毛蕊异黄酮对人诱导多能干细胞内皮分化的影响及机制

doi:10.12307/2024.167

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (19): 3031-3036.doi: 10.12307/2024.167

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毛蕊异黄酮对人诱导多能干细胞内皮分化的影响及机制

崔胜男1，刘传国2，杨雯晴1，2，郑志娟2，张丹2，3

山东中医药大学，1中医药创新研究院，2实验中心，山东省济南市 250355；3中医药经典理论教育部重点实验室，山东省济南市 250355

收稿日期:2023-04-20 接受日期:2023-06-15 出版日期:2024-07-08 发布日期:2023-09-26
通讯作者: 张丹，博士生导师，山东中医药大学实验中心，山东省济南市 250355；中医药经典理论教育部重点实验室，山东省济南市 250355 郑志娟，讲师，山东中医药大学实验中心，山东省济南市 250355
作者简介:崔胜男，1995年生，山东省济南市人，汉族，2023年山东中医药大学毕业，硕士，主要从事中西医结合防治心血管疾病研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年科学基金资助项目(82174337)，项目负责人：杨雯晴；山东“高校20条”资助项目(2020GXRC017)，项目参与人：崔胜男，郑志娟，张丹

Effects and mechanisms of calycosin on endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells

Cui Shengnan1, Liu Chuanguo2, Yang Wenqing1, 2, Zheng Zhijuan2, Zhang Dan2, 3

1Innovative Institute of Traditional Chinese Medicine; 2Experimental Center, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; 3Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Classical Theory, Ministry of Education, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China

Received:2023-04-20 Accepted:2023-06-15 Online:2024-07-08 Published:2023-09-26
Contact: Zhang Dan, Doctoral supervisor, Experimental Center, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Classical Theory, Ministry of Education, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China Zheng Zhijuan, Lecturer, Experimental Center, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China
About author:Cui Shengnan, Master, Innovative Institute of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China
Supported by:
Youth Science Foundation Project of National Natural Science Foundation of China, No. 82174337 (to YWQ); Shandong “20 Universities” Funded Project, No. 2020GXRC017 (to CSN, ZZJ, ZD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

毛蕊异黄酮：在黄芪、当归等植物中可分离得到，为异黄酮类活性化合物，具有抗氧化、促血管新生的生物活性。
内皮分化：使用生长因子定向诱导人诱导多能干细胞经过中胚层、血管内皮祖细胞的分化过程最终得到成熟内皮细胞。

背景：内皮损伤是心血管疾病的诱因之一，人诱导多能干细胞易于获得、分化能力强、排异性较小，其内皮分化细胞可被用作心血管疾病研究的理想细胞。

目的：探讨毛蕊异黄酮对人诱导多能干细胞定向内皮分化的作用及机制，为微血管再生提供技术支持。
方法：将人诱导多能干细胞分为对照组与毛蕊异黄酮1.25，2.5 μg/mL组，进行内皮定向诱导分化。诱导分化8 d后，采用流式细胞术检测各组细胞内皮细胞标志物CD144阳性率，免疫荧光技术检测CD144、CD31荧光表达。利用慢病毒RNAi-GFP puromycin沉默人诱导多能干细胞 Piezo1 mRNA，再进行内皮定向诱导分化，诱导分化8 d后，采用流式细胞术检测分化细胞CD144阳性率，qPCR检测CD144、Piezo1、MEK的mRNA表达水平。

结果与结论：①与对照组相比，毛蕊异黄酮1.25，2.5 μg/mL组CD144阳性率显著升高(P < 0.05)；毛蕊异黄酮2.5 μg/mL组CD144、Piezo1、MEK mRNA 表达水平提高(P < 0.05)；毛蕊异黄酮2.5 μg/mL组CD144(P < 0.01)和CD31(P < 0.001)荧光表达显著升高；②与shNT组相比，shNT+毛蕊异黄酮1.25，2.5 μg/mL组CD144阳性率和CD144、Piezo1、MEK mRNA表达显著升高(P < 0.05)，与shPiezo1组相比，shPiezo1+毛蕊异黄酮1.25，2.5 μg/mL组CD144阳性率和CD144、Piezo1、MEK mRNA表达无显著变化(P > 0.05)；③实验结果提示2.5 μg/mL毛蕊异黄酮能够促进人诱导多能干细胞内皮分化，毛蕊异黄酮可以通过靶向调节Piezo1表达水平，促进下游MEK表达，从而促进人诱导多能干细胞内皮分化。

https://orcid.org/0000-0001-7172-7088 (郑志娟)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 毛蕊异黄酮, 人诱导多能干细胞, 内皮细胞, 内皮分化

