二仙汤对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及骨向分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0940

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (25): 3963-3968.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0940

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

二仙汤对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及骨向分化的影响

吴琪^1，2，刘波^1，2，陈志¹，徐彭^1，2

¹江西中医药大学，江西省南昌市 330004；²江西省中药药理学重点实验室，江西省南昌市 330004

修回日期:2018-05-19 出版日期:2018-09-08 发布日期:2018-09-08
通讯作者: 刘波，博士。江西中医药大学，江西省中药药理学重点实验室，江西省南昌市 330004
作者简介:吴琪，女，1992年生，江西省九江市人，汉族，2015年于赣南医学院毕业。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81560723)；江西省自然科学基金项目(20151BAB205072)；江西省卫生和计划生育委员会科技项目(2015B027)

Effect of Erxian Decoction on proliferation and bone differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in ovariectomized rats

Wu Qi^{1, 2}, Liu Bo^{1, 2}, Chen Zhi¹, Xu Peng^{1, 2}

¹Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China; ²Jiangxi Provincial Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China

Revised:2018-05-19 Online:2018-09-08 Published:2018-09-08
Contact: Liu Bo, M.D., Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China; Jiangxi Provincial Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China
About author:Wu Qi, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China; Jiangxi Provincial Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81560723; the Natural Science Foundation of Jiangxi Province, No. 20151BAB205072; and the Science and Technology Project of Jiangxi Provincial Health and Family Planning Commission, No. 2015B027

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨向分化：是指间充质干细胞在特定条件下，可被诱导为成骨细胞，此功能多用于骨病，如骨质疏松症的防治。通过促进间充质干细胞骨向分化可促进成骨细胞数量、分化及矿化，也可用于骨组织工程研究。
全骨髓贴壁法的特点：全骨髓贴壁法利用骨髓间充质干细胞的贴壁特性将其与造血细胞分离，通过换液、传代进一步纯化和扩增。与免疫磁珠法和密度梯度离心法相比，该法操作简便，对细胞干预小，提取过程中最大程度地保留了骨髓中其他干细胞和基质细胞所分泌的生长因子，利于原代细胞的贴壁及生长。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞参与骨形成，研究表明二仙汤能防治骨质疏松症，但对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞的作用并不清楚。
目的：通过研究二仙汤对骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞增殖及骨向分化的影响，探讨二仙汤防治骨质疏松与骨髓间充质干细胞之间的关系。
方法：将大鼠随机分为6组，分别为假手术组、模型组、雌激素组、二仙汤高、中、低剂量组。以去卵巢法复制大鼠骨质疏松模型，除假手术组外，其他各组均手术彻底摘除卵巢。假手术组、模型组大鼠灌胃生理盐水，雌激素组大鼠灌胃戊酸雌二醇(0.08 g/L)，二仙汤给药组大鼠灌胃二仙汤提取液(含生药量分别为1.2，0.8，0.4 g/mL)，给药剂量为10 mL/kg，连续给药90 d。全骨髓贴法分离骨髓间充质干细胞，MTT法绘制细胞生长曲线，碱性磷酸酶检测试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活力，茜素红染色法检测细胞钙结节变化。
结果与结论：与模型组相比，高、中、低剂量二仙汤均可显著提高去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力(P < 0.01)；高、中、低剂量二仙汤明显改善去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活力(P < 0.05，P < 0.01)，中剂量二仙汤的改善作用最为显著(P < 0.01)；高、中剂量二仙汤可促进去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞钙结节的形成(P < 0.01)。结果证实，改善骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞增殖、骨向分化能力是二仙汤治疗骨质疏松症的内在机制之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9813-1329(吴琪)

关键词: 二仙汤, 骨髓间充质干细胞, 增殖, 骨向分化, 去卵巢大鼠, 组织工程

Abstract:

