神经干细胞一般是由人和动物的中枢神经系统原代培养获得,若能通过扩增得到大量的神经干细胞就能避免反复原代取材的麻烦和对原材料的浪费。神经干细胞在培养时,有贴壁培养和悬浮培养两种方式
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壁培养易于分化,不好控制;目前对神经干细胞的培养多采用悬浮培养法。如果不对培养器皿表面作特殊处理,神经干细胞在培养器皿中均以球形态悬浮式培养,但缺点就是,随着培养时间延长,悬浮生长的细胞球的体积会增大,营养成分很难到达位于细胞球中心的细胞,细胞在得不到充足的营养及代谢物累积的情况下,便会停止分裂增殖并逐渐死亡[22]。也有细胞会分化为神经元前体细胞、神经胶质细胞等各分化阶段的神经细胞
[23]。同时,细胞球也不利于对神经干细胞本身特性的研究,特别是电生理、流式细胞仪分析等。这样就需要将细胞球尽量分离成单细胞和小细胞团状态。
因此,人们追求的目标是一个既能将神经干细胞分离成单个细胞又能较好地维持其增殖能力的传代方法。传统分离细胞多采用机械吹打分离法或酶消化法,也可用切割法将大细胞球分离成小细胞球[24-25]。细胞球切割法能够维持细胞之间的联系并且对细胞损伤小,使细胞能够在较短时间内恢复增殖能力。作者也对此传代方法进行了尝试,用组织切片机切割神经干细胞球后,可见扇形的细胞球片悬浮于培养液中,48 h后即可见原先的碎片增殖形成完整的细胞球(结果未显示),但此方法无法获得单个的细胞,仍不利于后续研究。
电镜下观察发现细胞球内部细胞紧密相连,并不易于分离[26]。刘天庆等[27]通过模拟神经球生长的动态模型,发现出现坏死细胞核的细胞球临界尺寸在150~ 200 μm之间, 为此,作者在细胞球直径平均在150 μm时进行分离传代。纯粹的机械吹打法得到的是单个细胞和细胞球的混合物,其结果是单个细胞由于机械吹打损伤大,致使细胞增殖能力弱;而未分离开的小细胞球中心的细胞依然无法得到充分的营养,细胞生长状态不佳。除此之外,分离时的吹打力度和吹打次数也不易掌握。
作者又将目光投向了酶消化法,本实验在其他条件相同的条件下,比较了国内外文献上常见的3种酶消化法,即胰蛋白酶、TrypLE法和Accutase法对消化后神经干细胞存活率和克隆球再生成的影响。胰蛋白酶是最常用的组织和细胞分离液。TrypLE是一种胰蛋白酶替代物,作用较胰蛋白酶温和,且它不是动物源性的,批次间稳定性好。Accutase是胶原酶和蛋白水解酶的混合物,一种温和的细胞细胞解离试剂,常为敏感细胞所用。Panchision等[13]应用多种酶对小鼠胚胎神经组织和人中枢系统肿瘤进行分离培养,发现TrypLE和Accutase消化均能在细胞分离效率、细胞活性和对抗原保留中达到最佳的平衡点。Bajpai等[14]在人胚胎干细胞上发现,与胰蛋白酶相比,Accutase能较好地维持细胞活性和增殖能力。
本实验通过比较对神经干细胞分离成单个细胞效果和传代后新克隆球生成的影响,发现Accutase不仅可以较好地将神经干细胞球分离成单个细胞,而且对细胞损伤小,能很好地保留细胞活力。细胞能在短时间内再次长成新的细胞球。进一步探究原因,胰蛋白酶消化后细胞存活率低、生长缓慢,可能是因为胰蛋白酶作用强烈,消化后破坏了细胞膜表面黏附分子、细胞基质等,并且破坏的细胞崩解产生的一些物质可能对细胞的生长也有一定的抑制作用;反复离心会增加细胞损伤的的机会;残留的胰蛋白酶也可能影响细胞的生长。而Accutase作用温和,能减少对膜表面受体的损伤,如EGF和bFGF受体,或者降低对利于对细胞球形成的表面黏附分子的损伤。TrypLE常用于贴壁细胞的消化,作用的激烈程度应该介于二者之间。
在实验中发现,胰蛋白酶浓度低、消化时间短时无法获得单细胞,加大浓度时又会导致细胞存活率低,降低细胞球的形成。本实验中胰蛋白酶的作用情况是在 37 ℃消化3 min,这是在多次实验中摸索出来的对于胰蛋白酶消化的最佳作用时间。而Accutase即使加大消化时间到15 min对细胞的伤害也较胰蛋白酶要小,这是后者的另一个优势。
本实验用Accutase消化法可以稳定地将细胞传至第10代,并维持其在未分化状态,同时得到了单个细胞供后续实验所用,是较好的细胞分离传代方法。有一点要注意的是,传代时细胞直径不宜过大,一般在150~200 μm为宜,过小时,对细胞损伤大;过大时,解离效果差。一般1周需要传代1次,或在实验前2 d进行,2 d内细胞虽然仍会增殖形成小细胞球,但用普通吸管吹打即可将其分离。