ROCK抑制剂Y-27632促进人角质形成细胞增殖与调控衰老

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0800

摘要/Abstract

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文题释义：
Y-27632：是一种广泛应用的、高效的Rho相关卷曲蛋白激酶(ROCK)家族的小分子特异性抑制剂，参与了细胞内多种信号通路和调控细胞多种功能，不仅通过控制肌动蛋白骨架的组装调节细胞生长、黏附、迁移及凋亡等，同时能够调节干细胞的自我更新、促进克隆形成和存活。不仅如此，Y-27632对角质形成细胞体外培养的永生化也具有重要调节作用。
角质形成细胞：是一种能合成角质蛋白的上皮细胞，是表皮的主要成分，能够连续不断的分化与更新，从而使新生的细胞与脱落的角质细胞保持平衡，以达到维持表皮正常厚度。然而，由于角质形成细胞在体外生长缓慢、生命周期短、易分化和衰老等特点，限制了其体外扩增培养与生物学研究。因此，延长角质形成细胞体外增殖倍数，抑制其衰老，对皮肤生物学和皮肤相关疾病发病机制的研究具有重要的意义。

摘要
背景：促进角质形成细胞体外培养增殖能力对皮肤生物学和皮肤相关疾病发病机制的研究具有重要意义。
目的：观察Rho激酶抑制剂Y-27632对角质形成细胞增殖与衰老的影响。
方法：分离培养人角质形成细胞，通过形态鉴定观察Y-27632(10 μmol/L)对角质形成细胞形态的影响；利用群体倍增速率估算Y-27632对角质形成细胞增殖的影响；分别在角质形成细胞第0，5代，通过β-半乳糖苷酶细胞染色方法检测Y-27632对细胞衰老的作用；进一步通过MTT法和BrdU细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖情况。
结果与结论：人角质形成细胞为大小均一的铺路石样细胞，且在早期具有较强的增殖能力，随着细胞传代，增殖能力降低，且形态变为扁平的，胞浆增大的特点；Y-27632显著提高了细胞的群体倍增速率，通过β-半乳糖苷酶细胞染色显示，Y-27632降低了阳性细胞数，进一步通过MTT法和BrdU细胞增殖检测法得出，Y-27632促进细胞体外增殖。结果说明，人角质形成细胞体外过程中，Y-27632的加入不仅能够抑制细胞衰老，同时促进其增殖，为角质形成细胞体外扩增培养与研究提供了新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-2283-2700(央金)

关键词: Y-27632, 角质形成细胞, 增殖, 衰老, 群体倍增时间, β-半乳糖苷酶, MTT, BrdU, 皮肤生物学, Rho激酶, 组织工程

Abstract:

BACKGROUND: Facilitating the proliferation of keratinocytes in vitro is of great significance for the studies on dermatobiology and the pathogenesis of skin-related diseases.
OBJECTIVE: To investigate the effects of Rho kinase inhibitor Y-27632 on the proliferation and senescence of keratinocytes.
METHODS: Human keratinocytes were successfully isolated and the potential effect of Y-27632 (10 μmol/L) on the human keratinocytemorphology was investigated. The effect of Y-27632 on the proliferation of keratinocytes was investigated by population doubling curve; β-galactosidase staining was performed at P0 and P5 cells respectively to show the effect of Y-27632 on the senescence of keratinocytes. Finally, the proliferation of keratinocytes was detected by MTT assay and BrdU kit simultaneously.
RESULTS AND CONCLUSION: Human keratinocytes were of cobble-stone morphology and equal size, which kept great proliferation capacity at early stage. With the continuous passage of human keratinocytes, their proliferation capacity was declined gradually, showing a flat morphology and an enlarged cytoplasmic volume. The population doubling of human keratinocytes was increased significantly in the presence of Y-27632, and according to the β-galactosidase staining results, Y-27632 decreased the number of positive cells. Furthermore, the results of MTT assay and BrdU kit indicated that Y-27632 facilitated the proliferation of keratinocytes obviously in vitro. That is to say, when the human keratinocytes are cultured in the presence of Y-27632, the senescence of keratinocytes is inhibited. Meanwhile, the proliferation of keratinocytes is significantly increased, and our data shed new insight on the in vitro proliferation of human keratinocytes in future studies.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Cell Proliferation, Burns

中图分类号:

R318

央金，熊霞. ROCK抑制剂Y-27632促进人角质形成细胞增殖与调控衰老[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(24): 3869-3874.