BACKGROUND: Some studies have shown that bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are involved in bone formation. Erxian Decoction can treat osteoporosis, but its relationship with BMSCs in ovariectomized rats is not yet clear.
OBJECTIVE: To reveal the relationship between Erxian Decoction and BMSCs by exploring the effect of Erxian Decoction on proliferation and differentiation of BMSCs in rats with osteoporosis.
METHODS: Sprague-Dawley rats were randomly divided into six groups: sham group, model group, estrogen group, high-dose Erxian Decoction group, middle-dose Erxian Decoction group and low-dose Erxian Decoction groups. Ovariectomy was performed to establish rat osteoporosis models in all the groups except the sham group. The rats in the sham group and model group were given normal saline via gavage, and those in the estrogen group were fed with estradiol valerate (0.08 g/L). Rats in the high-, middle- and low-dose groups were given high (1.2 g/mL), middle (0.8 g/mL) and low (0.4 g/mL) concentrations of Erxian Decoction extracts at a dose of 10 mL/kg, for 90 continuous days. BMSCs were isolated by whole bone marrow adherent method, MTT method was used to draw the growth curve of BMSCs, alkaline phosphates kit was used to detect alkaline phosphatase activity, and alizarin red staining was used to detect calcium nodules in BMSCs.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, high-, middle -, and low-dose Erxian Decoction significantly increased the proliferative capacity of BMSCs in ovariectomized rats (P < 0.01), and significantly improved alkaline phosphatase activity in BMSCs of ovariectomized rats (P < 0.05, P < 0.0.1). The highest activity of alkaline phosphatase in BMSCs was found after treatment with middle-dose Erxian Decoction (P < 0.01). High- and middle-dose Erxian Decoction also promoted the formation of calcium nodules in BMSCs (P < 0.01). These results indicate that to improve BMSCs proliferation and osteogenic differentiation in ovariectomized rats is one of the intrinsic mechanisms of Erxian Decoction in the treatment of osteoporosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Alkaline Phosphatase, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

吴琪，刘波，陈志，徐彭. 二仙汤对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及骨向分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(25): 3963-3968.

Wu Qi, Liu Bo, Chen Zhi, Xu Peng. Effect of Erxian Decoction on proliferation and bone differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in ovariectomized rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(25): 3963-3968.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 纳入大鼠24只均进入结果分析，无死亡与感染，无脱失值。

2.2 二仙汤能促进SD大鼠BMSCs生长速率 从图2中可以看出，与假手术组相比，模型组生长曲线全程较平缓，进入对数生长期耗时较长(第4天起进入对数生长期)，表明骨质疏松可降低大鼠BMSCs增殖能力，呈现衰老现象。从第2天起，各组BMSCs增殖速度加快，生长速率开始出现差异，模型组增殖速率最低，假手术组增殖速率最高，其次是二仙汤低剂量组、二仙汤中剂量组、雌激素组。从第3天起，与模型组相比，各组BMSCs生长速率差异增加(P < 0.01)，细胞进入对数生长期，趋势大致相同。第7天各组BMSCs增殖进入平台期，生长速率趋于平稳，细胞生长速率不再增加，与模型组相比，假手术组和各给药组细胞的生长速率呈差异非常显著(P < 0.01)。

2.3 二仙汤提高骨质疏松大鼠BMSCs碱性磷酸酶活力 图3显示，与假手术组相比，模型组碱性磷酸酶活力明显降低，说明骨质疏松可使BMSCs的碱性磷酸酶活力降低。与模型组相比，雌激素组BMSCs碱性磷酸酶活力增加趋势，但无显著性差异。而二仙汤高、中、低剂量组BMSCs碱性磷酸酶活力显著提高(P < 0.05)，尤其以二仙汤中剂量组为甚(P < 0.01)，说明二仙汤能促进BMSCs的骨向分化，其改善骨质疏松症可能与此有关。

2.4 二仙汤提高骨质疏松大鼠BMSCs矿化钙结节形成 骨质疏松多表现骨量降低，骨结构破坏，细胞层面则出现骨形成相对减少。模型组BMSCs矿化钙结节形成较低，而与模型组相比，雌激素组、二仙汤高及中剂量组BMSCs矿化钙结节形成均明显增强，其中以雌激素组最为明显,但二仙汤低剂量组BMSCs矿化钙结节形成并无明显提高，见图4，5。这说明一定剂量的二仙汤能促进BMSCs矿化钙结节形成，促进骨形成，改善骨质疏松症。

