮肤损伤是犬常见疾病，可由多种因素如咬伤、车祸和烫伤等引起。当前治疗皮肤创伤的方法存在易继发感染、伤口愈合时间长、形成瘢痕和无毛囊再生等问题^[1]。干细胞具有抑制炎症反应、增加愈合速度等优势，可为皮肤损伤治疗提供新方法。间充质干细胞是一种来源于中胚层、具有自我更新和多向分化潜能的多能内源性干细胞，可从多种组织器官，如骨髓、脂肪、胎盘和脐带中分离获得，可分化成脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞心肌细胞等多种细胞系^[2-7]。间充质干细胞具有归巢性，能迁移到身体损伤部位发挥作用，并具有免疫原性低、旁分泌能力强和多向分化等特点，成为疾病治疗的最理想种子细胞^[8-11]。作者前期实验表明，将异体犬骨髓间充质干细胞悬液注射至皮肤创口周围可抑制的炎症反应，促进创伤修复^[6]。Formigli等^[12]实验也证明了间充质干细胞能促进皮肤再生，增加血管生成。人们过去一直认为间充质干细胞治疗疾病的机制是其到达损伤组织后快速增殖并分化、替代受损细胞。后来研究发现，间充质干细胞来源的外泌体具有抑制炎症、促进皮肤细胞增殖和血管再生、减少肌成纤维细胞积累的作用，表明间充质干细胞主要通过旁分泌方式修复损伤^[13]。Kim等^[14]实验也说明间充质干细胞的条件培养基中含有多种与皮肤年轻化相关的因子，间充质干细胞分泌的外泌体能促进皮肤损伤愈合。为进一步证明间充质干细胞分泌的外泌体对皮肤创伤的修复作用，为犬和人类皮肤创伤治疗提供新方法和新药物，此次实验以犬为实验对象，研究脐带间充质干细胞来源的外泌体(exosome derived from umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSC-EXO)对皮肤损伤愈合的影响，并探讨其作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 动物实验于2017年5月至9月在佛山科学技术学院动物房进行。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 动物实验方案经佛山科学技术学院伦理委员会审议通过。四五月龄的健康中华田园犬12只，由佛山科学技术学院提供，许可编号：FSUeae2018001，雌雄各半，随机分成模型组和外泌体组2组，每组6只。动物房环境相对湿度40%-60%，室内温度25 ℃，犬单只笼养，定时喂食，自由饮水。

1.3.2 实验主要试剂 DMEM培养液、0.25%胰蛋白酶、青霉素-链霉素双抗溶液均购自Hyclon公司；间充质干细胞成骨分化诱导液购于BI公司，成脂诱导液购于Cyagen公司；CD34和CD44抗体(abcam公司)，FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)和FITC标记山羊抗兔IgG(H+L，Beyotime公司)。

1.3.3 实验主要仪器设备 高压灭菌锅(Hirayama型，广州易祥科教仪器有限公司)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，HHS型电热恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，离心机(5 810 R，eppendorf)，倒置显微镜(CKX41，OLYMPUS公司)，CO₂培养箱(SHEL LAB公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 犬脐带间充质干细胞的原代培养 取新生犬脐带组织，在超净工作台中剔除膜组织和血管组织，剩余的胶质组织清洗干净后用无菌解剖剪剪至1 mm²大小，然后将组织转移至15 mL离心管中，加入1 g/L的Ⅰ型胶原酶，拧紧瓶盖置于37 ℃水浴锅中消化4 h，待组织块基本消化完毕后用100目细胞筛过滤，滤液经1 200 r/min，离心5 min，弃上清，沉淀部分用DMEM完全培养基(88%DMEM基础培养基+1%双抗溶液+1%L-谷氨酰胺)重悬，将悬液接种至细胞培养皿中，然后置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。细胞培养至24 h，弃去原培养液，用1×PBS清洗2次后换用新鲜培养基，以后每隔两三天换液1次。每天观察细胞生长状况，直至细胞铺满培养皿的80%时，用0.25%胰蛋白酶进行消化和传代。

1.4.2 犬脐带间充质干细胞的鉴定 取生长良好的P3代犬脐带间充质干细胞，用胰酶消化后接种于明胶包被的24孔板中，将细胞培养过夜或待细胞贴壁，取出、进行免疫荧光鉴定其细胞表面CD34、CD44的表达情况。

取生长良好P3代犬脐带间充质干细胞，用胰酶消化后接种于明胶包被的12孔板中，然后根据MSC成骨、成脂诱导分化培养基的使用说明对细胞进行成骨和成脂诱导分化，待分化完成后分别进行茜素红和油红O染色。