Yang Jin1, 2, Xiong Xia1. ROCK inhibitor Y-27632 promotes proliferation of human keratinocytes and inhibits its senescence[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(24): 3869-3874.

图/表（结果） 1

2.1 Y-27632对人角质形成细胞活性和细胞形态的影响实验根据有无添加Y-27632(10 μmol/L)将人角质形成细胞分成对照组和Y-27632组，如图1A和C所示，在初始阶段(P0)两组原代人角质形成细胞均分裂活跃，胞体饱满，个体较小成骰子状，细胞形态均一性好。

随着细胞分裂传代至第8代时，如图1B所示，对照组细胞胞体变得宽大扁平，胞浆体积明显增大，细胞状态差且呈现高度异质性，形态发生明显变化呈现明显衰老之态；与之相反，Y-27632组细胞的形态仍与P0代细胞形态相似，且保持着活跃增殖的状态，见图1D。

以上结果表明ROCK抑制剂Y-27632能成功维持人角质形成细胞的形态和分裂活性，延缓细胞的衰老。

2.2 Y-27632对人角质形成细胞生长速度的影响前期已有文献报道显示Y-27632可以影响角质形成细胞的增殖和分化^[23-24]，为进一步探索抑制ROCK活性对人角质形成细胞远期生长的影响，实验将ROCK抑制剂Y-27632加入人角质形成细胞培养基中，以倍增速率为指标观察其对人角质形成细胞的生长和衰老的潜在影响。

结果如图2所示，代表对照组的人角质形成细胞的曲线斜率随着培养代数的增加而逐渐变小，提示随着时间的推移细胞的生长和分裂速度逐渐变缓，培养至约40 d时细胞几乎停止分裂而呈现明显的衰老态势。

Y-27632添加组细胞则保持了比较稳定的生长和增殖速度，且增殖速度较对照组明显加快；同时，该组细胞大约在培养60 d后才出现明显的衰老，衰老速度显著低于对照组细胞(图2)。

以上结果提示Y-27632可显著促进细胞的生长和增殖，且明显延缓原代人角质形成细胞的衰老速度。

2.3 Y-27632对人角质形成细胞衰老的影响为进一步证明Y-27632对人角质形成细胞的衰老的影响，实验β-半乳糖苷酶细胞染色的方法分别检测了两组细胞在不同时间点上的衰老情况。

结果如图3所示，在P0代两组细胞均少有衰老细胞出现(图3A，C)，且两组间无显著差异(P > 0.05)。而当细胞培养至P5代时，对照组细胞β-半乳糖苷酶阳性细胞数接近80%之多(图3B，E)，提示大部分细胞已出现衰老的迹象；而Y-27632组细胞如图3D所示，其阳性细胞数比例约为13%，阳性率远低于对照组细胞，两组间差异有显著性意义(P < 0.01，图3E)。

以上结果提示Y-27632可有效减少或延缓原代人角质形成细胞的衰老。

2.4 Y-27632对人角质形成细胞增殖的影响为探索Y-27632对人角质形成细胞增殖的影响，实验分别采用MTT法和BrdU法检测两组细胞增殖情况。

如图4A中MTT结果所示，对照组细胞培养至P5代之后，其增殖能力仅为P0代的约50%，增殖能力明显下降；而Y-27632组细胞在培养至P5代时，其增殖能力仍达P0代的80%，增殖能力显著优于对照组同一时期细胞，两组间差异有显著性意义(P < 0.01)。

