氟化钠诱导人成骨细胞凋亡相关microRNA差异表达及分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0131

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (8): 1149-1154.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0131

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氟化钠诱导人成骨细胞凋亡相关microRNA差异表达及分析

邓强1，张亚楼2，周杨俊杰1，马创1，盛伟斌1

1新疆医科大学第一附属医院骨科中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；2新疆医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011

收稿日期:2017-10-23 出版日期:2018-03-18 发布日期:2018-03-18
通讯作者: 张亚楼，博士，副教授，新疆医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
作者简介:邓强，男，1974 年生，湖南省益阳市人，汉族，2004年新疆医科大学毕业，博士，主任医师，主要从事脊柱外科的研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2015211C040)

Differential expression of microRNAs related to apoptosis in human osteoblasts induced by sodium fluoride

Deng Qiang1, Zhang Ya-lou2, Zhou Yangjunjie1, Ma Chuang1, Sheng Wei-bin1

1Department of Orthoepdics, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Department of Histology and Embryology, Preclinical Institute of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2017-10-23 Online:2018-03-18 Published:2018-03-18
Contact: Zhang Ya-lou, Ph.D., Associate professor, Department of Histology and Embryology, Preclinical Institute of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Deng Qiang, M.D., Chief physician, Department of Orthoepdics, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2015211C040

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
成熟的miRNA：是一类内源性非编码单链RNA，其长度为19-25 nt，具有很高的保守型。其通过装载进入AGO2蛋白形成RISC复合物，对靶基因进行转录后调控作用，在生物进程中起到非常重要的作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。人种的为has。miRNA前体：以动物物种缩写-mir-命名顺序，如hsa-mir-227；miRNA成熟链：以动物物种缩写-miR-命名顺序，如has-miR-227-5p。
氟骨症：是指长期摄入过量氟化物引起氟中毒并累及骨组织的一种慢性侵袭性全身性骨病。氟中毒累及牙齿称氟斑牙。1901年，Eaqer最早报道氟斑牙，1932年丹麦的Motlev和Gudijonsson命名为“氟中毒”(fluorosis)，并认为本病伴有骨硬化。

摘要
背景：长期过量摄入氟，尤其是通过饮水，可以引起慢性氟中毒骨病。该病可以导致骨骼损伤和畸形，且难以恢复。目前还没有早期诊断该病的无创或微创方法。
目的：观察人成骨细胞在过量氟作用下凋亡相关miRNA表达的情况。
方法：体外培养人成骨细胞建立染氟模型，用20 mg/L NaF和40 mg/L NaF分别处理24/48 h后用PCR芯片法测定凋亡相关miRNA的表达情况。
结果与结论：①NaF处理24 h后发现成骨细胞内有48条miRNA表达上调，4 条miRNA表达下调；NaF处理48 h有21条miRNA表达上调，2条miRNA表达下调；两个时间点共同上调miRNA有9条，共同下调miRNA有1条；②用生物信息学软件对选出的10条人成骨细胞凋亡相关miRNA进行靶基因分析，涉及抗凋亡和促凋亡的两方面的作用，对于氟骨症的早期鉴别具有一定的理论意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-3042-5192(邓强)

关键词: 氟骨症, 凋亡, 微小RNA, 成骨细胞

Abstract:

BACKGROUND: Long-term excessive intake of fluoride, especially through drinking water, can cause chronic fluorosis of bone. The disease can lead to bone damage and deformity, and is difficult to recover. Unfortunately, we have not developed a noninvasive or minimally invasive method for its early diagnosis.
OBJECTIVE: To observe the expression of apoptosis-related miRNAs under the action of excessive fluorine in human osteoblasts.
METHODS: The fluorine model was established in the human osteoblasts by cultured with 20 and 40 mg/L sodium fluoride for 24 and 48 hours, respectively. The expression levels of apoptosis-related miRNAs were determined by PCR array.
RESULTS AND CONCLUSION: After 24-hour treatment of sodium fluoride, 48 kinds of miRNAs were upregulated and 4 ones were down-regulated in the osteoblasts. After 48-hour treatment of sodium fluoride, 21 kinds of miRNAs were upregulated and 2 ones were down-regulated. It showed that nine up-regulated miRNAs and one down-regulated miRNA were same in two periods. The 10 miRNAs are selected for target gene analysis on bioinformatics software that refer to the effect of anti-apoptosis and pro-apoptosis, which is of great significance for the early identification of skeletal fluorosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Sodium Fluoride, Apoptosis, MicroRNAs, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

邓强，张亚楼，周杨俊杰，马创，盛伟斌. 氟化钠诱导人成骨细胞凋亡相关microRNA差异表达及分析[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(8): 1149-1154.

