1.1 试验目的 利用同种异体脐带来源间充干细胞关节腔内注射治疗人膝关节骨关节炎，获得脐带来源间充干细胞治疗骨关节炎的有效性和安全性数据，以期为干细胞治疗骨关节炎提供必要的理论基础和临床依据。
1.2 试验设计类型 第一部分为单病例研究；第二部分为单臂临床试验；第三部分为小型RCT研究。
1.3 试验完成地点 中国，北京市，北京大学人民医院关节病诊疗研究中心。
1.4 受试者选择
1.4.1 纳入标准 同时满足以下几项者方可进入研究：①根据国际上公认的诊断标准诊断为膝关节骨性关节炎；②K/L评分为2至3级；③慢性膝关节源性疼痛；④无局部或全身感染；⑤血液学检测及生化检测无明显的关节腔穿刺禁忌；⑥受试者及家属对临床试验方案了解并同意参与试验，并签署书面“知情同意书”。
1.4.2 排除标准 下列任何一条为本研究的排除标准：①年龄大于75岁或小于18岁，或不具完全民事行为能力；②HIV、肝炎病毒或梅毒病毒感染或血清学检验阳性；③体质量指数(BMI)大于30 kg/m2；④先天性或获得性膝关节畸形；⑤怀孕或哺乳期妇女；⑥肿瘤患者；⑦免疫缺陷症患者；⑧3个月前有关节腔内药物注射病史；⑨目前仍在参加其他临床试验的患者；⑩其他研究者认为不适合入组的患者如患有其他伴随疾病；?拒绝签署知情同意书或拒绝参加本临床试验的受试者。
1.5 招募 由研究者开展本试验相关的宣传教育，发布招募标准及电话、e-mail、微信等项目负责人的联系方式，招募受试者，向受试者介绍利弊，征得同意后签署知情书,入组后再详细按照纳入排除标准进行筛查。
1.6 干预方法
1.6.1 研究阶段
(1)筛选期，完成筛选检查，主要包括：①签署知情同意书；②人口统计学资料，疾病史、手术史及骨关节炎治疗史资料收集；③核查纳入排除标准；④体格检查记录；⑤血常规(红细胞、白细胞、血小板计数，中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞百分比及血红蛋白)；⑥尿常规(蛋白、糖、红细胞、白细胞、pH值)；⑦血液生化(肝功能、肾功能、电解质)；⑧凝血参数；⑨感染指标(C-反应蛋白、血沉)；⑩HIV抗体；?淋巴细胞亚群检查；?心电图；?胸片；?膝关节CT、B超或MRI；?完成以下评分量表：目测类比(VAS)评分，WOMAC评分，Lequesne指数，SF-12量表；?光盘刻录，影像学资料保存。
(2)第一部分(单病例研究)：根据1996年9th NCI/EORTC New Drug Development Symposium in Amsterdam的指南，通过纳入3组受试者，分别接受高、中、低3种等级的细胞剂量治疗，评价剂量限制性毒性(dose-limiting toxicity，DLT)，确立最大耐受剂量(maximum tolerated dose，MTD)。
剂量和细胞浓度的选择基于既往的文献报道[23]。从低剂量注射开始，低剂量为1×107 cells/3 mL，中剂量为 5×107 cells/3 mL，高剂量为1×108 cells/3 mL。注射后进行随访，根据不良反应发生情况决定进入下一阶段试验。3组受试者在注射后1，2，3，6个月进行随访。不良反应发生根据《常见不良反应事件评价标准(NCI-CTCAE)》，将出现GRADE评分大于3分的下述并发症视为DLT发生，包括：过敏反应、注射部位局部反应、注射部位局部感染、纤维化改变、肌肉或骨骼发育不全。具体试验流程见图1。该部分试验已在clinicatrail注册(https://clinicaltrials.gov/)，编号为NCT03357770。
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(3)第二部分(单臂临床试验)：继续招募9名受试者进行干预试验，注射剂量为第一步试验确定的最高剂量。受试者在注射后1，2，3，6个月进行随访。术前进行健康宣教，重点强调膝关节的运动范围以及如何进行股四头肌的力量训练。术后第1天即开始膝关节的屈伸运动以及股四头肌的力量训练，建议患肢不负重8周，8周后在拐杖辅助下逐渐进行性负重4周，共12周后可正常负重。纳入后随访过程中进行安全性及有效性评价。该部分试验已在clinicatrail注册(https://clinicaltrials.gov/)，编号为NCT03358654。
