人脐带血内皮祖细胞体外培养和鉴定

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.45.021

中国组织工程研究 ›› 2010, Vol. 14 ›› Issue (45): 8450-8454.doi: 10.3969/j.issn.1673-8225.2010.45.021

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

人脐带血内皮祖细胞体外培养和鉴定　

方立建¹，宋鄂²，栾瑛²，陆成伟²，杨威²，石慧²，毕明超²

¹北京市房山区良乡医院眼科，北京市 102401；²吉林大学第一临床医院眼科，吉林省长春市 130021

出版日期:2010-11-05 发布日期:2010-11-05
通讯作者: 宋鄂，教授，博士生导师，吉林大学第一临床医院眼科，吉林省长春市 130021 songe23@163.com
作者简介:方立建★，男，1982年生，山东省莱芜市人，汉族，2008年吉林大学白求恩医学部毕业，硕士，医师，主要从事眼科临床工作。
基金资助:
吉林省博士点基金(2007018311)，课题题目：内皮祖细胞眼内移植示踪方法的研究；吉林省科委国际合作（20050705-3），题目：高糖对内皮前体细胞影响的研究。

Culture and identification of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood in vitro

Fang Li-jian¹, Song E², Luan Ying², Lu Cheng-wei², Yang Wei², Shi Hui², Bi Ming-chao²

¹Department of Ophthalmology, Fangshan District Liangxiang Hospital, Beijing 102401, China; ²Department of Ophthalmology, First Clinical Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China

Online:2010-11-05 Published:2010-11-05
Contact: Song E, Professor, Doctoral supervisor, Department of Ophthalmology, First Clinical Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China songe23@163.com
About author:Fang Li-jian★, Master, Physician, Department of Ophthalmology, Fangshan District Liangxiang Hospital, Beijing 102401, China
Supported by:
the Doctor Center Foundation of Jilin Province, No. 2007018311*; the International Cooperation Program of Committee of Science of Jilin Province, No. 20050705-3*

摘要/Abstract

摘要：

背景：传统免疫磁珠法分选内皮祖细胞的方法操作复杂、费用大，细胞获得率较低，且内皮祖细胞的增生及分化受限。
目的：尝试改良人脐带血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法，为实现内皮祖细胞移植、改善血管功能提供足量细胞来源。
方法：采用密度梯度离心方法获得人带血单个核细胞，体外进行诱导、分化和扩增，通过免疫组织化学、免疫荧光和流式细胞仪等技术对脐血来源的内皮祖细胞进行鉴定。
结果与结论：脐带血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态；在细胞培养至第7天，免疫组织化学显示：CD31、vWF在体外培养过程中的表达阳性；免疫荧光染色表明：(83.0±4.3)%的贴壁细胞双染呈阳性，并且DiI-acLDL标记的内皮祖细胞红色荧光在体外可以持续6周以上；第7天贴壁细胞流式细胞仪分析显示：CD34、CD133和KDR分别为(17.8±3.7)%、(22.1±4.4)%、(81.5±5.0)%。结果提示，实验成功从脐带血单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞，在其体外可扩增并向为内皮细胞方向分化。

关键词: 内皮祖细胞, 细胞培养, 细胞移植, 人脐带血, 诱导分化

Abstract:

BACKGROUND: The method of traditional immunomagnetic beads sorting endothelial progenitor cells (EPCs) shows complicated operation, with high cost and low cell obtaining rate. Moreover, the proliferation and differentiation of EPCs are limited.
OBJECTIVE: To elucidate a method for in vitro induction and identification of EPC from human cord blood monocytes (CBMC), to realize EPC transplantation, and to provide enough cell source for improving blood vessel function.
METHODS: CBMCs were isolated by Percoll density gradient centrifugation from cord blood, in vitro induced to differentiate and amplified, and then identified by immunohistochemical and immunofluorescent staining and flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: During culture, the cells became spindle-shaped and displayed cobble-stone morphology with outgrowth. On day 7, immunostaining of adherent cells was positive for the cell markers CD31 and vWF. (83.0±4.3)% of attached cells were positive for the double marker DiI-acLDL/FITC-UEA-Ⅰ. The red fluorescence of DiI-acLDL-labeled EPCs lasted for over 6 weeks in vitro. On day 7, flow cytometric analysis showed positive staining of attached cell for CD34, CD133 and KDR (17.8±3.7)%, (22.1±4.4)% and (81.5±5.0)%, respectively. Results indicate that the mononuclear cells from CBMC differentiate into EPCs. It can differentiate into endothelial cells by in vitro amplification.

中图分类号:

R394.2

方立建，宋鄂，栾瑛，陆成伟，杨威，石慧，毕明超. 人脐带血内皮祖细胞体外培养和鉴定　[J]. 中国组织工程研究, 2010, 14(45): 8450-8454.

Fang Li-jian, Song E, Luan Ying, Lu Cheng-wei, Yang Wei, Shi Hui, Bi Ming-chao. Culture and identification of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2010, 14(45): 8450-8454.