Deng Qiang1, Zhang Ya-lou2, Zhou Yangjunjie1, Ma Chuang1, Sheng Wei-bin1. Differential expression of microRNAs related to apoptosis in human osteoblasts induced by sodium fluoride[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(8): 1149-1154.

图/表（结果） 3

2.1 质量控制基因检测结果 H03(SNORD61)ct值25.82、H04(SNORD68)ct值22.48、H05(SNORD72)ct值28.48、H06(SNORD95)ct值23.81、H07 (SNORD96A)ct值25.39、H08 (RNU6-6P)ct值23.82、H09 (miRTC)ct值26.18、H10 (miRTC)ct值26.19、H11 (PPC)ct值19.18、H12(PPC)ct值19.29(注：H03-H08为内参，H09、H10为反转录对照，H11、H12为阳性对照)，以上参数反映质量控制正常。扩增曲线和熔解曲线见图1A和图1B。

2.2　microRNA表达差异分析

2.2.1 对照组样本与24 h处理组miRNAs差异表达分析将24 h处理组和对照组miRNA的表达量丰度进行比较后共得到52个显著差异表达miRNA(48条miRNA表达上调，4 条miRNA表达下调)。见表1。

2.2.2 对照组样本与48 h处理组miRNAs差异表达将 48 h处理组和对照组miRNA的表达量丰度进行比较后共得到23个显著差异表达miRNA(21条miRNA表达上调，2条miRNA表达下调)。见表2。

2.2.3 两个时间点同时差异表达的miRNA 进一步筛选后，得到24 h和48 h共同上调miRNA有9条，共同下调miRNA有1条。分别为上调的hsa-miR-101-3p， hsa-miR-125b-5p，hsa-miR-153-3p，hsa-miR-17-5p，hsa-miR-20a-5p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-365b-3p，hsa-miR-708-5p，hsa-miR-9-5p，以及下调的hsa-miR-451a。筛选出来的10条miRNA进行的功能分类见表3。

2.2.4 差异表达miRNA靶基因预测采用4种网上的生物信息学软件预测靶基因：①miRbase: (http://mirbase. org/ index.shtml)、②Tarbase: (http://microrna.gr/tarbase/)、③miRecords: (http://mirecords.biolead.org/)、④targetScan: (http://www.targetscan.org/)。由于第4种软件预测的假阳性率较低，以它为基础，与其他软件相印证，同时预测出的靶基因数量较多(可达数百种)，选出评分高的前10个靶基因如下：

(1)miR-365b-3p的靶基因预测：NCR3LG1，NFIA，NUFIP2，DCP2，PPP2CB，ARL5A， SH3PXD2A， FAM60A，INO80D，SMARCC1。查阅CELL SIGNALING TECHNOLOGY网站(https://www.cst-c.com.cn)，发现NFI-C属于核因子I(NFI)家族，NFI-C表达于各种组织中而且调节转化生长因子β依赖的牙齿发育和毛囊循环，NFI-C 直接抑制FoxF1转录^[8]；PPP2CB (Protein Phosphatase 2 Catalytic Subunit Beta)与胰岛素样生长因子1受体信号通路和mTOR通路有关；SMARCC1目前仅发现与小鼠胚胎发育相关^[9]；余下的基因未见信号通路资料。

(2)miR-708-5p的靶基因预测：FOXJ3，SESN3，AGPAT3，CBX5，NUFIP2，PPIF，ZBTB7A，TTC17，SORT1，TUB。查阅CELL SIGNALING TECHNOLOGY网站，发现：ZBTB7A基因属于POK(POZ和Kruppel)/ ZBTB(锌指和BTB)家族参与Notch信号通路，通过抑制前凋亡基因凋亡因子前体Bim促进细胞生存^[10-11]；余下基因未见信号通路资料。

(3)miR-101-3p的靶基因预测：CEP350，RC3H2，TNKS2，RBBP7，PHACTR2，PIP5K1C，IGF2R，SOX11，AKAP11，C10orf12。查阅CELL SIGNALING TECHNOLOGY网站，发现：PIP5K1C与嗜酸性粒细胞中的CCR3免疫信号通路和磷脂酶D信号通路有关^[12]；IGF2R属于胰岛素样生长因子Ⅱ受体^[13]；余下基因未见信号通路资料。

