目前仍多以羊、犬及兔作为前交叉韧带重建模型的常规实验动物
[5]。实验选择新西兰大白兔作为模型动物,具有经济、便利的特点。因此实验拟通过在腱骨界面间加入rhBMP-2,改良造模方式,以促进腱骨愈合,缩短造模时间。
Tomita等[6]证实腱骨界面的结合力与骨隧道内新骨的形成量和腱骨界面胶原纤维的连续性密切相关。既然骨隧道内有新骨形成,因此骨诱导形成蛋白(BMP)等骨源性生长因子在早期的腱骨愈合过程中可能存在调控作用[7]。BMP是由多条肽链构成的酸性多肽,能诱导骨髓基质细胞增殖并分化为成软骨细胞,形成软骨组织,也能进一步促进软骨内骨化形成骨组织[8]。现已发现7种BMP,其中BMP-2主要在骨及软骨组织中表达,对体内软骨组织的生长和软骨内骨化过程起重要诱导作用。BMP在生物进化过程中高度保守,不同种属天然BMP有高度同源性,具有跨种诱导成骨能力[9]。BMP-2在骨中含量很小,其提取量一般较少,纯度不高,而提取步骤却较繁杂,难以满足应用的需要,因此实验使用基因重组的骨形态发生蛋白。实验中使用的rhBMP-2由大肠杆菌重组表达,为二聚体形式存在,纯度大于95%。
Rodeo等[7]建立关节外腱骨愈合动物模型,用高低两种浓度的rhBMP-2处理犬的自体趾伸肌腱,切取趾伸肌腱远端植入胫骨骨隧道,再对移植肌腱进行组织学、影像学和生物力学检测。组织学和影像学结果显示,实验组骨隧道内的新生骨长入移植肌腱,腱骨界面的愈合明显优于对照组,生物力学检测显示植入4周后,实验组断裂点主要在骨隧道外的肌腱中段或肌肉和肌腱移行处,而对照组均为隧道内拔出。实验中低浓度组移植肌腱具有更好的骨诱导形成作用,而且没有高浓度组的早期骨吸收不利影响,由此认为低浓度rhBMP-2对肌腱在骨隧道内的愈合有促进作用。由于实验采用的是关节外模型,rhBMP-2对关节内重建前交叉韧带是否有同样作用,尚待进一步的实验证实。
目前增强腱骨愈合能力研究采用的都是关节外模型,关节内的生物学和生物力学机制使得移植肌腱的腱骨愈合变得更加复杂[10-11]。Berg等[12]和Harris等[13]的实验研究均显示关节内滑液侵入骨隧道是影响腱骨界面愈合的重要原因,这可能与关节内滑液所含的蛋白水解酶、生长因子抑制剂影响有关。此外,受关节内滑液和关节活动的影响,如何防止rhBMP-2的流失,避免关节内滑液蛋白水解酶的酶解吸收以及 rhBMP-2的可控性释放和需要维持多长时间的rhBMP-2有效浓度,仍是需要解决的问题。对于关节内应用rhBMP-2,必须有合适的载体材料与其复合,才能起到令rhBMP-2缓释、防止流失及提供细胞生长支架的作用。因此在实验中使用纤维蛋白胶作为rhBMP-2的载体,以达到使rhBMP-2持续稳定释放的目的。
实验采用移植半腱肌重建前交叉韧带,是临床上较常采用的移植材料,重建方式基本与临床方法一致[14]。文献中对于重建韧带的固定多采用牵引线与骨膜缝合固定[15],由于兔的骨膜菲薄,容易撕裂,膝关节活动后可引起重建韧带的松动,最终导致术后膝关节不稳,造模失败。实验采用牵引线通过胫骨及股骨骨桥固定,固定稳定可靠,术后无论是模型组还是对照组,均无重建韧带明显松动。
实验中模型组重建韧带初始长度短于对照组,提示模型组膝关节稳定性要高于对照组。模型组与对照组重建前交叉韧带的横截面面积无显著性差异,载荷与韧带的走行方向恒定,因此最大载荷和刚度可以反映重建止点的力学性能。实验结果显示,模型组在4和8周最大载荷较对照组分别增强82.1%和93.2%。模型组刚度在4和8周较对照组分别增强71.9%和122.0%。实验结果表明,rhBMP-2处理的模型组腱骨界面强度增强,重建前交叉韧带复合体的最大载荷和刚度较对照组明显增加,证实rhBMP-2对术后早期腱骨界面的愈合有明显的促进作用,相对缩短了造模时间。