Abstract: BACKGROUND: Endothelial injury is one of the causes of cardiovascular diseases. Human induced pluripotent stem cells are easy to obtain, have strong differentiation ability, and have less exclusiveness, and their endothelial differentiated cells can be used as ideal cells for cardiovascular disease research.
OBJECTIVE: To investigate the effect and mechanism of calycosin on endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells and to provide technical support for microvascular regeneration.
METHODS: Human induced pluripotent stem cells were divided into control group and calycosin group (1.25, 2.5 μg/mL), and growth factors were added to induce single-layer endothelial differentiation. After the induction of differentiation for 8 days, the positive rate of endothelial cell marker CD144 was detected by flow cytometry. Fluorescent expressions of CD144 and CD31 were detected by the immunofluorescence method. Lentivirus RNAi GFP puromycin was used to silence human-induced pluripotent stem cell Piezo1 mRNA followed by endothelial directed differentiation. After 8 days of differentiation, the positive rate of CD144 in differentiated cells was detected by flow cytometry. The mRNA expression levels of CD144, Piezo1 and MEK were detected by qPCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the positive rate of CD144 was significantly increased in the 1.25 and 2.5 μg/mL calycosin groups (P < 0.05). The expressions of CD144, Piezo1, and MEK mRNA were increased in the 2.5 μg/mL calycosin group (P < 0.05). The fluorescence expressions of CD144 (P < 0.01) and CD31 (P < 0.001) were significantly increased in the 2.5 μg/mL calycosin group. (2) Compared with the shNT group, CD144 positive rate and CD144, Piezo1, MEK mRNA expressions were significantly increased in the shNT + calycosin 1.25, 2.5 μg/mL groups (P < 0.05). Compared with the shPiezo1 group, the positive rate of CD144 and mRNA expressions of CD144, Piezo1 and MEK had no significant changes in the shPiezo1+calycosin 1.25, 2.5 μg/mL groups (P > 0.05). (3) It is concluded that 2.5 μg/mL calycosin promotes the differentiation of human-induced pluripotent stem cells into endothelial lineages. Calycosin promotes the downstream MEK expression, thereby promoting the endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells by targeting the expression level of Piezo1.

Key words: calycosin, human induced pluripotent stem cell, endothelial cell, endothelial differentiation

中图分类号:

崔胜男, 刘传国, 杨雯晴, 郑志娟, 张丹. 毛蕊异黄酮对人诱导多能干细胞内皮分化的影响及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(19): 3031-3036.

Cui Shengnan, Liu Chuanguo, Yang Wenqing, Zheng Zhijuan, Zhang Dan. Effects and mechanisms of calycosin on endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(19): 3031-3036.

图/表（结果） 8

2.1 毛蕊异黄酮对hiPSCs活力的作用如图1所示，与对照组相比，1.25，2.5 μg/mL毛蕊异黄酮可以促进hiPSCs增殖(P < 0.05，P < 0.01)，增殖呈浓度依赖性，具有较明显的效果。与毛蕊异黄酮2.5 μg/mL组相比，毛蕊异黄酮5 μg/mL组细胞增殖受到抑制，活力下降。根据以上结果，可初步使用1.25，2.5 μg/mL毛蕊异黄酮干预hiPSCs向内皮细胞诱导分化，根据诱导分化结果筛选毛蕊异黄酮最佳干预质量浓度。