(4)miR-125b-5p的靶基因预测：MFHAS1，SEMA4C，RORA，FAM118A，KPNA6，ZC3H7B，CDK16，CHAMP1，RC3H2，JARID2。查阅CELL SIGNALING TECHNOLOGY网站，发现：RORA与昼夜节奏和天然免疫信号有关^[14]；CDK16调节细胞周期，可以与Jun基因相互作用^[15]；JARID2是一种核蛋白在可以降低细胞分化，JARID2是多梳抑制复合物2(PRC2)的一个附件，通过组蛋白H3的甲基化抑制靶基因的表达^[16]；余下基因未见信号通路资料。

(5)miR-17-5p的靶基因预测：MAP3K9，RGMB，EFCAB14，ARAP2，ZNF148，TBC1D9，SUV420H1，ANKRD13C，ARNTL2，STAT3。丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶9(MAP3K9)是MAPK信号通路中最上游的激酶分子，可以接受细胞膜受体的多种信号刺激，激活后磷酸化下游基因，调控细胞增殖分化^[17]；STAT3是一种重要的具有抗凋亡作用^[18]；余下基因未见信号通路资料。

(6)miR-20a-5p的靶基因预测：GINM1，RUFY2，C2CD2，TNKS2，PTPN4，RORA，EFCAB14，RASL11B，ZNF367，SIK1。RORA功能同上miR-125b-5p；余下基因未见信号通路资料。

(7)miR-21-5p的靶基因预测：GATAD2B，YOD1，KLHL15，FRS2，ADNP，BTG2，HNRNPU，KPNA4，RHOB，AGO4。FRS2(成纤维细胞生长因子受体底物2)参与细胞外碱性成纤维生长因子受体信号传递^[19]；活性依赖性神经保护蛋白(activity-dependent neuroprotective protein，ADNP)调控抑癌基因P53^[20]；hnRNPU也被称为脚手架附着因子A，对细胞内活动有广泛作用，包括与RNA聚合酶Ⅱ形成剪切复合体调节核内mRNA的转录，调节pre-mRNA的加工以及对细胞内mRNA翻译过程起作用等，还可以调节Caspase 9a和Caspase 9b的剪切比例影响细胞的凋亡过程^[21]；RhoB 的功能包括调节细胞形状，迁移和黏附^[22]；AGO4属于Argonauta家族，是与高尔基体和内质网膜相关的蛋白质，除了在RNAi现象中担当重任外，其参与细胞周期进程的调控，影响细胞增殖和发育^[23]；

余下基因未见信号通路资料。

(8)miR-451a的靶基因预测：PFAS，CAB39，ARPP19，BRAF，MYC，BCL2，TMED7，MMP2，GPR133，AKT1。PFAS(Phosphoribosylformylglycinamidine Synthase)参

与嘌呤代谢^[24]；CAB39(calcium binding protein 39)，钙结合蛋白39，是LKB1(LiverkinaseB1) 复合体的组分之一，一同参与抑制合成代谢^[25]；ARPP19，cAMP-regulated phosphoprotein 19(ARPP19)通过调节cyclin B1-cdc2的磷酸化参与细胞的有丝分裂调控^[26]；BRAF(B-Raf Proto-Oncogene，Serine/Threonine Kinase)、MYC (Proto-Oncogene)均在MAPK信号通路内^[27]；BCL2具有抑制细胞凋亡的作用^[27]；基质金属蛋白酶2属于基质金属蛋白酶家族，与肿瘤的形成，细胞凋亡关系密切^[28]；AKT1对控制细胞生长和凋亡具有重要作用^[28]。

(9)miR-153-3p和miR-9-5p在不同网站尚未发现有相同预测的靶基因。

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引言

氟存在于自然环境中，属于卤族元素，化学性质活泼，氧化性强。机体每天暴露在氟元素下主要是通过饮水，而水质主要取决于地理环境。一些国家(中国和印度最为严重)仍然存在地方性氟中毒^[1]，摄入过量氟可以导致软、硬组织损伤^[2-3]。目前认为水氟含量低于0.7 ppm对6-8岁儿童的健康是没有明显损害效应的^[4]。