BrdU法检测结果如图4B所示，其结果与MTT法结果类似，即Y-27632组细胞在培养至P5代后，其增殖能力显著强于对照组细胞(P < 0.01)。

以上两个实验结果一致表明，Y-27632能够促进或维持人角质形成细胞的增殖。

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引言

人成体细胞的寿命是有限的，随着年龄的增长，其都得经历生长速度逐渐变慢直至停止分裂这一细胞衰老的过程^[1-2]，该过程被认为是限制衰老细胞向疾病转化的重要自然反应。人角质形成细胞作为工具细胞在研究皮肤生物学和皮肤相关疾病的病理机制中起着无可替代的作用^[3-7]，但对其的研究却因培养人角质形成细胞寿命短而受到极大制约^[8-10]。为此研究者们对该细胞的培养条件进行了诸多的优化，比如加入成纤维饲养细胞将原代人角质形成细胞的增殖能力由原来的20代提高到了40-60代^[11-12]。同时自然永生化角质形成细胞系如HaCaT和NIKS在皮肤相关疾病的研究中也得到广泛应用^[13-14]，但是这些细胞系均有不同程度的基因变异，比如P53位点的突变和等臂染色体等^[14-15]，这使得其在很多生物和病理特性上与人角质形成细胞均有所差别。所以尽可能的延缓人角质形成细胞的衰老具有重要的理论和应用意义，如何优化人角质形成细胞的培养条件以保持其状态并延缓衰老也自然成为当前研究的热点。

Rho激酶是Ras超家族蛋白中的一个亚型，其在细胞的黏附、分裂和迁移等方面扮演着极其关键的角色^[16]。Rho相关卷曲蛋白激酶(Rho kinase，ROCK)正是Rho激酶通路的下游效应分子，在哺乳动物中其有ROCK1和ROCK2两个亚型，二者可以通过使其底物的丝氨酸和苏氨酸位点磷酸化而参与弹性纤维形成、细胞骨架稳定和细胞凋亡等生理或病理学过程^[17]。而ROCK的抑制剂如Y-27632和法苏地尔，则被发现对细胞行为学具有多元且深层次的影响，且在多个疾病领域展现了很好的治疗潜力^[18]。比如前期已有文献报道Y-27632通过诱导重组因子的方式在多能干细胞的诱导中起到极其重要的作用，并且可以提高诱导的效率^[19-20]。特别值得一提的是，已有研究报道提示抑制ROCK的活性可显著增加人胚胎干细胞和人角质形成细胞的克隆效率^[21-22]。

以上研究结果提示抑制ROCK活性对人角质形成细胞的增殖及其衰老过程可能也有某些方面的影响，但仍待实验证据予以证实，为此开展了当前研究以探究ROCK抑制剂Y-27632对人角质形成细胞的增殖和衰老是否有影响，以及其又是如何影响的。

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材料方法

1.1 设计细胞学实验。

1.2 时间及地点于2014年12月至2016年12月在重庆市涪陵中心医院皮肤科完成。

1.3 材料新鲜皮肤组织块来源于重庆市涪陵中心医院就诊的自体皮肤移植患者10例，年龄(20±10)岁，男性6例，女性4例。

所有的患者及家属被告知该研究目的和程序，并签署了知情同意书，研究方案经重庆市涪陵中心医院伦理委员会批准。

1.4 实验方法

1.4.1 人角质形成细胞分离与培养将患者自体皮肤移植手术后剩余的皮肤组织使用含有青霉素和链霉素的PBS (Gibco，美国，纽约)清洗3次后，放入含有Dispase酶(Sigma，美国)的15 mL离心管中4 ℃过夜，分离表皮和真皮组织后，将表皮置于含有体积分数0.05%胰蛋白酶(Gibco)的离心管中37 ℃消化约15 min，期间每隔两三分钟吹打数次，加入含有体积分数10%DMEM培养基(Gibco)终止消化，180×g转速离心5 min后，重悬细胞，细胞计数后，3×10⁶细胞铺于T75培养瓶中，使用角质形成细胞专用培养基KSFM进行培养(Gibco)，每隔2 d换液，待细胞完全汇合后进行传代培养。

1.4.2 生物学特性鉴定

群体倍增速率的估算：每次传代时，角质形成细胞消化后计数，并使用公式：3.32(log[传代时的细胞数/接种时的细胞数])，进行计算群体倍增数。

β-半乳糖苷酶细胞染色检测细胞衰老：将角质形成细胞铺于6孔板中培养，吸除细胞培养液，用PBS洗涤1次，然后加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液(碧云天，中国，上海)，室温固定15 min后，吸除细胞固定液，PBS洗涤细胞3次，每次3 min。加入1 mL染色工作液，37 ℃孵育过夜后，加入PBS 2 mL，普通光学显微镜下观察染色结果并计数。