2.2 毛蕊异黄酮对hiPSCs及其分化内皮细胞形态的影响如图2所示，在分化前1 d(即第0天)使用倒置显微镜拍摄，可见细胞克隆边缘光滑，形态均一，排列整齐，细胞呈小颗粒状分布。使用不同质量浓度毛蕊异黄酮(1.25，2.5 μg/mL)持续干预hiPSCs，分化第8天，倒置显微镜下观察到细胞边缘清晰，呈鹅卵石状，在形态上细胞已具有内皮细胞特征。

2.3 毛蕊异黄酮对hiPSCs分化的内皮细胞CD144阳性表达的影响如图3所示，流式细胞术检测结果显示，与对照组(56.4%)相比，毛蕊异黄酮1.25，2.5 μg/mL组CD144阳性率(61.2%，91.3%)有明显提高，提示在分化培养基中加入毛蕊异黄酮可显著提高内皮标志物CD144阳性率。

2.4 hiPSCs内皮分化第8天Piezo1、CD144、MEK mRNA表达水平如图4所示，与对照组相比，毛蕊异黄酮1.5，2.5 μg/mL组CD144、Piezo1、MEK mRNA 表达均有所提高，毛蕊异黄酮1.25 μg/mL组差异无显著性意义(P > 0.05)，毛蕊异黄酮2.5 μg/mL组差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.5 毛蕊异黄酮对hiPSCs分化的内皮细胞CD144、CD31荧光强度表达的影响如图5所示，与对照组相比，毛蕊异黄酮1.25 μg/mL组CD144荧光强度无明显提高(P > 0.05)，CD31荧光强度明显提高(P < 0.001)；毛蕊异黄酮2.5 μg/mL组CD144和CD31荧光强度均明显提高，差异有显著性意义(P < 0.001)。

2.6 沉默Piezo1 mRNA后hiPSCs中Piezo1 mRNA的表达如图6所示，与shNT组相比，shPiezo1组Piezo1 mRNA表达显著下降，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.7 沉默Piezo1 mRNA后hiPSCs内皮分化第8天CD144阳性率如图7所示，流式细胞术检测分化第8天细胞，结果显示与shNT组(56.8%)相比，shNT+毛蕊异黄酮1.25 μg/mL组与shNT+毛蕊异黄酮2.5 μg/mL组CD144阳性率(61.4%，69.9%)有明显提高，与shPiezo1组(8.78%)相比，shPiezo1+毛蕊异黄酮1.25 μg/mL组与shPiezo1+毛蕊异黄酮2.5 μg/mL组CD144阳性率(9.55%，7.82%)无明显提高。

2.8 沉默Piezo1 mRNA后hiPSCs内皮分化第8天CD144、Piezo1、MEK的表达如图8所示，与shNT组相比，shNT+毛蕊异黄酮1.25 μg/mL组与shNT+毛蕊异黄酮2.5 μg/mL组CD144、Piezo1、MEK mRNA表达有明显提高(P < 0.05)，与shPiezo1组相比，shPiezo1+毛蕊异黄酮1.25 μg/mL组与shPiezo1+毛蕊异黄酮2.5 μg/mL组CD144、Piezo1、MEK mRNA水平无明显提高(P > 0.05)。

