腺病毒介导人转化生长因子β2基因转染诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.49.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：前人的工作已证实转化生长因子β1能促进骨髓间充质细胞的增殖，诱导其向软骨细胞分化。
目的：进一步验证人转化生长因子β2(human transforming growth factor-β2，hTGFβ2)基因转染诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化作用。
方法：取清洁级3周龄雄性Lewis大鼠16只，用于分离培养骨髓间充质干细胞。通过腺病毒重组载体Ad-hTGFβ2将外源性hTGFβ2基因转染到体外培养的第2代大鼠骨髓间充质干细胞中，48 h后采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blotting的方法检测转染细胞中目的基因与软骨特异性蛋白——Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况。
结果与结论：从成体大鼠骨髓组织中培养出骨髓间充质干细胞，体外培养呈成纤维细胞样，能大量稳定增殖传代。Ad-hTGFβ2转染骨髓间充质干细胞获得稳定表达，免疫组织化学染色和Western blotting检测到基因转染细胞中Ⅱ型胶原蛋白的合成表达，RT-PCR检测到Ⅱ型胶原和蛋白多糖aggrecan mRNA的表达。结果提示，从骨髓组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞，并能在体外稳定增殖传代；Ad-hTGFβ2成功转染骨髓间充质干细胞，诱导其向软骨细胞分化。

关键词: 转化生长因子&beta, 2, 骨髓间充质干细胞, 基因转染, 软骨细胞, 诱导

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have shown that transforming growth factor-β1 (TGF-β1) contributes to proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), and induces the differentiation of BMSCs into chondrocytes.
OBJECTIVE: To investigate the effect of human TGFβ2 (hTGFβ2) transfection on the directional differentiation of BMSCs into osteoblasts.
METHODS: A total of 16 clean male Lewis rats aged 3 weeks were selected for isolation of BMSCs. hTGFβ2 gene was transfected into the second passage of rat BMSCs cultured in vitro through Ad-hTGFβ2. 48 hours later, immunohistochemical staining, reverse transcription-polymerase chain reaction and Western blotting assay were used to determine target gene and cartilage specific protein-type Ⅱ collagen and aggrecan in transfected cells.
RESULTS AND CONCLUSION: A population of BMSCs was successfully isolated from adult rats. They appeared fibroblast-likely and could stably proliferate and subculture in vitro. After transfected with Ad-hTGFβ2, the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells towards chondrocytes was verified by the positive results of type Ⅱ collagen protein expression through immunohistochemistry and Western blotting respectively. RT-PCR detected type Ⅱ collagen and aggrecan mRNA expression. Results suggest that MSCs from bone marrow presented multi-differentiational potential, and BMSCs can proliferate and subculture stably in vitro. Ad-hTGFβ2 is successfully transfected into BMSCs, and induces the differentiation of BMSCs into chondrocytes.

中图分类号:

R394.2

鞠晓东，敖英芳，王建全，邓敏. 腺病毒介导人转化生长因子β2基因转染诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.1673-8225.2010.49.017.

Ju Xiao-dong, Ao Ying-fang, Wang Jian-quan, Deng Min. Adenoviral-mediated transfer of human transforming growth factor-beta 2 gene induces directional differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.1673-8225.2010.49.017.

