人脂肪干细胞及其外泌体的分离与鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0494

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (13): 2033-2038.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0494

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人脂肪干细胞及其外泌体的分离与鉴定

李洪超¹，金银鹏²，王皙¹，李莉²，王晓今²，周荣²，陈成伟²，傅青春²，程明亮³

¹贵州医科大学临床医学院，贵州省贵阳市 550004；²解放军第八五医院，上海肝病研究中心，上海市 200235；³贵州医科大学附属医院感染科，贵州省贵阳市 550004

修回日期:2018-01-20 出版日期:2018-05-08 发布日期:2018-05-08
通讯作者: 傅青春，硕士，主任医师，解放军第八五医院，上海肝病研究中心，上海市 200235; 并列通讯作者：程明亮，主任医师，贵州医科大学附属医院感染科，贵州省贵阳市 550004
作者简介:李洪超，男，1991年生，山东省菏泽市人，汉族，贵州医科大学临床医学院在读硕士，主要从事干细胞研究。并列第一作者：金银鹏，男，1988年生，重庆市人，汉族，硕士，主要从事干细胞研究。
基金资助:
南京军区医学创新重大课题(14ZX01)；中国肝炎防治基金会-天晴肝病研究基金资助课题(TQGB20150104)

Isolation and identification of human adipose-derived stem cells and its exosomes

Li Hong-chao¹, Jin Yin-peng², Wang Xi¹, Li Li², Wang Xiao-jin², Zhou Rong², Chen Cheng-wei², Fu Qing-chun², Cheng Ming-liang³

¹School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; ²the 85^th Hospital of PLA, Shanghai Research Center for Hepathopathy, Shanghai 200235, China; ³Department of Infection, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Revised:2018-01-20 Online:2018-05-08 Published:2018-05-08
Contact: Fu Qing-chun, Master, Chief physician, the 85th Hospital of PLA, Shanghai Research Center for Hepathopathy, Shanghai 200235, China; Cheng Ming-liang, Chief physician, Department of Infection, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Li Hong-chao, Master candidate, School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China. Jin Yin-peng, Master, the 85th Hospital of PLA, Shanghai Research Center for Hepathopathy, Shanghai 200235, China. Li Hong-chao and Jin Yin-peng contributed equally to this work.
Supported by:
the Medical Innovation Project of the Nanjing Military Region, No. 14ZX01; the Chinese Foundation for Hepatitis Prevention and Control-Sunshine Foundation for Hepatitis, No. TQGB20150104

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
外泌体：是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径为30-150 nm。人们发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。
超滤法：是一种膜滤法，它以多孔薄膜作为分离介质，依靠薄膜两侧压力差作为推动力来分离溶液中不同相对分子质量的物质。外泌体的提取方法有多种，比如超滤法、试剂盒沉淀法、蔗糖梯度离心法、超速离心法等。超滤法具有可重复利用、经济实惠、低损伤、简单易行、设备要求低等多种优势，在外泌体的提取过程中较其他几种方法更为常用。

摘要
背景：间充质干细胞如今在科研领域被广泛地研究和应用，许多研究认为其发挥作用的机制很大程度上依赖于其旁分泌的外泌体。
目的：分离纯化人脂肪干细胞来源的外泌体，并鉴定其生物学特性。
方法：采用胶原酶消化法获得人脂肪干细胞，进行细胞表面分子标志和成骨、成脂分化能力鉴定。运用超滤法从人脂肪干细胞条件培养基中提取外泌体，应用扫描电子显微镜、粒度仪观察所获外泌体的形态和大小，采用抗体芯片检测外泌体所含蛋白质表达。
结果与结论：①人脂肪干细胞呈梭形、漩涡状生长，细胞表面表达CD73、CD44、CD90、CD105分子，具备成脂、成骨等多向分化潜能，可证实为人脂肪干细胞；②大多数外泌体直径均在30-150 nm范围内；扫描电镜显示外泌体呈均一大小的圆杯形态；③抗体芯片显示外泌体含FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、ANXA5、TSG101等多种特殊蛋白；④以上结果表明实验成功分离得到人脂肪干细胞外泌体。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7141-8135(李洪超)