参考文献

[1] 数据“说”全球心血管疾病负担[J].实用心脑肺血管病杂志,2023, 31(3):5.
[2] GAĆ P, CZERWIŃSKA K, MACEK P, et al. The importance of selenium and zinc deficiency in cardiovascular disorders. Environ Toxicol Pharmacol. 2021;82:103553.
[3] 彭阿建,欧阳范馨,张熙,等.黄芪甲苷干预的EPC-Exos对高糖诱导损伤间充质干细胞向内皮分化的影响[J].世界科学技术-中医药现代化,2022,24(4):1593-1602.
[4] 曹雪洁,陶佳平,曲爱娟,等.血管壁干细胞与血管重塑相关性疾病[J].中国动脉硬化杂志,2022,30(11):921-929.
[5] VIDONI C, FERRARESI A, SECOMANDI E, et al. Autophagy drives osteogenic differentiation of human gingival mesenchymal stem cells. Cell Commun Signal. 2019;17(1):98.
[6] POETSCH MS, STRANO A, GUAN K. Human Induced Pluripotent Stem Cells: From Cell Origin, Genomic Stability, and Epigenetic Memory to Translational Medicine. Stem Cells. 2022;40(6):546-555.
[7] MAROTTA D, RAO C, FOSSATI V. Human Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) Handling Protocols: Maintenance, Expansion, and Cryopreservation. Methods Mol Biol. 2022;2454:1-15.
[8] 陶军,谭红梅.机械门控阳离子通道Piezo1与动脉粥样硬化研究进展[J].中国动脉硬化杂志,2023,31(1):9-16,33.
[9] 刘轩辰,帖晓瑛,刘玉林,等.何首乌提取物对失重小鼠骨质疏松和骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J].吉林大学学报(医学版), 2021,47(6):1386-1396.
[10] 首健,霍云龙.机械力信号与部分心血管疾病的发生[J].中国动脉硬化杂志,2023,31(1):34-40.
[11] SOLIS AG, BIELECKI P, STEACH HR, et al. Mechanosensation of cyclical force by PIEZO1 is essential for innate immunity. Nature. 2019; 573(7772):69-74.
[12] SHINGE SAU, ZHANG D, DIN AU, et al. Emerging Piezo1 signaling in inflammation and atherosclerosis; a potential therapeutic target. Int J Biol Sci. 2022;18(3):923-941.
[13] LUO C, LÜ D, ZHENG L, et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells by coupling substrate stiffness and microtopography. Biomater Sci. 2021;9(10):3776-3790.
[14] DENG M, CHEN H, LONG J, et al. Calycosin: a Review of its Pharmacological Effects and Application Prospects. Expert Rev Anti Infect Ther. 2021;19(7):911-925.
[15] PAN L, ZHANG XF, WEI WS, et al. The cardiovascular protective effect and mechanism of calycosin and its derivatives. Chin J Nat Med. 2020; 18(12):907-915.
[16] TANG JY, LI S, LI ZH, et al. Calycosin promotes angiogenesis involving estrogen receptor and mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway in zebrafish and HUVEC. PLoS One. 2010;5(7): e11822.
[17] GU M. Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Endothelial Cells. Curr Protoc Hum Genet. 2018;98(1):e64.
[18] HARDING A, CORTEZ-TOLEDO E, MAGNER NL, et al. Highly Efficient Differentiation of Endothelial Cells from Pluripotent Stem Cells Requires the MAPK and the PI3K Pathways. Stem Cells. 2017;35(4):909-919.