1.4.3 犬UC-MSC-EXO的分离与鉴定

犬UC-MSC-EXO的分离：用含体积分数10%无外泌体胎牛血清、1%双抗、1% L-谷氨酰胺和88% DMEM基础培养基配制成的完全培养基培养P3-P5代脐带间充质干细胞，收集上清，在4 ℃、300×g离心10 min除去死细胞；收集上清后在4 ℃、16 500×g离心20 min除去细胞碎片；收集上清后用0.22 μm的滤膜过滤除去大于220 nm的微粒；收集上清后用低温超高速离心法沉淀外泌体，弃上清后用生理盐水重悬沉淀再次离心得到较纯净外泌体沉淀，用1 mL生理盐水重悬后置于-80 ℃冰箱中保存备用。

犬UC-MSC-EXO的鉴定：①透视电镜鉴定外泌体形态：将外泌体样品溶液滴于碳支持膜上静置15 min后用滤纸吸走周围液体，再往膜上滴加3%磷钨酸溶液，静置10 min后用滤纸吸走周围水分后自然晾干。使用透视电镜Hitachi TEM System观察外泌体形态，并采集照片；②Western Blot 鉴定外泌体表面蛋白CD9、CD63和CD81表达情况。按照常规操作方法，将UC-MSC-Exo经15% SDS-PAGE电泳后，电转至硝酸纤维膜，室温封闭1 h后分别加入兔抗CD9、CD63、CD81以及内参β-actin，室温孵育2 h，用TBS清洗3遍，加入碱性磷酸酶标记羊抗兔IGg(1∶500)，室温孵育2 h，用TBS清洗3遍，加入显色剂显色10 min，待蛋白条带显色清晰时终止反应拍摄照片。

1.4.4 犬UC-MSC-EXO对犬皮肤损伤的治疗实验

犬皮肤损伤模型的建立：犬麻醉后进行局部脱毛、消毒、铺巾，无菌操作下在犬背正中、肩胛骨以下做4 cm×4 cm的正方形皮肤全层切口。

犬UC-MSC-EXO的局部注射：伤口模型建立后，随即在伤口周围分4个点进行皮下注射外泌体，每个点距离切口1 cm，入针方向朝着伤口，避免针尖穿透皮层。外泌体组皮下注射1 mL含300 mg/L外泌体的溶液，模型组则皮下注射1 mL生理盐水。注射完毕后伤口敷上3 M Tegaderm Film敷料，将实验犬移出手术室，观察是否出现异常，直至其完全清醒。

伤口评估及治疗效果评价：治疗后每天观察伤口情况，测量体温。于造模前和治疗后第3，8，15天进行采血做血常规检查，主要检测其白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和红细胞指标。于治疗后的第8和12天分别绘出未愈合创口范围，计算其面积和创口愈合率。于第1，2，4周分别取下皮肤创面组织用体积分数4%甲醛溶液固定后制作组织切片，苏木精-伊红染色后，进行病理组织学观察。记录伤口完全愈合的天数，计算创口愈合速度。

1.5 主要观察指标 ①犬脐带间充质干细胞的培养与鉴定；②犬UC-MSC-EXO的鉴定结果；③犬UC-MSC-EXO治疗犬皮肤创伤情况、治疗后血液常规指标变化及创面病理组织学变化。

1.6 统计学分析 采用SPSS Statistics 17.0统计软件进行单因素方差分析(ANOVA)，结果以x(_)±s表示。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

间充质干细胞作为细胞治疗最有希望的种子细胞，其与胚胎干细胞相比，避免了伦理和道德的争议，其愈来愈成为细胞治疗研究的热点^[15]。间充质干细胞被定义为是具有自我能更新和不同分化能力的异质性细胞群^[16]，由于其没有特异性的表面蛋白，因此只能通过一系列表面蛋白的表达和其多向分化的能力来鉴定，其中CD44、CD90、CD105、CD73、CD166呈阳性表达，CD31、CD34、CD144、HLA-DR呈阴性表达^[17-19]，并且其能进行成脂、成骨和成软骨三向分化^[20-21]。脐带作为产后废弃组织，具有来源广泛、成本低廉的特点，且脐带来源的间充质干细胞较其他来源的间充质干细胞具有更高增殖活性^[22]。因此作者选用脐带来源间充质干细胞作为治疗细胞。该实验分离获得的脐带间充质干细胞呈梭形贴壁生长，表达间充质干细胞表面标记CD44，不表达造血干细胞表面标记CD34，并且具有成脂和成骨分化特性，符合间充质干细胞的生物学特性。