参考文献

引言

材料方法

讨论

软骨组织中软骨细胞被软骨基质包围，其分裂增殖能力受到限制，关节软骨损伤后其缺损边缘的软骨细胞几乎不能参与自发修复过程^[9] 。因此关节性疾患常造成关节软骨的永久性缺损^[10] 。尽管自体和同种异体软骨移植、假体材料以及骨软骨膜移植等方法取得了一定的临床疗效，但均不能使关节软骨得到生理性修复，且受到了不同程度的限制，远远不能满足临床应用的需要^[11] 。随着组织工程学的兴起，利用组织工程的方法再造软骨为临床上软骨的修复带来新的希望^[12-13] 。从国内外相关文献及作者的研究工作进展看，种子细胞的来源问题已成为软骨组织工程应用于临床的最大障碍^[14-15] 。理想的种子细胞应具备以下特点：取材方便，对机体损伤小；体外培养具有较强的增殖传代能力并保持良好的生物学活性；植入体内能高质量地修复组织缺损并能保持良好的远期疗效^[16] 。人们已利用软骨细胞培育出组织工程软骨，但自体来源的软骨细胞有限，取材不便，对供体部位造成一定伤害以及体外培养易发生去分化现象等原因限制了其应用及发展^[17] 。近年来人们发现成体中也存在多分化潜能的干细胞，其中中胚层来源的间充质干细胞是研究的热点。鉴于其在组织工程及细胞治疗中的光明前景，各国学者开展了广泛的研究推动间充质干细胞在临床治疗方面的应用。间充质干细胞易分离、培养，并且可大量扩增以及可诱导分化的特性，为人类损伤或病变组织的修复提供了新的治疗方法^[18] 。最早研究的间充质干细胞是骨髓来源的间充质干细胞，以往的研究发现，在适当的培养条件下，骨髓中分离的间质干细胞具有分化成软骨细胞、成骨细胞及其他细胞的能力^[19-20] 。
本实验采用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合的方法，用PercoLL分离液分离后的细胞活力高，然后根据BMSC与血系细胞贴壁性能的差异，更换培养基时除去未贴壁细胞，达到分离纯化的目的。所得的BMSC稳定增殖，而且在之后的实验中表现出分化的潜能。
细胞分化需要细胞与细胞、细胞与环境间相互作用，许多生长因子，TGFβ、BMPs、IGF和bFGF等，在各种实验中已被尝试用作骨髓基质细胞分化的调节因子^[21-22] 。其中TGFβ是一族多功能的蛋白质多肽，具有多重生物学效应，能促进细胞增殖、调节细胞分化、促进细胞外基质合成，而且可以抑制多种炎性递质的生物学活性，是调节间充质细胞增殖和向软骨细胞方向分化的最主要因子之一^[23] 。哺乳动物软骨组织中已经分离出3种TGFβ的亚型，其中hTGFβ1是研究最广的^[7] 。目前对TGFβ2的研究较少。作为TGFβ家族的重要成员之一，TGFβ2具有其他TGFβ相关因子所共有的典型晶体结构，有相同的活化形式和信号传导系统，又被称作软骨因子B。有研究已证实，用TGFβ2处理去分化的软骨细胞后，细胞重新表达葡糖胺聚糖和Ⅱ型胶原，恢复了其软骨表型。然而TGFβ2对BMSC分化的影响尚未被完全确定。应用外源性TGFβ可取得良好的效果，但外源性细胞因子蛋白价格昂贵且在体内容易被机体清除而丧失作用，因此怎样才能保持细胞因子长期高效的生物学效应一直是组织工程学需要解决的关键问题^[24-25] 。如果将某些编码特定蛋白的基因转染到细胞，这些携带目的基因的细胞可以通过自身增殖合成内源性生长因子，对靶细胞产生持续的生物学作用，促进细胞的生长、增殖与分化。同时这些细胞可以不单是作为目的基因的携带者，还可作为组织修复的细胞成分^[26-27] 。目前通常用的基因转染载体是病毒和脂质体^[28] 。腺病毒表达载体因具有转染效率高，目的基因高水平表达，免疫排斥反应低，安全系数高等优点亦成为临床基因治疗的主要载体^[29] 。尽管腺病毒载体也存在目的基因表达时间短的缺点，但因为软骨细胞的分化是一个阶段性过程，不需要而且也不希望转染的目的基因长久表达，因此利用其将目的基因导入BMSC促进软骨分化比较理想[30]。
本实验把组织工程和基因工程结合起来，用腺病毒载体将hTGFβ2基因转入BMSC，RT-PCR、Western blotting结果显示hTGFβ2得到稳定表达，转染的细胞能持续正确高效表达内源性hTGFβ2。本实验又对Ⅱ型胶原和Aggrecan的表达进行了检测，这两种基质成分被认为在BMSC的软骨分化过程中被特异性表达。结果发现Ⅱ型胶原和Aggrecan的mRNA在转染48 h后表达水平明显上调，免疫组织化学和Western blotting结果也显示在转染细胞中有II型胶原合成，而对照组未转染细胞中没有检测到。实验结果说明，转染外源性hTGFβ2可以启动或促进BMSC的软骨分化。这就实现了细胞治疗和基因治疗的结合，显示了基因增强组织工程的优势。

[1]	顾霞, 赵敏, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧诱导因子1α与低氧相关疾病信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1284-1289.
[2]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[3]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[4]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[5]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[6]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[7]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[8]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[9]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[10]	王晗月, 李富荣, 杨晓菲, 胡巢凤. 高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1056-1063.
[11]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[12]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[13]	杨洋, 姚羽, 沈孝天, 刘佳佳, 薛建华. 退变腰椎间盘中白细胞介素21的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 690-694.
[14]	谢崇新, 张磊. 保留与不保留残端重建前交叉韧带术后膝关节退变的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 735-740.
[15]	邓桢翰, 黄勇, 肖璐璐, 陈昱霖, 朱伟民, 陆伟, 王大平. 骨形态发生蛋白在关节软骨再生过程中的作用与应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 798-806.