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引言

骨质疏松症是一种以骨量降低、骨脆性增加、骨组织显微结构破坏、易发生骨折为特征的全身代谢性疾病。随着世界人口老年化程度的增高，骨质疏松症的发病率也在逐年上升，其中绝经后骨质疏松症的发病率尤为明显^[1]。骨质疏松症的主要临床表现为腰背四肢疼痛、身高缩短、驼背及骨折等，在中医古籍中多属“骨痛”与“骨痿”等范畴，其病因主要是肾虚。中医学理论认为，肾藏精，主骨生髓，骨的生长发育赖于肾中精气的滋养与推动^[2-3]，肾精不足则骨缺乏滋养。

二仙汤由仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归、黄柏及知母等中药组成，仙茅、淫羊藿、巴戟天温补肾阳，滋补肾精；佐以知母、黄柏滋补肾阴、泻肾火；而当归则养血活血，调理冲任为使药。全方补肾壮阳药与滋阴泻火药并用，适合用于阴阳俱虚的复杂症侯^[4-5]。

现代研究认为骨质疏松症产生的根本原因是骨形成与骨吸收的失衡，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是存在于骨髓基质中的成体干细胞，进一步可分化为前成骨细胞及成熟成骨细胞，为骨形成提供细胞来源，其分化为成骨细胞对促进骨形成有着重要的作用^[6-7]，研究发现BMSCs骨向分化或脂向分化失调可导致骨质疏松症^[8-9]，去卵巢骨质疏松大鼠的增殖能力降低，骨向分化能力减弱同时脂向分化能力增强^[10]。因具有多向分化潜能，尤其是对成骨方面的分化能力，BMSCs可用于骨质疏松症的治疗^[11]，研究表明对于体外分离培养的BMSCs注入去卵巢骨质疏松模型大鼠的骨髓腔，能促进原发性骨质疏松性骨折愈合^[12]。

多项研究表明BMSCs的功能与骨质疏松症密切相关^[13]，二仙汤作为治疗骨质疏松症的名方，其对于骨质疏松患者及骨质疏松模型动物的骨密度、骨小梁厚度等指标有改善作用^[14-15]，增强体外培养成骨细胞增殖及骨形成能力^[16]，但其对BMSCs的影响还不甚清楚。实验旨在探究二仙汤治疗骨质疏松症与BMSCs间的关系，揭示二仙汤治疗骨质疏松症的初步机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 动物体内给药和细胞学体外观察结合实验。

1.2 时间与地点 于2016年7至12月在江西中医药大学江西省中药药理学重点实验室完成。

1.3 材料

实验动物：SPF级雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，8周龄，体质量180-220 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SYXK(赣)2014-0008，恒温，实验期间自由饮食、水，连续灌胃给药90 d后，在分离原代BMSCs前12 h禁食。

药物：二仙汤方中的中药饮片当归、巴戟天、淫羊藿、黄柏、仙茅及知母均由江西樟树天齐堂中药饮片有限公司提供，江西中医药大学药学院付小梅副教授分别鉴定为当归(Angelica sinensis (Oliv.) Diels)，巴戟天(Morinda officinalis HOW)，朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai.)，黄柏(Phellodendron chinensis Schneid.)，仙茅(Curculigo orchioides Gaertn.)及知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)。戊酸雌二醇由拜耳医药保健有限公司(批号：306A)生产。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨质疏松模型的构建 体积分数3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，俯卧位固定，经腹背部肋缘下1 cm，脊柱两侧各1.5 cm交界处，切开皮肤进入腹腔，拨开脂肪层找到卵巢，剪除并结扎。假手术组各大鼠的处理步骤与卵巢摘除过程相同，但只将卵巢移出并复位，并不摘除卵巢^[17-18]。