氟骨症是由于长期摄入过量氟化物引起氟中毒并累及骨组织的一种慢性侵袭性全身性骨病。骨代谢紊乱是地方性氟中毒的普遍现象，是氟骨症的重要特征，也是脊柱外科疾病之一^[5]，多发生于青壮年。氟骨症的临床特征是腰腿关节疼痛、关节僵直、骨骼变形以及神经根、脊髓受压迫的症状和体征，同时患者伴有氟斑牙(12岁以后迁入高氟区患者可没有氟斑牙)。患者就诊时的主诉一般为脊柱和四肢关节持续性疼痛，静止时加重，活动后可缓解，晨起时关节僵直，关节无红、肿、热等炎症表现，如果有神经根压迫情况，则疼痛加剧，如刀割或闪电样剧痛，拒触碰或扶持。病情严重时关节脊柱固定、脊柱侧弯，佝偻驼背或四肢僵直。脊髓或脊神经根受压者可出现四肢或双下肢感觉麻木、感觉减退、肌力降低，躯干有被束缚感，疼痛，严重者可伴肢体截瘫，以至生活难以自理。病情发生发展与患者的遗传背景和营养状况都有一定关系。

目前中国已经对高氟地区进行了改水降氟处理，氟骨症的发病率有了明显的下降。由于改水工程设计面广泛，且与当地经济发展水平密切相关，无法在短期内完成，还需要对氟骨症患者的发病情况进行监测。早期氟骨症可无症状和X射线片异常。氟骨症的病因明确，但是发病机制目前仍不清楚。现在研究发现骨细胞凋亡是氟骨症的主要病变，但是氟骨症的早期诊断却一直没有相对便捷无创(或微创)的检测方法。项目组前期研究发现了氟引起成骨细胞凋亡的剂量和凋亡率^[6]。文献报道miRNA能调节成骨细胞凋亡^[7]，但在染氟致人成骨细胞凋亡中，miRNA的作用尚未见报道。本研究用凋亡相关microRNA PCR芯片，为揭示过量氟暴露下成骨细胞miRNA的相关变化提供诊断等理论基础。

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材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。

1.2 时间及地点实验于2016年4月至2017年4月在新疆医科大学协同创新中心完成。

1.3 材料

细胞：人成骨肉瘤细胞系Saos-2购于上海细胞库。细胞在含体积分数10% 胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱进行贴壁培养。　

实验用主要试剂：氟化钠(分析纯，上海生工生物工程股份有限公司)RT2First Strand Kit(QIAGEN)；RT2SYBR GreenqPCR Master mix(QIAGEN)；PCR芯片(MIHS-114Z)购于QIAGEN公司。

实验用主要仪器：细胞培养箱(Themo)；高速冷冻离心机 (Eppendorf)；NANODROP分光光度计(芬兰)；荧光定量PCR仪(EPPENDORF Mastercycler ep realplex)。

1 .4 实验方法

1.4.1 分组及造模取处于对数生长期，生长状态良好的成骨细胞，以(2-5)×10⁵的细胞量接入T25的瓶子中，37 ℃培养过夜；细胞过夜贴壁之后按照以下分组处理细胞：①正常对照(6瓶)；②20 mg/L NaF处理24 h (3瓶)；③20 mg/L NaF处理48 h(3瓶)；?40 mg/L NaF处理24 h(3瓶)；? 40 mg/L NaF处理48 h(3瓶)。

1.4.2　microRNA提取采用QIAGEN公司miRNeasy Mini Kit试剂盒(货号217004)，提取总RNA，含量400 ng以上的样本反转录成第一链。按照试剂盒说明书与SYBR Green Ⅰ荧光染料混合后，加入PCR ARRAY 96孔板，在荧光定量PCR仪上进行扩增分析。计算每张PCR芯片中的每个基因的Ct值。每种处理组，重复用PCR芯片测定3次。质量控制：3次检测的重复性、扩增效率、基因组污染的去除。相对表达量的计算按照2^-^??Ct方法，表达量差异在2倍以上者为差异有意义基因。对表达差异在1.9倍以上且从 20 mg/L至40 mg/L表达为持续上调或下调者，也被选入作为候选分析基因。