[19] 桑婉玥,李耀东.人诱导多能干细胞在心血管疾病中的应用及研究进展[J].中国动脉硬化杂志,2022,30(12):1020-1024.
[20] 冯芳.聚多巴胺-多肽粗糙表面调控人诱导多能干细胞体外生长及成骨向诱导分化的研究[D].兰州:兰州大学,2022.
[21] 邵文桂,张阳,阮海文,等.人源诱导多能干细胞体外定向分化为功能性肝细胞的方法研究[J].现代生物医学进展,2023,23(2):225-231.
[22] 徐佳佳,李洋洋,仲光尚,等.人诱导多能干细胞体外定向分化为多巴胺能神经元祖细胞[J].南方医科大学学报,2023,43(2):175-182.
[23] MARCHEQUE J, BUSSOLATI B, CSETE M, et al. Concise Reviews: Stem Cells and Kidney Regeneration: An Update. Stem Cells Transl Med. 2019;8(1):82-92.
[24] BAHMAD HF, ELAJAMI MK, DAOUK R, et al. Stem Cells: In Sickness and in Health. Curr Stem Cell Res Ther. 2021;16(3):262-276.
[25] 巩婷婷,司凯,刘会平,等. MAPK级联调控细胞生长及其在免疫、炎症及癌症中作用的研究进展[J].中南大学学报(医学版),2022, 47(12):1721-1728.
[26] KIDDER BL. Direct Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts to Induced Trophoblast Stem Cells. Methods Mol Biol. 2020;2117: 285-292.
[27] 刘博,冯潇,赵洁,等.转录因子Jun在小鼠睾丸发育过程中的表达及定位[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2022,31(1):11-15.
[28] 张蕊,张同存.整合素integrinβ4调控VEGF诱导的骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化[J].天津科技大学学报,2017,32(1):13-17.
[29] 李鹏,周长勇,尹磊,等.低氧对人脐带间充质干细胞活性和内皮分化能力的影响及VEGF的干预作用[J].中南大学学报(医学版), 2013,38(4):329-340.
[30] 汪雁归,毛萧萧,杨天伦.体外定向诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞及其与脐静脉内皮细胞的比较[J].中南大学学报(医学版),2017, 42(4):374-379.
[31] 曹百川,曾高峰,高云兵,等.热休克内皮细胞诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J].中国组织工程研究,2020,24(19): 3023-3028.
[32] HU Z, WU Y, ZHOU M, et al. Generation of reporter hESCs by targeting EGFP at the CD144 locus to facilitate the endothelial differentiation. Dev Growth Differ. 2018;60(4):205-215.
[33] 刘莲,汪萍萍,肖晓,等.VEGF、FGF2和BMP4联合通过ERK通路高效诱导hiPSCs向内皮细胞分化[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2022,31(1):1-10.
[34] 左芯萌,王振华,高利平.血管细胞外基质胶促进骨髓CD34+祖细胞分化为内皮细胞的实验研究[J].天津医药,2023,51(3):225-229.
[35] ZHANG Y, ZHANG JQ, ZHANG T, et al. Calycosin Induces Gastric Cancer Cell Apoptosis via the ROS-Mediated MAPK/STAT3/NF-κB Pathway. Onco Targets Ther. 2021;14:2505-2517.
[36] GAO J, LIU ZJ, CHEN T, et al. Pharmaceutical properties of calycosin, the major bioactive isoflavonoid in the dry root extract of Radix astragali. Pharm Biol. 2014;52(9):1217-1222.
[37] MOUSAWI F, PENG H, LI J, et al. Chemical activation of the Piezo1 channel drives mesenchymal stem cell migration via inducing ATP release and activation of P2 receptor purinergic signaling. Stem Cells. 2020;38(3):410-421.