细胞增殖检测：采用MTT法检测，分别将Y-27632 (10 μmol/L)处理和未处理的第0，5代角质形成细胞铺于96孔板中，培养24 h后，移去培养液，加入质量浓度为0.5 g/L的MTT(碧云天)37 ℃孵育4 h。弃去MTT后加入150 μL DMSO，避光条件下培养板剧烈摇晃10 min，并利用酶标仪测试570 nm下溶液的吸光值，每组实验至少重复3次并收集数据。

采用BrdU细胞增殖检测试剂盒进行检测(中昊生物，中国，北京)，分别将Y-27632(10 μmol/L)处理和未处理的第0，5代角质形成细胞铺于96孔板培养24 h后，加入BrdU 37 ℃孵育1 h，利用ELISA法检测细胞增殖情况。

1.5 主要观察指标细胞形态观察，群体倍增时间观察细胞增殖情况，β-半乳糖苷酶细胞染色观察细胞衰老情况，MTT与BrdU检测观察细胞增殖情况。

1.6 统计学分析数据采用x(_)±s来表示，采用Image J软件进行数据采集，组间数据差异的比较采用两样本t 检验，利用统计分析软件GraphPad Prism进行数据分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

Y-27632是可以对人角质形成细胞的增殖和衰老产生影响的。实验着力探究了ROCK抑制剂Y-27632对原代培养人角质形成细胞的增殖和衰老的影响。

实验结果显示人角质形成细胞体外过程中，Y-27632的加入不仅抑制能够细胞衰老，同时还能有力促进其增殖，该结果将为改进人角质形成细胞培养条件、延长人角质形成细胞寿命提供重要重要的线索，这可能有助于未来人来在体外快速获得大量的正常人角质形成细胞，并为人角质形成细胞的基础研究和临床应用奠定良好的理论和现实基础。

促进人角质形成细胞的增殖并延长其寿命具有重要的临床意义。人角质形成细胞是一种能合成角质蛋白的上皮细胞，其在体内可起到屏障作用而保护人体^[25-27]。然而在烧烫伤患者以及各种皮肤疾病患者中，其角质形成细胞遭到严重破坏而致使皮肤屏障功能丧失^[28]，如果能在体外将患者自身残存的人角质形成细胞进行有效的扩增并加以应用，将有效解决细胞来源和免疫排斥等棘手问题，从而更加安全可靠的造福广大患者^[29-35]。因此实验选择了人角质形成细胞为研究对象，试图寻找延缓其衰老和加快其增殖的培养条件。

实验根据ROCK的生理作用以及前期对ROCK抑制剂Y-27632的研究结果，推测Y-27632很可能可以影响人角质形成细胞的的增殖、衰老、分化等生物特性，因此实验选择观察Y-27632对原代培养人角质形成细胞衰老和增殖的影响。

实验结果显示，Y-27632可显著延缓人角质形成细胞的衰老，具体表现在当细胞培养至P5代时，Y-27632组提示细胞衰老的β-半乳糖苷酶细胞染色阳性细胞数较对照组显著减少；在后续的增殖实验中，MTT和BrdU结果一致表明，当加入Y-27632后，原代人角质形成细胞的增殖速度显著快于对照组细胞。

以上结果成功验证了实验之前的推测，即Y-27632可对原代人角质形成细胞的衰老和增殖产生影响，分别是延缓细胞的衰老并促进其增殖。这与前期Watanabe等^[21]和Terunuma等^[22]分别在人胚胎干细胞和人角质形成细胞观察到Y-27632可增加细胞增殖效率的结果一致，而且实验发现Y-27632不仅可促进人角质形成细胞的增殖，还进一步证实其还具有延缓人角质形成细胞衰老的作用。

因此，在原代人角质形成细胞的培养过程中抑制ROCK活性将有利于长时间的观察其生长和生物特性变化，利于更加深入探索原代人角质形成细胞衰老的机制，促进人角质形成细胞体外有效的扩增的临床难题的解决。

尽管实验结果已经证实Y-27632组的细胞衰老速度显著低于对照组，而增殖却明显优于对照组，但是其背后的分子机制仍不清楚。根据先前的文献报道，Y-27632发挥其生物作用可能是通过激活Akt通路、增强MYC活性或者磷酸化下游靶分子等方式来实现的^[23，36-37]，然而在此次实验条件下Y-27632发生作用的具体分子机制仍需进一步的实验加以探究和证实。

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