1.5 主要观察指标基因扩增曲线和熔解曲线， microRNA表达差异分析。

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讨论

近年来由于各种新型技术的发展，在基因层面的研究越发便捷，使人们对于非编码基因的认识在现阶段飞速前进。高浓度的氟化物摄入体内会阻碍骨骼形成和重建过程。暴露于氟化物会引起骨内稳态的干扰，以及造成氟斑牙、氟骨症等^[27]，而对凋亡相关基因的研究则提供了新的视角。miRNA各种生物学功能的发挥本质上都是通过调控靶基因的表达实现的，不仅表现在表达丰度的调控，同时也包括基因结构如剪切亚型的调节。以凋亡相关miRNA在染氟成骨细胞中表达的变化为研究的切入点，采用体外培养细胞模型与PCR芯片技术相结合，筛选差异表达的miRNA。与常规的PCR扩增技术相比，PCR芯片具有反应体积小、速度快、操作简便、样品用量少、检测miRNA数目较多、便于集成化等优点，而且实验操作本身在荧光定量PCR仪器上完成，无需用定量PCR再次验证，结果可靠性高。

前期研究发现了氟引起成骨细胞凋亡的剂量和凋亡率之间的相对关系^[6]，在此基础上进一步探索氟对凋亡相关miRNA表达的影响。凋亡是多基因严格控制的过程，这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等，凋亡的大致过程如下：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化(Caspase)→进入连续反应过程，当然这个过程还受到miRNA的调控^[29]。凋亡microRNA PCR芯片是联系凋亡和miRNA的分子工具。

在筛选出的10条miRNA中，miRNA-45l可以通过靶向抑制一种能改变胞膜上钙通道蛋白活性的钙结合蛋白39的表达来促进成骨分化，从而参与钙离子的运输^[30]；而miRNA-21则通过c-fos/miRNA-21/PDCD4的正反馈通路促进RANKL诱导破骨细胞分化^[31]。还有的比如miRNA-125a、miRNA-155、miRNA-7b、miRNA-34a等通过靶向调节M-CSF和c-fos等关键调节因子抑制破骨细胞形成。miRNA-9、miRNA-98、miRNA-34a可抑制IL-1介导的Ⅱ型胶原基因下调，抑制软骨细胞分^[32]。在脊椎动物中，miRNA-9通过调节不同的mRNA靶基因，对神经祖细胞的增殖、迁移和分化产生不同的细胞自主效应。在发育中，miRNA-9抑制细胞凋亡，影响细胞增殖或肿瘤的转移。在许多癌症中，miRNA-9的异常表达使它成为诊断和预后标志的重要候选者；miRNA-9也与其退行性疾病有关，如神经变性等^[33]。而miRNA -153主要是神经分子网络的一个重要调控器，它也与肿瘤细胞增殖有关，也可能与一些与免疫相关的疾病有关，包括移植物抗宿主病等^[34]。其他的miRNA的作用和功能目前还未见报道。从上述报道可以看出所筛选出的miRNA功能是多样的，不仅与凋亡相关有的还与骨细胞的分化相关。这些miRNA可能通过相关靶基因调节骨细胞的增殖、凋亡、骨转化及炎症细胞的活化等，最终引起成骨细胞凋亡的异常增多，从而参与氟骨症的发生和发展。其具体调节过程仍需进一步分析。

关于miRNA在氟中毒的可能作用，以及可能能否成为氟中毒诊断和治疗的药物靶点，还需要在更深的分子水平上了解相关的发生机制。探索miRNA在氟化物和相关基因或者蛋白质之间是如何发挥作用的，能为氟中毒更早期的诊断和治疗提供更多的理论依据。也就是说进一步了解各类miRNA的功能及其在不同细胞环境中的作用，是未来相关探索的重中之重。

由于条件所限，尚未对筛选出的靶基因进行细胞水平的功能验证。在动物体内的干预实验还有待进行。本研究仅选取了目前报道比较多，功能相对清楚的84条凋亡相关的microRNA，随着科技的不断进步，凋亡相关的microRNA数量也在不断增加，本研究结论只能为进一步的研究提供初步的理论基础和方向。

本文利用当前国际国内研究热点：miRNA的理论和技术，结合氟中毒体外模型，围绕高浓度氟致使成骨细胞凋亡的特点，以成骨细胞凋亡通路为切入点展开研究，采用miRNAPCTR芯片方法，首次筛选成骨细胞凋亡过程中表达显著变化的miRNA，并运用生物信息学软件预测其作用的靶基因，研究其对成骨细胞凋亡的影响，对氟骨症的分子生物学研究从而为进一步研发早期诊断和病情监测技术具有重要的理论意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

氟化钠诱导人成骨细胞凋亡相关microRNA差异表达及分析

Differential expression of microRNAs related to apoptosis in human osteoblasts induced by sodium fluoride

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