参考文献

引言

材料方法

讨论

1997 年Asahara等^[10]从外周血中分离培养出内皮祖细胞，并证明内皮祖细胞参与出生后的血管生成，可以通过动员、体外扩增以及移植内皮祖细胞来促进血管修复和血管新生，这一发现为缺血性疾病的治疗提供了新的治疗途径。在糖尿病患者^[11-13] 、心血管病患者体内循环内皮祖细胞的数量和质量均发生了不同程度的变化^[14-17] ，而且与全身并发症有密切联系。因此有学者认为，内皮祖细胞将来可能是治疗心肌缺血疾病有效而又安全的方法^[18] ，及时补充功能正常的内皮祖细胞可能有益于此类疾病的恢复。Lam等^[19]也证实了，自体内皮祖细胞移植可以保护肺内血管内皮细胞的功能和维持肺泡内血气屏障的完整性。有研究发现，内皮祖细胞在肺癌组织血管形成的过程中起重要作用^[20] ，体内移植内皮祖细胞可能会加重肿瘤患者的病情^{[21 ]} 。骨髓起源的内皮祖细胞参与视网膜新生血管的形成^[22] ；自体内皮祖细胞可被神经营养因子(neurotrophic factors)激活和动员，从而促使糖尿病视网膜病变患者眼底病理性新生血管的形成^[23] 。因此，体外移植内皮祖细胞是否有利于糖尿病视网膜病变患者病情的改善仍有待于进一步证实，这也是本实验进一步的研究方向。
由于传统免疫磁珠分选内皮祖细胞的方法操作复杂、费用较大，细胞获得率较低以及单独培养时缺少其他细胞的相互作用而导致内皮祖细胞增生及分化受限，在一定程度上制约了临床的广泛应用。内皮祖细胞主要存在于骨髓、脐血和外周血等组织中，三者内皮祖细胞含量之比约为15∶10∶1。与骨髓和外周血相比，脐带血来源丰富、再生能力强、免疫源性相对较弱，其内淋巴细胞相对不成熟，可用于人类白细胞抗原(HLA)配型不符者之间的输注^[24] ，并且，随着全国各地脐带血库的建立，将来用自身脐带血提取内皮祖细胞治疗缺血性疾病就不存在免疫排斥反应问题了。因此，本实验利用内皮祖细胞贴壁生长的特点，采用直接贴壁培养人脐血单个核细胞(MNC)获取内皮祖细胞，简化了培养方法，降低了实验成本，为今后的临床研究和应用奠定了基础。
目前还没有统一的标准来鉴定内皮祖细胞，在早期的研究中，人们一直用CD34和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)标记鉴定内皮祖细胞^[10] ，但两者也表达在造血干细胞和血管内皮细胞上，因而无法将混杂的造血干细胞和血管内皮细胞分开，而且有学者从CD34^-单核细胞中也能获得经诱导分化后成为内皮细胞的内皮祖细胞，这给内皮祖细胞的分选带来了困难。后来，Yin 等^[25]发现了可以特异性区别内皮祖细胞和成熟内皮细胞的表面标志CD133，随着内皮祖细胞的分化成熟，CD133转为阴性。因此，有人用 CD133来鉴别内皮祖细胞和成熟内皮细胞。本实验对新鲜分离的单个核细胞进行细胞涂片，免疫组织化学法测定其表面标志CD31和vWF的阳性率为0；而细胞培养至第7天，免疫组织化学法结果显示多数细胞CD31和vWF表达阳性，培养后成熟内皮细胞的特异性分子标志明显增加，这表明脐带血中含的内皮细胞很少，经过含有VEGF等因子的培养基诱导后内皮祖细胞逐渐向成熟内皮细胞方向分化，并表达内皮细胞的特异性分子标志CD31和vWF。流式细胞仪分析单个核细胞经诱导分化7 d后，内皮祖细胞的这3种表面标志都有所表达，而在细胞培养至14 d时，CD133阳性率几乎为零，CD34阳性率亦有下降，而VEGFR2的阳性率则略有升高，如上所述，CD133只在细胞培养早期表达，因此，可以推断内皮祖细胞不是单一一种细胞，而是介于祖细胞与成熟内皮细胞之间的一类细胞。有些学者将其分为两大类：早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞，而两种细胞在生物学特性上有明显差异^[26-28] 。
细胞培养至第7天，用DiI-acLDL /FITC-UEA-I双荧光染色鉴定细胞，由于目前内皮祖细胞无明确的细胞表面标志，因此，利用其功能特征来对其进行鉴定显得尤为重要，双荧光染色正是利用内皮祖细胞即能吞噬AcLDL又能绑定UEA的特征，本实验证实所培养的细胞群体中大部分是正在分化中的内皮祖细胞^[29] ；用DiI-acLDL标记细胞后继续培养内皮祖细胞至第6周，仍有较强荧光表达，并且此方法简单、可靠，不容易被污染，因此，DiI-acLDL可以作为体内移植内皮祖细胞的示踪物，为进一步研究内皮祖细胞在体内循环中的黏附、增生情况提供了可靠的方法。
纤维连接蛋白作为细胞外基质成分之一，含有能够被细胞整合素识别的RGD序列，其支架和黏附等作用，并调节细胞间及细胞与细胞外基质之间的作用，纤维连接蛋白在细胞的早期识别与黏附中有重要的作用^[30] 。纤维连接蛋白可以促进VEGF诱导的CD34+细胞分化为内皮细胞，而且纤维连接蛋白和VEGF对提高内皮祖细胞迁移和分化的能力还具有协同刺激作用^[31] 。本实验分别将分离的单个核细胞铺在包被和未包被纤维连接蛋白的培养皿中培养，在包被纤维连接蛋白的孔板中细胞黏附、增生明显比未铺纤维连接蛋白的多。因此，纤维连接蛋白是内皮祖细胞的体外培养不可或缺的条件之一。
\本研究结果显示，经过VEGF培养、诱导的单个核细胞均不同程度的表达CD133、CD34、KDR、CD31和vWF等内皮祖细胞的相关表面标志，并可吞噬DiI-acLDL和结合FITC-UEA，因此，羟乙基淀粉沉降和Percoll非连续性密度梯度离心联合法可以分离、培养出内皮祖细胞，为将来治疗缺血性疾病的实验研究提供方法和移植细胞的来源。

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