引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于 2021年5月至2023年1月在山东中医药大学医学科研平台完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞 hiPSCs购买自北京赛贝生物技术有限公司，货号Lot CA4024106。实验使用的细胞均为复苏的第5代或第6代细胞，其生长特性、细胞表型、分化能力均符合人多潜能干细胞鉴定标准。
1.3.2 实验试剂毛蕊异黄酮(CAS号：20575-57-9，相对分子质量：284.26，质量分数≥98%，Lot B20846)；人多潜能干细胞培养基(北京赛贝生物技术有限公司，Lot CA1014500)；人多潜能干细胞铺底液(北京赛贝生物技术有限公司，Lot CA3003100)；CCK-8细胞活力试剂盒(上海碧云天公司，Lot C0038)；1640培养基(索莱宝公司，20220520)；ECM培养基(Thermo Fisher Scientific公司，Lot 36011)；Y27632(STEMCELL公司，Lot #00000)；二甲基亚砜(美国Sigma-Aldrich公司，Lot D8418)；B27(Gibco公司，Lot 17504-044)；CHIR99021(Selleckchem公司，Lot S1263)；血管内皮生长因子(PEPROTECH公司，Lot 0214423)；碱性成纤维细胞生长因子(PEPROTECH，Lot 100-18B)；SB431542(Selleckchem公司)；Vazyme ScriptTM RT reagent试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，Lot R233)；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司，Lot R711)；封闭用山羊血清(上海中杉金桥，Lot ZLI-9056)；CD144抗体(CST公司，Lot 2500S)；CD31(CST公司，Lot 3528S)；Alexa Fluor 488(CST公司，Lot #4412)；Alexa Fluor 488(Thermo Fisher Scientific公司，Lot 2284614)。
1.3.3 实验仪器恒温培养箱(HealForce公司，HF90)；倒置显微镜(日本Olympus公司，CK41)；紫外分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司，Nanodrop One)；高分辨率实时荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司，QuantStudio5)；激光共聚焦显微镜(德国Zeiss公司，LSM880)；分析型流式细胞仪(德国Beckman公司，CytoFLEX S)。
1.4 实验方法
1.4.1 hiPSCs预处理将6孔板经铺底工作液孵育后，吸除铺底液，将细胞按1×104/孔密度接种于6孔板，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱培养，每天换液。当细胞密度达到50%时，以1∶6的比例进行传代，参照文献[17-18]方法进行单层内皮细胞诱导分化，分为对照组与毛蕊异黄酮组(1.25，2.5，5 μg/mL)，分别加入含毛蕊异黄酮终质量浓度为0，1.25，2.5，5 μg/mL的诱导分化培养基。hiPSCs向内皮细胞分化共需要8 d，分为中胚层分化和内皮分化2个阶段。在分化的第1，2天，属于中胚层分化阶段1，用含6 μmol/L CHIR99021、1×B27的1640培养基进行培养，显微镜下观察细胞从颗粒状转变为长梭形；在分化的第3，4天，属于中胚层分化阶段2，用含有3 µmol/L CHIR99021、1×B27的1640培养基进行培养，显微镜下可观察到细胞形态发生变化，细胞边缘呈多角状；在分化的第5-8天，属于内皮分化阶段，用含有50 ng/mL血管内皮生长因子、10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10 µmol/L SB431542的ECM培养基进行培养，显微镜下可观察到细胞呈鹅卵石状。分化第8天结束时，用ECM完全培养基进行培养。
1.4.2 CCK-8检测hiPSCs活力取对数生长期hiPSCs，消化后制备成1×108 L-1浓度的细胞悬液，加入96孔板，每孔100 μL，置于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中贴壁培养24 h，加入终质量浓度分别为0，1.25，2.5，5 μg/mL毛蕊异黄酮的人多潜能干细胞培养基培养48 h，每个浓度梯度设置3个平行复孔，然后加入CCK-8溶液孵育4 h，用酶标仪检测450 nm波长处吸光度值(A)。细胞活力= A实验组/A对照组×100%。
1.4.3 流式细胞术检测毛蕊异黄酮对hiPSCs内皮分化的作用设置空白组(细胞不加抗体)、对照组、毛蕊异黄酮1.25，2.5 µg/mL组，将hiPSCs分化8 d的细胞消化制备为单细胞悬液，以每管2×105个细胞加入1.5 mL EP管中，100 μL 5%BSA缓冲液重悬细胞，每管加入20 μL CD144-PE-A抗体混匀，4 ℃避光孵育1 h，流式细胞仪检测CD144阳性表达率。
FlowJo_V10进行数据处理，以空白组为阴性对照组，分出CD144阳性细胞群，并计算各组细胞CD144阳性率。