(4)第三部分(小型RCT)：前两部分试验结果理想后开展，该部分采用随机对照研究的实验设计，即根据既定的纳入标准/排除标准纳入目标人群，按照随机化的原则，采用随机数字表法将受试者随机分为两组，每组按照样本量估算结果为7人，分别给予脐带来源的MSCs治疗和传统的透明质酸治疗。在试验期间，做到随机方案的分配隐藏，保证评价者盲、受试者盲以及干预者盲。在术后3，6，12，24个月4个时间点进行随访，评价受试者的疼痛和功能变化，进行安全性及有效性评价。
1.6.2 干细胞制剂的使用方式、剂量、时间及疗程
干细胞制剂：人脐带来源MSCs。
使用方式：关节腔内注射。
剂量：将既定浓度的细胞(1×107cells，5×107 cells，1×108 cells)混匀在3 mL生理盐水中。
疗程：关节腔内一次性注射。
1.6.3 随访方法及评价指标的选择
(1)试验第一部分在注射后1，2，3，6个月进行随访，随访内容：体格检查，生命体征。研究第二部分在注射后 1，2，3，6个月进行随访，随访内容：体格检查，生命体征，血常规，血液生化及电解质，淋巴细胞亚群，膝关节MRI，VAS评分，WOMAC评分，Lequesne指数，SF-12量表。研究第三部分在注射后3，6，12，24个月4个时间点进行随访，随访内容：体格检查，生命体征，血常规，血液生化及电解质，淋巴细胞亚群，膝关节MRI，VAS评分，WOMAC评分，Lequesne指数，SF-12量表。有条件或必要时可延长随访时间。
(2)实施办法：
△ 随访的结果记录在“病历报告表(CRF)”中。
△ 客观性的结局指标如MRI评估结果等，由2名评价者独立进行评价，并分别记录。结果存在差异由双方协商解决，或请教第3方进行评价。
△ 主观性的结局指标如VAS量表等，由受试者自行填写相应量表后，粘贴在病历记录中。
△ 研究中涉及评价指标均采用国际公认的评分量表的中文翻译版，粘贴在病历记录表中。
△ 对于失访病例，要详细记录失访的时间及原因等。
1.7 随机化方法 试验第三部分采用随机数字表法，通过软件完成，形成随机数字表。由协调员随机为每名入组的受试者分配一个随机号码。入组者接受计算机1︰1随机分配至干细胞治疗组以及透明质酸治疗组。一旦随机号码已经分配给某位受试者，此号码不能再次被重复分配，未能完成整个研究的受试者也不能由其他受试者替换。采用不透光信封的方式对随机方案进行隐藏。
1.8 盲法 试验第三部分随机对照研究采用三盲。受试者盲，干预者盲，评价者盲。受试者接受随机分组，由协调员协助完成。领取随机号码后，检验标本以及注射药物均以研究编号数字加以标识而非受试者姓名，注射干细胞或透明质酸由电脑系统随机决定，不会透露给受试者。受试者分组不会告知干预者，每次关节腔注射药物由助手准备，注射器用黑布遮挡，术者及受试者将不会得知注射的是哪种药物。评价由第三方完成，分组情况不会透露给评价者。
1.9 不良事件的记录要求和严重不良事件的报告方法、处理措施 在试验开始前制定详细规范的《干细胞临床研究风险管理机制和损害事件处理措施SOP》。所有接受关节腔注射受试者都将成为安全性分析有效人群。研究者将如实记录受试者的副作用及不良事件，并分析原因。
不良事件定义为在治疗及随访期间发生的不利和非预期的医疗事件，包括：①出现不明原因的发热、晕厥、大汗、呕吐等全身症状；②出现不明原因胃肠道功能失调，食欲不振、恶心、腹胀、便秘或腹泻等；③出现不明原因头痛、疲倦、不明原因的肌肉痛、不适感以及睡眠的改变等；④出现不明原因焦虑、不安、烦躁等精神症状；⑤出现不明原因视觉障碍、肌肉震颤、排尿困难等；⑥局部出现皮肤斑丘疹、红斑等局部表现；⑦局部出现疼痛加重或活动范围减少等；⑧出现急性中毒症状或死亡。
严重不良事件(SAEs)定义为：试验过程中发生需住院治疗、延长住院时间、伤残、影响工作能力、危及生命或死亡、导致先天畸形等事件
必须记录不良事件的严重程度并根据CTCAE标准进行分级，并根据以下定义评估其与治疗的关系。①无关：有证据表明，导致不良事件的原因不是关节腔注射治疗(如既往状况，潜在疾病，并发疾病)；②有关：不良事件与关节腔注射药物有时间关联且已知或怀疑关节腔注射药物可以引发该不良事件；③无法评估。