关键词: 外泌体, 干细胞, 间充质干细胞, 脂肪干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Currently, mesenchymal stem cells have been widely explored and applied in scientific research field, and many studies suggest that the underlying mechanism of mesenchymal stem cells mainly relies on its exosomes.
OBJECTIVE: To isolate and identify human adipose-derived stem cells and its exosomes, and to identify their biological characteristics.
METHODS: Human adipose tissue was digested with collagenase I, and adipose-derived stem cells were isolated and purified. Immunophenotype, osteogenic and adipogenic abilities of adipose-derived stem cells were identified. Exosomes were isolated by using ultrafiltration method. Morphology of exosomes was observed by Nanosight and electron microscope. Expression of proteins in exosomes was detected by antibody array method.
RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived stem cells exhibited long spindle-like or fibroblast-like appearance, expressed CD73, CD44, CD90, CD105 and had the potential to differentiate into many tissues, including bone and adipose tissues. The exosomes had the similar size, with the diameter of 30-150 nm. They possessed many proteins including FLOT1, ICAM, ALIX, CD81, CD63, ANXA5, TSG101, and so on. Findings from the present study indicate the successful isolation of exosomes from human adipose-derived stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Exosomes, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李洪超，金银鹏，王皙，李莉，王晓今，周荣，陈成伟，傅青春，程明亮. 人脂肪干细胞及其外泌体的分离与鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(13): 2033-2038.

Li Hong-chao, Jin Yin-peng, Wang Xi, Li Li, Wang Xiao-jin, Zhou Rong, Chen Cheng-wei, Fu Qing-chun, Cheng Ming-liang. Isolation and identification of human adipose-derived stem cells and its exosomes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(13): 2033-2038.

图/表（结果） 1

2.1 人脂肪干细胞的形态与流式细胞仪检测结果 第2代以后人脂肪干细胞维持成纤维样形态，大小均一且排列紧密，呈漩涡状或放射状生长(图1)。流式细胞仪检测结果显示，超过90%的细胞阳性表达CD73(100%)、CD44(100%)、CD90(99.7%)、CD105(98.2%)，而造血细胞系分子标记物CD34、CD45、CD19等呈阴性表达的细胞占99.8%(图2)。

2.2 人脂肪干细胞的成骨、成脂分化能力 人脂肪干细胞成脂诱导3周后可以在镜下观察到细胞浆内有大量透亮、折光性好的脂滴，油红O染色呈红色(图3A)；人脂肪干细胞成骨诱导3周后进行茜素红染色，倒置显微镜下观察可见成骨细胞特征性的红色密集的钙结节(图3B)。

2.3 人脂肪干细胞外泌体的形态特征 利用超滤浓缩离心方法收集得到人脂肪干细胞外泌体，置于扫描电镜下观察可见呈大小均一的圆杯形态，大小在30-150 nm之间，可看到其囊泡结构(图4)。

2.4 人脂肪干细胞外泌体数量和大小分布 利用颗粒粒度分析仪检测到人脂肪干细胞外泌体的大小如图5所示，横坐标代表直径范围，纵坐标代表人脂肪干细胞外泌体的浓度/强度，可以看出大多数外泌体均处于30-150 nm直径范围内。

2.5 抗体芯片检测人脂肪干细胞外泌体蛋白表达 抗体芯片显示人脂肪干细胞外泌体特殊蛋白FLOT1(Flotillin 1)、ICAM1(Intercellular adhesion molecule 1)、ALIX、CD81、CD63、EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)、ANXA5(Annexin A5)、TSG101(Tumor susceptibility gene 101)均为阳性表达，而GM130(cis-Golgi matrix protein)呈阴性表达(图6)。蛋白芯片的灰度值柱形图也显示FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、EpCAM、ANXA5、TSG101的灰度值均高于空白组(图7)。