依据雌性大鼠动情周期的特点^[19]，术后第2天起采用阴道涂片检查法，1次/d，连续观察10 d，筛选出无规则动情变化的大鼠即为卵巢切除的模型大鼠。

1.4.2 二仙汤的制备 按照二仙汤中药方比例2∶2∶2∶2∶1∶1，分别称取淫羊藿、仙茅、当归、巴戟天、知母及黄柏等中药饮片。采取统一煎煮标准，加入双蒸水浸没药材3-5 cm，浸泡30 min，以武火煮沸，然后再文火慢煎30 min，过滤药液保存，并将药渣按上法重新煎煮1次^[20]。合并2次滤液浓缩成二仙汤高浓度提取液(生药1.2 g /mL)，用时根据需要稀释使用。

1.4.3 分组及给药 实验SD大鼠分为6组，即假手术组、模型组、雌激素组、二仙汤高剂量组、二仙汤中剂量组和二仙汤低剂量组，每组4只，其中筛选出的卵巢彻底切除大鼠随机分为模型组、雌激素组和二仙汤高、中、低剂量组，仅作手术切开未切除卵巢的大鼠则为假手术组。二仙汤高、中、低剂量组分别灌胃对应浓度的二仙汤(含生药量分别为1.2，0.8，0.4 g/mL)，假手术组和模型组灌胃生理盐水，雌激素组灌胃戊酸雌二醇混悬液(0.08 g/L)，给药容积均为10 mL/kg，连续给药90 d。

1.4.4 全骨髓贴壁法分离BMSCs及传代培养 将SD鼠脱臼处死，于体积分数75%乙醇中浸泡，无菌条件下取胫骨和股骨，将两端干骺端切除，显露骨髓腔，用低糖DMEM完全培养基(体积分数10% FBS、1%双抗)彻底冲洗骨髓腔，200目筛网过滤，低速离心1 000 r/min×5 min，5 mL新鲜完全培养基重悬，制成细胞悬液，调整细胞浓度为10⁹ L^-1，转移至培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养^[21-22]。至第7天半量换液1次，之后每隔3 d全量换液，并以倒置显微镜观察细胞形态和生长，此即为P₀代^[10]。待细胞融合至80%-90%，弃培养液，PBS清洗3次，体积分数0.25%胰酶消化进行传代扩增(即为P₁代)。

取生长状态良好的P₁代BMSCs，显微镜观察照相(图1)，消化制成单细胞悬液并计数，使得细胞数为10⁶ L^-1。用直接免疫荧光法针对细胞表面抗原检测细胞免疫表型^[23]，用胎牛血清配制的FACS缓冲液1 500 r/min离心3 min进行重悬洗涤后，加入一抗室温避光孵育30 min，PBS 3 000 r/min洗涤离心，3次后，采用10 g/L多聚甲醛固定，4 ℃避光保存，送江西省人民医院进行流式细胞仪检测。

流式细胞仪检测后发现CD90，CD44阳性表达率分别为94.9%和92.1%，而CD45，CD11b/c阳性比率分别为11.9%和0.1%，表明P₁细胞中绝大多数为大鼠BMSCs，可用于后续实验。

1.4.5 骨质疏松大鼠P₁代BMSCs生长曲线的绘制 各组分别取生长良好的P₁代BMSCs，根据细胞培养8 d的实验要求，分别以2×10³个/孔接种于8个96孔板，每孔终体积为200 µL。接种培养24 h后，在培养1 d的培养板接种孔内加入MTT(5 g/L)20 µL，4 h后终止培养，每孔内加入150 µL DMSO，摇床震荡10 min，使沉淀充分溶解，在酶标仪测定490 nm处吸光度值。其他各板则分别按照实验要求，在接种培养2-8 d后，以同样的方法测定吸光度(A)值。计算细胞生长速率K，K为每孔A值除以该组第1天对应孔的A值，即K_n= A_n/A₁，1≤n≤8，n为天数，以时间为横坐标，细胞生长速率K平均值为纵坐标，绘制BMSCs生长曲线^[24]。