不良事件要求被记录在CRF相关部分中，需要描述：开始及结束日期；不良事件结果；是否导致受试者退出研究；是否与关节腔注射药物有关的评估；是否属于严重不良事件。
1.10 研究治疗中断/退出 受试者可在任何时间终止研究治疗及评估，具体情况为：
(1)在不影响进一步治疗的前提下，受试者任何时间自愿退出本研究。
(2)出现以下不良事件(主要参考NCI-CTCAE标准)：①出现不明原因的发热、晕厥、大汗、呕吐等全身症状；②出现不明原因胃肠道功能失调，食欲不振、恶心、腹胀、便秘或腹泻等；③出现不明原因头痛、疲倦、不明原因的肌肉痛、不适感以及睡眠的改变等；④出现不明原因焦虑、不安、烦躁等精神症状；⑤出现不明原因视觉障碍、肌肉震颤、排尿困难等；⑥局部出现皮肤斑丘疹、红斑等局部表现；⑦局部出现疼痛加重或活动范围减少等；⑧出现急性中毒症状或死亡。
(3)研究者认为受试者存在严重违反研究方案的情况或入组错误。
(4)研究者认为该研究方案存在安全问题。
(5)受试者失访。
如果受试者提前中止研究治疗，必须在病历报告表(CRF)中记录中止的原因，但要随访到整个研究结束，并填写研究表格。
1.11 研究终点
1.11.1 一级终点 在治疗至随访结束前受试者出现治疗相关的严重不良事件。
1.11.2 二级终点 至随访结束，与基线值相比，受试者以下几项中的一项或以上出现变化(说明有效性)：
△ VAS评分；
△ WOMAC评分；
△ Lequesne指数评分；
△ SF-12量表评分；
△ 膝关节MRI评价软骨缺损面积。
1.12 统计学考虑
1.12.1 样本量的计算 本研究将使用假设检验公式进行样本含量的计算，目前暂无脐带MSCs治疗人体骨关节炎的文献报道，根据骨髓来源MSCs治疗骨关节炎的文献，以WOMAC评分为标准，预计干细胞治疗改善率为0.42，对照组(透明质酸)为0.10，标准差为0.196[24]，取α=0.05，1-β=0.80，而且都是双侧检验。算得样本量为12，加上20%的失访率，估计需要受试者14例。
1.12.2 数据的统计方法 采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计学处理。显著性水平α定为0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。
需要统计：膝关节MRI得到的软骨缺损面积，VAS评分，WOMAC评分，Lequesne指数，SF-12量表评分。对于连续性变量，用均数±标准差表示，组间差异采用student-t 检验。对于分类变量，用率表示，组间差异采用方差分析。对于失访数据将采用意向性分析(ITT)，将不会夸大干预措施的治疗效果。
1.13 数据管理 数据录入采用双录入方式进行，并由第三方公司完成。统计学方法的选择和处理方式需要按照既定的统计学处理计划书进行，并由第三方完成。
1.14 临床试验的伦理问题及知情同意 每一版研究方案及知情同意书必须由伦理委员会批准或予以肯定的书面意见。后期在试验进行中任何对研究计划的修改以及每一版研究计划书也必须由伦理委员会批准。本研究将严格遵照《赫尔辛基宣言》中的伦理原则执行，以保护受试者利益和有利于受试者的原则。在研究前将对受试者充分知情同意，并告知受试者可以在任意时间自愿退出。知情同意书一式两份，研究者与受试者各保留一份。
1.15 研究质量控制 研究前对所有参加的研究人员进行统一培训，建立质量控制标准和方法SOP。研究者保留研究过程中全面准确的记录，并建库储存。研究者负责所有人员接受相关培训，并将研究进度及新相关信息告知相关人员。组建研究小组负责协调整个研究工作，定期公布研究进度，撰写研究报告，解决发现的问题。
受试者入组及分配由专门的协调员负责完成，每次关节腔注射准备工作有专门的助手完成，专人审核研究表格，及时解决疑问。建立监测委员会培训监察员定期监查，并允许试验相关审核、IEC审核及稽查和视察，但要保证受试者隐私。数据处理及分析由受过培训的第三方完成，监测委员会监督。
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