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引言

间充质干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，不仅能够从骨髓、脐带、脂肪中分离，也可以从脾脏、肝脏、肾脏、肺、胰腺中得到，尽管其组织来源不同，但是都拥有相似的表型特征^[1-4]。间充质干细胞可以在体外被诱导分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，还能够分化成为心肌细胞、内皮细胞和神经细胞等^[5-6]。目前，间充质干细胞已在心脏、肝脏、肾脏等多种疾病模型中展现出显著疗效，其通过免疫抑制、抗炎及促增殖等多种作用促进受损组织修复，减轻脏器损伤，改善脏器功能。最近研究显示间充质干细胞主要通过旁分泌途径发挥作用^[7-9]。

脂肪干细胞作为间充质干细胞的一种，具有更高的增殖速率和更强的分化能力，且其取材相对容易，已经用于多种动物模型的治疗^[10]。脂肪干细胞可通过分泌外泌体的方式携带大量的可溶性因子，执行生物学功能。外泌体是一种细胞主动分泌的大小均一、直径为50-150 nm的脂质双分子层结构囊泡，可由树突细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞和间充质干细胞等不同类型细胞释放^[11-16]。外泌体最早是在1983年由Pan和Johnstone研究网织红细胞成熟的过程中发现的，起初认为外泌体的作用是处理细胞废弃蛋白及RNA等物质，后来发现外泌体可调节多种生物学效应，是细胞间信号传导的重要介质^[17-19]。外泌体的脂质双层膜可以避免外泌体被蛋白酶及核糖核酸酶降解，同时也能促进目的细胞表面受体与膜的相互作用^[20-26]。因此找到一种快速分离外泌体的方法显得尤为重要。

实验使用超滤法从脂肪干细胞中提取外泌体，应用扫描电子显微镜、粒度仪观察所获外泌体的形态和大小，采用抗体芯片检测外泌体所含蛋白质，为今后外泌体的基础实验研究与临床应用提供了一条新的获取途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年9月至2017年7月在上海市同济大学再生医学系干细胞生理及疾病治疗研究组重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验用主要试剂 0.15%胶原酶Ⅰ(Gibco，美国)；DMEM/F12培养基(Hyclone，美国)；体积分数为10%胎牛血清(Gibco，美国)；成脂培养基(#HUXMA-90031，Cyagen Biosciences Inc.，中国)；成骨培养基(#HUXMA-90021；Cyagen Biosciences Inc.，中国)；油红、茜素红(Sigma，美国)；exosome抗体芯片试剂盒(System Bioscience，美国)；0.25%胰蛋白酶(Gibco，美国)；流式鉴定试剂盒(BD Stemflow^TM，中国)；BCA试剂盒(Solarbio，中国)。

1.3.2 实验用主要仪器 流式细胞仪(BD，美国)；恒温培养箱(Thermo，美国)；离心机(TD25-WS，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；低温超速离心机(Eppendorf，德国)；粒度仪(NS300，英国)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；超滤浓缩离心管(Merk，爱尔兰)；化学发光成像系统(LAS 4000mini，GE，日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 人脂肪干细胞的分离与培养 取整形手术后废弃的人体颈部脂肪组织(已签署知情同意协议书)，PBS清洗3遍，用组织剪将脂肪组织剪成约为1 mm³的小块，加入0.1%胶原酶Ⅰ于37 ℃水浴消化30 min后置于离心机中，1 200 r/min离心5 min后留取细胞沉淀，用适量PBS重悬后再次以上述条件离心，弃上清，加入含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，接种于10 cm培养皿，细胞浓度为1×10⁹ L^-1，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中，48 h后换液，观察细胞生长至80%时，加入0.25%胰酶消化后按1︰3传代培养，培养至第3代用于后续实验使用。