1.4.6 BMSCs碱性磷酸酶活力的检测 取P₁代BMSCs，分别以2×10³个/孔接种于24孔板，每隔3 d换液1次，第4天吸弃孔内培养基，PBS清洗3次，每孔加入体积分数1% Triton X-100，4 ℃裂解30 min，收集裂解液，然后加入96孔板内，每孔30 µL，按照微板法碱性磷酸酶试剂盒说明书检测细胞碱性磷酸酶活力。

1.4.7 BMSCs矿化钙结节生成的检测 取P₁代BMSCs，分别以2×10³个/孔接种于24孔板中，每组设3个复孔，每隔3 d换液1次，第21天吸弃孔内培养基，PBS清洗数次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗，体积分数0.1%茜素红于37 ℃染色30 min，蒸馏水冲洗，光镜下观察照相。利用氯化十六烷基吡啶溶解茜素红原理，加入100 g/L的氯化十六烷基吡啶，置于摇床上振荡30 min，于570 nm处检测A值。

1.5 主要观察指标 BMSCs生长曲线，细胞碱性磷酸活力，矿化钙结节形态。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计学软件处理数据，计量资料采用x(_)±s表示，数据符合正态分布，方差齐，采用单因素方差分析比较组间差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

BMSCs具有多向分化潜能，可分化为软骨细胞，成为工程化软骨的主要来源^[25]；或分化为成骨细胞，常成为骨质疏松、外伤时促进骨组织再生的靶细胞^[26]，因此在治疗骨科疾患尤其是在成骨分化方面有独特的作用。研究显示，BMSCs在治疗雌激素缺乏导致的骨质疏松症中发挥作用^[27]，实验采用去卵巢法复制大鼠骨质疏松模型，模拟绝经后骨质疏松症，通过观察BMSCs的生长发现，去卵巢骨质疏松大鼠的BMSCs细胞生长缓慢，这与文献报道去卵巢骨质疏松大鼠的BMSCs细胞增殖能力和成骨分化能力降低有相似之处^[28]。

有学者从中医方向阐述“肾精-骨质疏松症-BMSCs”3者之间的关系，认为BMSCs在可向成骨转化，在中医学中属于“精”和“髓”范畴^[29]。BMSCs 在细胞增殖、分化、生物发育机制等方面与中医学“肾精”在生命个体中的生长、发育和衰老等过程有相似之处，肾精的主要功能几乎都可以从BMSCs的增殖、分化特征中得到体现^[30]，此理论为补肾中药治疗骨质疏松症提供了更多支持。二仙汤全方温而不燥，寒而不滞，具有补肾阳滋肾阴、调和阴阳之功效。实验发现其可改善雌激素受体表达，抑制骨质疏松^[31]。研究表明，二仙汤可提高骨质疏松大鼠骨密度、骨小梁厚度，改善去卵巢大鼠骨质疏松症^[32]，促进成骨细胞增殖及骨形成能力^[33]，但对于BMSCs的作用鲜有报道。实验结果显示二仙汤能明显促进去卵巢骨质疏松大鼠BMSCs的增殖，在接种后3-5 d生长明显增快，说明二仙汤能阻止BMSCs的衰老，促进细胞增殖及分化，增强细胞的活力，这与已报道的补肾中药对于BMSCs骨向分化的作用相似^[34]。

细胞碱性磷酸酶活力和矿化结节的形成是成骨细胞早期和中晚期分化的标志，对BMSCs而言则是表明BMSCs骨向分化的特征^[35-42]。实验研究发现，去卵巢骨质疏松大鼠BMSCs的碱性磷酸酶活力和矿化钙结节形成能力均明显降低，说明BMSCs的细胞增殖、分化可能是去卵巢大鼠致骨质疏松症产生的因素之一。而二仙汤能明显提高去卵巢骨质疏松大鼠BMSCs的碱性磷酸酶活力和矿化钙结节形成能力，在临床上又表现为防治骨质疏松症，这也表明二仙汤可能是通过促进BMSCs的生长，改善其骨向分化能力，促进骨形成，产生防治骨质疏松症的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

二仙汤对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及骨向分化的影响

Effect of Erxian Decoction on proliferation and bone differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in ovariectomized rats

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