1.4.4 qPCR检测细胞中Piezo1、CD144和MEK mRNA表达水平实验分组同1.4.3，收集各组hiPSCs分化8 d后的细胞，使用Trizol试剂抽提总RNA；用Vazyme ScriptTMRT reagent试剂盒按照说明书反转录为cDNA，用SYBR Green Premix EX TaqTM试剂盒进行实时定量PCR。2-ΔΔCt法计算细胞中Piezo1、CD144和MEK的mRNA表达水平，GAPDH作为内参。基因引物序列见表1。

1.4.5 免疫荧光法检测毛蕊异黄酮对hiPSCs内皮分化的作用取各组hiPSCs分化8 d后的细胞，使用40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS清洗3次；使用1%TritonX-100室温透膜1 h，PBS清洗3次；加入封闭液(PBS为母液+体积分数10%山羊血清)37 ℃封闭1 h；加入封闭液稀释的CD144、CD31一抗(1∶300)，4 ℃孵育过夜，PBS清洗3次；加入封闭液稀释的Alexa Fluor 488荧光二抗(1∶500)37 ℃孵育1 h，PBS清洗3次；加入DAPI，避光染核5 min，PBS清洗3次，激光共聚焦显微镜观察，激发光用405 nm，488 nm激发，ZEN black摄取图像。每组3个重复样本，每个样本圈取10个细胞，ZEN blue计算平均荧光强度值。
1.4.6 慢病毒感染hiPSCs沉默Piezo1 mRNA表达采取慢病毒RNAi沉默hiPSCs中的Piezo1。慢病毒来自吉凯基因，序列hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin。将1×106个hiPSCs接种至6孔板，设置为Piezo1沉默组(shPiezo1)、阴性对照组(shNT)、正常组。病毒效价为1×108 TU/mL，感染复数为50。感染72 h后，通过绿色荧光细胞表达数判断转染效率，用含5 μg/mL嘌呤霉素的培养基筛选感染的hiPSCs。每24 h更换1次培养基，直至正常组细胞被嘌呤霉素全部杀死，感染组荧光效率达到100%。将嘌呤霉素质量浓度降低至1 μg/mL，继续对感染细胞进行筛选和扩增，同时收集细胞进行毛蕊异黄酮干预和内皮细胞诱导分化，诱导分化第8天采用流式细胞术检测CD144阳性率，具体方法同1.4.4。
1.4.7 qPCR检测细胞中Piezo1、CD144和MEK mRNA表达水平实验分组同1.4.6，收集各组hiPSCs分化8 d后的细胞，采用1.4.4方法检测Piezo1、CD144和MEK mRNA表达水平。
1.5 主要观察指标 ①hiPSCs及其分化的细胞形态变化；②hiPSCs分化的内皮细胞相关标志物CD144、CD31的荧光表达；③hiPSCs分化的内皮细胞CD144阳性表达；④hiPSCs分化的内皮细胞相关基因CD144、Piezo1、MEK mRNA表达。
1.6 统计学分析应用 GraphPad Prism software version 8 进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经山东中医药大学统计学教研室生物统计学专家审核。

讨论

hiPSCs是一类具有高度增殖、自我更新、多向分化潜能的细胞，在特定的诱导条件下可向内皮细胞分化，代替修复损伤的血管内皮，在再生医学中有重要的价值[19-24]。激活机械性离子通道Piezo1对血管发育和干细胞分化有重要作用，机械力及化学激活Piezo1促发的钙离子内流，可以引发一系列细胞内信号活化，其中MAPK信号通路蛋白磷酸化能够促进细胞分化、增殖[18]。MEK是MAPK家族核心成员之一，激活MEK信号可活化MAPK信号并进入细胞核产生转录因子(如ETS2、JUN)促进下一步分化、增殖与迁移[25-27]。
Piezo1参与钙离子内流，进而激活MEK信号，最终引起胞内变化，产生分化活动。CD144(VE-Cadherin)与血管内皮生长因子可作为检测分化成功与否的标志。CD144广泛存在于成熟内皮细胞中，其表达与血管生成相关，血管内皮生长因子是血管内皮细胞的高度特异性有丝分裂原，在促进干细胞由中胚层细胞向内皮细胞诱导分化中发挥着关键的作用，是血管生成初期重要的细胞因子[28-33]。CD144与CD31是内皮细胞标志物或表面抗原，可反映内皮细胞亚群水平，在内皮细胞特异性表型转化中可作为检验转化成功与否的重要指标[31，34]。有研究发现，毛蕊异黄酮可参与活化MEK/ERK信号通路[16，35-36]。
该研究探讨了毛蕊异黄酮对hiPSCs向内皮细胞定向分化的促进作用，采用8 d单层细胞诱导分化方案，诱导成的细胞呈椭圆状，可连续传代。流式细胞术检测阴性对照组CD144阳性率为56.4%，毛蕊异黄酮1.25，2.5 μg/mL组CD144阳性率分别为61.2%，91.3%。qPCR检测毛蕊异黄酮2.5 μg/mL组Piezo1、CD144和MEK mRNA表达水平提高(P < 0.05)。免疫荧光法检测发现，与对照组相比，毛蕊异黄酮1.25 μg/mL组CD144平均荧光强度无显著差异(P > 0.05)，CD31有明显差异(P < 0.001)；毛蕊异黄酮2.5 μg/mL组细胞CD144与CD31荧光表达均有提高(P < 0.01，P < 0.001)。
研究发现，机械力及化学刺激Piezo1引起的钙离子内流可激活MEK信号，引发胞内MAPK信号蛋白磷酸化[18，25-26]。
将Piezo1 基因沉默后，shPiezo1组hiPSCs虽然经过8 d的内皮分化孵育，但Piezo1、CD144和MEK mRNA表达及流式CD144阳性率与未分化时相比没有出现显著差异。尽管shPiezo1组hiPSCs分别加入了毛蕊异黄酮参与了内皮分化，但都没有出现Piezo1、CD144和MEK mRNA水平及CD144阳性率的显著提高，这说明了毛蕊异黄酮在失去了Piezo1这个作用靶点后，没有显著激活Piezo1通路，也没有显著激活下游MEK信号通路，与以往研究中Piezo1促进下游MEK/ERK通路的结果一致[37]。
结论：毛蕊异黄酮可以通过靶向调节Piezo1表达水平，促进下游MEK表达，从而促进hiPSCs内皮分化。研究毛蕊异黄酮参与hiPSCs的内皮分化机制，为血管再生疾病的细胞治疗和血管类器官研究提供了新的策略。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