1.4.2 流式细胞仪检测脂肪干细胞表面分子标记 取第3代人脂肪干细胞，加入0.25%胰酶消化后制成500 μL单细胞悬液，按流式鉴定试剂盒要求分别加入抗人CD90-FITC、CD44-PE、CD105-PerCP、CD73-APC、阴性抗体、阳性抗体各2 μL，37 ℃孵育30 min后用PBS清洗3遍，使用流式细胞仪检测。

1.4.3 脂肪干细胞成脂、成骨分化能力 将人脂肪干细胞按5×10³/cm²的密度接种于6孔板，加入DMEM/F12完全培养基于培养箱中培养使其完全贴壁，然后更换为成脂、成骨分化培养基培养3周，进行油红O染色、茜素红染色。油红O染色时细胞需用PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定10 min，油红O染剂孵育30 min，PBS清洗3次，倒置显微镜下观察；茜素红染色时细胞需用PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定10 min，茜素红试剂在室温下孵育3 h，PBS洗去多余试剂，倒置显微镜下观察。

1.4.4 人脂肪干细胞外泌体的提取 取第3代人脂肪干细胞，首先用含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，待其生长至70%以上时换用无血清的基础培养基继续培养24 h，培养过程在37 ℃，体积分数为5%CO₂的恒温温箱中进行；24 h后将基础培养基收集至离心管中，0.22 μm的过滤器过滤后转移到100 ku的超滤浓缩离心管中，4 ℃条件下以4 000×g离心40 min，得到含外泌体的浓缩液。

取第4代人脂肪干细胞，待其生长至80%以上时按照上述方法再次收集人脂肪干细胞外泌体，所收集的人脂肪干细胞外泌体均放置在-80 ℃冰箱中储存备用。

1.4.5 人脂肪干细胞外泌体数量和大小分布 将外泌体制成1 mL 0.5 g/L的溶液，将样品注入样品槽，注满为止，利用Nanosight NS300颗粒粒度分析仪检测粒径大小和浓度，调整软件参数使视频清晰，点开软件中的RUN键，收集需要的数据。

1.4.6 人脂肪干细胞外泌体的形态特征 滴1滴约10 μg外泌体悬液于封口膜上，用镊子取1个铜网盖在液滴上5-10 min，然后滴1滴2%磷钨酸染液于封口膜上，用镊子将铜网从外泌体液滴移到磷钨酸液滴上，染色3 min，用滤纸吸干液体，放于白炽灯下烤干，扫描电镜观察并拍照。

1.4.7 抗体芯片检测人脂肪干细胞外泌体所含蛋白质表达 超滤浓缩离心法收集到的外泌体样品加入抗体芯片检测试剂盒中的外泌体裂解液，再与外泌体芯片结合缓冲液混合并滴加在芯片上，于2-8 ℃的摇床上放置过夜，洗涤3次，加二抗孵育0.5 h，洗涤3次，将芯片取出，滴加显色液，置于化学发光成像系统中拍照。用Image J软件对结果进行灰度值统计分析。

1.5 主要观察指标 ①脂肪干细胞的形态、免疫表型；②脂肪干细胞的成脂及成骨分化能力；③脂肪干细胞外泌体的形态和大小；④脂肪干细胞外泌体的蛋白含量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

随着脂肪干细胞及其外泌体在肝病、心血管疾病、神经系统疾病等领域的研究日益增多，使用一种高效、低损伤、低污染可能的脂肪干细胞分离方法尤为重要^[27-30]。在脂肪分离方法中，操作时间、步骤的繁琐与否、消化时间、洗涤、接种细胞密度以及培养基成分等各方面因素均影响细胞的质量。本实验采用胶原酶Ⅰ消化30 min，离心之后再次洗涤最大限度地清除胶原酶Ⅰ，最后接种于DMEM/F12培养基，所得到的脂肪干细胞为梭形，呈漩涡状贴壁生长，形态学上符合脂肪干细胞的标准形态。