间充质干细胞能以囊泡的形式向外界释放信息分子，外泌体是其中体积最小的，直径只有30-200 nm。外泌体中包含丰富的非编码RNA和蛋白质等，能在细胞间进行信息传递，其具有生物相容性、生物屏障通透性、低毒性和低免疫原性的特性，因此适合用于输送到机体内进行疾病治疗^[23-25]。到目前为止，外泌体的分离方法主要有低温超高速离心法^[26-27]、密度梯度离心法^[27]、免疫磁珠法^[28]、超滤离心法等^[29]，低温超高速离心法作为最常用的方法，具有分离样品量大且较纯净的特点，因此实验选用此方法分离得到外泌体。电镜下呈杯托状，NTA分析表明其粒径多集中在84 nm，Weatern blot结果表明其表达CD9、CD63和CD81三个表面蛋白，符合外泌体的生物学特性。多项研究证实外泌体在细胞治疗中起着关键的作用，Timmer等^[30]在小鼠心肌缺血/再灌注损伤的猪和小鼠模型中，静脉注射间充质干细胞条件培养基，发现能使心肌梗死面积分别降低60%和50%，进一步确认起作用的活性介质的大小在50-200 nm范围内。Lai等^[31]在随后的生物物理学研究中确定真正起作用的生物活性成分是分泌的外泌体。Martinez等^[32]发现从人胚胎来源间充质干细胞分离到的条件培养基能减少小鼠心肌梗死模型中梗死的面积，而除去外泌体的条件培养基则无此功能。

抑制炎症反应是间充质干细胞来源外泌体治疗疾病的一大显著作用。Yang等^[33]发现间充质干细胞外泌体能改善神经炎症，促进神经构成和血管再生。Yu等^[34]将人脐带间充质干细胞来源的外泌体注入到视网膜损伤的小鼠模型中发现其可抑制细胞凋亡，抑制炎症反应。间充质干细胞外泌体在肺部、肝脏、皮肤及心血管等疾病的治疗中均显示出对炎症反应的抑制作用^[35-36]。此次实验将脐带间充质干细胞来源外泌体注射于皮肤切口周围，发现在第3天时，模型组伤口出现较多黄色浓稠炎症产物，而外泌体组伤口则无明显炎症反应；第8天时模型组白细胞及中性粒细胞总数较外泌体组升高幅度大，两组结果都显示出外泌体对炎症反应的抑制作用，与Yu等的实验结果相一致。但这种抑制作用在后期则不明显，原因可能是实验后期模型组的伤口炎症反应缓解，白细胞数目下降或实验过程中只注射一次外泌体悬液，实验后期外泌体在体内降解，作用减弱，具体影响实验的因素还有待研究。

人们已广泛研究了间充质干细胞来源的外泌体在皮肤损伤模型中的作用，发现其能促进成纤维细胞活化的胶原蛋白和弹性蛋白的分泌，诱导上皮细胞增殖和血管形成，促进皮肤创伤的再上皮化，防止肌纤维形成^[24]。在小鼠皮肤缺损模型中，脐带间充质干细胞来源外泌体能减少肌成纤维细胞积累和瘢痕形成，Fang等^[37]认为这可能是由外泌体中微小RNA抑制TGF-β/SMAD2过程实现的。大鼠皮肤烧伤模型中，人脐带间充质干细胞来源的外泌体能明显加速伤口再上皮化，并促进体内CK19、PCNA、Ⅰ型胶原表达，还能在体外促进皮肤细胞增殖和抑制凋亡^[38]。张斌等^[39]实验证明人脐带间充质干细胞来源外泌体通过转运Wnt4活化皮肤的β-catenin信号促进皮肤烫伤模型的修复；UC-MSC-EXO中介导的14-3-3ζ通过加强Hippo-YAP通路协调自身Wnt4信号，预防损伤后皮肤组织过度增生和瘢痕形成。此次实验中也显示出间充质干细胞来源外泌体对皮肤伤口愈合的促进作用，其能加快愈合速度，促使伤口形成更为光滑平整的愈伤组织。

总之，实验成功分离和鉴定了犬脐带来源的间充质干细胞及其外泌体，同时证实犬UC-MSC-EXO在犬皮肤全层损伤模型中能抑制炎症发生、促进创口愈合，为间充质干细胞外泌体成为皮肤创伤治疗新制剂提供了实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

犬脐带间充质干细胞来源外泌体修复皮肤创伤

Effects of exosomes derived from canine umbilical cord mesenchymal stem cells on canine skin wound

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