毛蕊异黄酮对人诱导多能干细胞内皮分化的影响及机制

Effects and mechanisms of calycosin on endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells

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[1]	胡广志, 卢红艳. 支气管肺发育不良模型小鼠肺周细胞变化及对肺血管内皮细胞成管的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 522-527.
[2]	赵权威, 李辉, 刘大男, 龚才伟, 陈龙. 达格列净减轻氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞焦亡和功能障碍[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 80-85.
[3]	方兴艳, 田侦丽, 赵哲仪, 文平, 谢婷婷. 亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞损伤及鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇信号轴的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-7.
[4]	秦宇星, 任前贵, 李子龙, 全嘉星, 沈佩锋, 孙韬, 王浩宇. 骨微血管内皮细胞在股骨头坏死中的作用机制及前景[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 955-961.
[5]	马岁录, 何志军, 刘涛, 李金鹏, 李岩, 何波, 魏晓涛, 王威威. 中药调控核转录因子κB信号通路减轻皮瓣缺血再灌注损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(35): 5721-5726.
[6]	黄金生, 张葛毅, 李森瑞, 李江南, 路来金, 周南. 淋巴管内皮细胞来源外泌体促进周围神经损伤后的轴突再生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5314-5319.
[7]	史桂荣, 任博文, 张仲博, 王莉莎, 张啟威, 史栋梁. 红茴香提取物干预骨质疏松性大鼠骨折后的血管生成[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(31): 5028-5034.
[8]	沈梦然, 任岩松, 周宇, 岳德波, 马金辉, 王佰亮. 白细胞介素33介导的骨免疫[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4723-4728.
[9]	魏琴, 阿曼古丽·如则, 陈冰心, 赵翎, 赵帮豪, 姜涛, 张春, 李志强, 高晓明, 段明军. 松弛素保护心肌微血管内皮细胞缺氧复氧损伤的机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4519-4524.
[10]	王莉娟, 柳国斌, 韩秋琴, 赵志弘, 何金晶, 李文惠. 紫朱醇提取物对高糖高脂诱导血管内皮细胞损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4132-4138.
[11]	方兴艳, 田侦丽, 赵哲仪, 文平, 谢婷婷. 亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞损伤及鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇信号轴的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4161-4167.
[12]	肖哲, 周术锋, 朱欢, 李锋, 胡江平. 肥胖人群微血管反应性的变化及运动干预[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4223-4230.
[13]	岳莹, 郝文立, 甘永康. 依那普利叶酸干预下肢静脉栓塞模型大鼠血管内皮细胞活性及血管紧张素Ⅱ、血管紧张素转换酶的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(24): 3877-3882.
[14]	魏琴, 陈冰心, 赵翎, 阿曼古丽·如则, 赵帮豪, 姜涛, 张春, 李志强, 段明军, 高晓明. 松弛素抑制氧化应激反应保护小鼠心肌微血管内皮细胞的缺氧/复氧损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(23): 3621-3627.
[15]	张希倩, 谭高峰, 孙晓泽, 庞欣, 韩宇. 当归甙调控FOXO1干预高血压模型大鼠的血管内皮功能障碍[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(23): 3628-3634.