目前，关于脂肪干细胞表面的特异性标志还没有定论。已有的研究表明，脂肪干细胞能够表达CD10，CD13，CD29，CD44，CD105，CD73，CD90，STRO-1；不表达造血系统及上皮标志，如CD3，CD4，CD15，CD16，CD19，CD31，CD33，CD34，CD45，CD56，CD106等^[31]。本实验分离的脂肪干细胞表面标记CD44、CD73、CD90、CD105均呈阳性表达，而造血细胞系分子标记物CD34、CD45、CD19等呈阴性表达。间充质干细胞可以在体外被诱导分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，还能够分化成为心肌细胞、内皮细胞和神经细胞等^[32]。本实验诱导脂肪干细胞分别向骨细胞、脂肪细胞分化，成脂分化的油红O染色以及成骨分化的茜素红染色结果均证实所分离的脂肪干细胞具有多向分化能力。

近年来，随着外泌体研究增多，脂肪干细胞外泌体的相关研究也日益增多。外泌体凭借其大小及双分子膜等优势在多种疾病模型中呈现出了较细胞水平更为卓越的治疗效果^[33-37]。然而，由于外泌体领域的研究时间尚短，存在多种问题，如外泌体的提取方法学规范、统一定量及鉴定等。关于外泌体的提取有多种方法：试剂盒、超速离心、超滤法、蔗糖密度梯度离心等，然而各种方法均有其利弊^[38-40]。总而言之，试剂盒、超滤法可以最大程度地减轻对外泌体的机械损伤，在文献中也用的最多。本实验所用外泌体分离方法为超滤法，较试剂盒更为经济实用，效率较高。

目前，没有特异性标志可以标化外泌体的质量与纯度。外泌体的鉴定仍依赖于形貌的鉴定方法^[41-45]。外泌体是一种细胞主动分泌的大小均一，直径为30-150 nm(具体直径未规范定义，文献报道各有差异)的脂质双分子层结构囊泡。从扫描电镜图片可以看出样品直径在30-150 nm之间，大小均一呈杯状，形态完整，可看出其囊泡结构。粒度仪结果也显示绝大多数外泌体均处于30-150 nm这个直径范围内。

外泌体含有一系列丰富的蛋白质、脂质、RNA甚至DNA等物质。外泌体携带很多特殊蛋白质、脂质和RNA等。因为外泌体起源于核内体，它们包含许多蛋白质：脂阀结构蛋白(如ANXA5)和膜联蛋白(如FLOT1)对于运输和融合很重要；四分子交联体家族成员9涉及细胞寻靶；Alix和TSG101涉及外泌体的起源等^[46-47]。外泌体的高通量蛋白质组分析提示有细胞外基质、细胞表面蛋白、细胞表面受体以及表皮生长因子受体等存在^[48-50]。抗体芯片显示FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、EpCAM、ANXA5、TSG101等外泌体特异蛋白均呈阳性表达，表明所分离的脂肪干细胞外泌体符合外泌体的常规蛋白组成。这些蛋白不仅反映了外泌体的起源，也为进一步的研究提供参考价值。

综上所述，实验所分离培养的脂肪干细胞呈梭形、漩涡状生长。细胞表面分子CD73、CD44、CD90、CD105呈阳性表达，成骨成脂肪分化证实所分离脂肪干细胞具备多向分化潜能。以超滤法提取所分离的外泌体直径在30-150 nm之间，呈均一大小的圆杯形态，FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、EpCAM、ANXA5、TSG101等外泌体相关蛋白呈阳性表达，说明成功分离到人脂肪干细胞外泌体。下一步实验拟将脂肪干细胞外泌体用于急性肝衰竭大鼠模型，探索其对急性肝衰竭的疗效。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人脂肪干细胞及其外泌体的分离与鉴定

Isolation and identification of human adipose-derived stem cells and its exosomes

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