2型糖尿病小鼠牙齿牙合向伸长运动过程中根尖周组织的变化

doi:10.12307/2023.820

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (32): 5196-5202.doi: 10.12307/2023.820

• 口腔组织构建 oral tissue construction • 上一篇下一篇

2型糖尿病小鼠牙齿牙合向伸长运动过程中根尖周组织的变化

郑毅1，魏舟丹2，郭栋3，师子清3，牛蔚然4，许倬瑜5，李鹏翠6，李文晋3

1天津医科大学口腔医院，天津市 300070；2上海市普陀区人民医院口腔科，上海市 200333；山西医科大学第二医院，3口腔科，6骨科，山西省太原市 030001；4山西医科大学，山西省太原市 030001；5上海杉达学院，上海市 201209

收稿日期:2022-06-28 接受日期:2022-10-27 出版日期:2023-11-18 发布日期:2023-03-23
通讯作者: 李文晋，博士，副主任医师，山西医科大学第二医院口腔科，山西省太原市 030001
作者简介:郑毅，男，1977年生，汉族，天津医科大学毕业，硕士，主治医师。
基金资助:
山西省卫生健康委科研课题(2019042)，项目负责人：李文晋；山西省留学人员科技活动择优资助项目(20200010)，项目负责人：李文晋

Changes in periapical tissue of type 2 diabetic mice during tooth occlusal elongation

Zheng Yi1, Wei Zhoudan2, Guo Dong3, Shi Ziqing3, Niu Weiran4, Xu Zhuoyu5, Li Pengcui6, Li Wenjin3

1Stomatology Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2Department of Stomatology, Putuo District People's Hospital of Shanghai, Shanghai 200333, China; 3Department of Stomatology, 6Department of Orthopedics, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; 4Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; 5Shanda University, Shanghai 201209, China

Received:2022-06-28 Accepted:2022-10-27 Online:2023-11-18 Published:2023-03-23
Contact: Li Wenjin, MD, Associate chief physician, Department of Stomatology, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Zheng Yi, Master, Attending physician, Stomatology Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Health Commission of Shanxi Province, No. 2019042 (to LWJ); Excellent Project of Science and Technology Activities for Overseas Chinese in Shanxi Province, No. 20200010 (to LWJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
晚期糖基化终产物受体：糖尿病患者体内的晚期糖基化终产物的形成速度明显加快。晚期糖基化终产物受体可与其结合从而介导如影响机体炎症反应、影响机体免疫防御等重要的生物学效应，在糖尿病、年迈衰弱、恶性肿瘤、牙周炎及血管性疾病等多种病症的发生发展过程中发挥重要作用。
骨唾液蛋白：是骨基质中一种非胶原型磷酸化的糖蛋白，主要表达于未成熟的成骨细胞中，通过刺激成骨细胞的分化进一步加强其对骨的矿化；也可以直接促进成骨细胞的成熟分化及发挥相应功能，同时抑制人骨髓源细胞增殖而加强成骨细胞的分化及矿化，对于骨的形成和矿化起着不可忽视的作用。

背景：临床工作中经常会遇到一些糖尿病患者的牙齿缺失情况，牙齿缺失后如果未及时行修复治疗，会导致对颌牙伸长，引起垂直向牙合间隙减少、咬合早接触、牙合干扰，甚至需要拔除等一系列问题。
目的：观察糖尿病小鼠牙齿牙合向伸长过程中根尖周组织内晚期糖基化终产物受体和骨唾液蛋白的表达，探究糖尿病在牙齿牙合向伸长运动过程中对根尖周组织的影响。
方法：将120只雄性C57BL小鼠随机分为3组，即糖尿病组、阴性对照组和空白对照组(n=40)。糖尿病组腹腔注射70 mg/kg的链脲佐菌素建立糖尿病模型，阴性对照组腹腔注射等量的柠檬酸钠溶液，空白对照组则不做处理。建模成功后，3组中均随机选出30只小鼠拔除右侧上颌磨牙，再将3组小鼠分为0，3，6，9，12 d 5个亚组(n=6)，按组别定时处死，提取右侧下颌骨。通过实时荧光定量PCR及免疫组化染色观察小鼠磨牙根尖周组织中晚期糖基化终产物受体和骨唾液蛋白的mRNA和蛋白表达水平。
结果与结论：①实时荧光定量PCR结果：晚期糖基化终产物受体mRNA相对表达量糖尿病组高于其他两组，骨唾液蛋白mRNA的相对表达量糖尿病组少于其他两组(P < 0.05)，阴性对照组与空白对照组相比无明显差异(P > 0.05)；随着拔牙时间延长，3组中2种基因的相对表达量均呈持续增长的趋势，糖尿病组在3-6 d时表达量增加最快，阴性对照组及空白对照组在6-9 d时增长速度较快；糖尿病组晚期糖基化终产物受体mRNA相对表达量的增长趋势整体较其他两组明显，骨唾液蛋白mRNA相对表达量的增长趋势整体较其他两组平缓；②免疫组化染色结果：3组小鼠磨牙根尖周晚期糖基化终产物受体和骨唾液蛋白的阳性率随拔牙时间延长均越来越高；糖尿病组晚期糖基化终产物受体阳性率在拔牙后各时间点均显著高于其他两组(P < 0.05)；骨唾液蛋白阳性率在拔牙后的6，9，12 d显著低于其他两组(P < 0.05)；阴性对照组与空白对照组骨唾液蛋白和晚期糖基化终产物受体的阳性率相比无明显差异(P > 0.05)；③提示糖尿病小鼠牙齿牙合向伸长过程中根尖周组织内晚期糖基化终产物受体和骨唾液蛋白随着拔牙时间的延长表达量均逐渐增加，骨唾液蛋白的增长速度及表达量均低于阴性对照组及空白对照组，提示糖尿病可能抑制骨唾液蛋白的表达；但晚期糖基化终产物受体高水平可能与糖尿病加速根尖周组织破坏、延缓组织重建速度有关。
https://orcid.org/0000-0003-3016-3460(郑毅)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨唾液蛋白, 糖尿病小鼠, 晚期糖基化终产物受体, 牙齿伸长, 免疫组化染色, 实时荧光定量PCR

Abstract: BACKGROUND: In clinical work, some diabetic patients often have tooth loss. If the tooth loss is not timely repaired, it will lead to the elongation of the maxillary teeth, resulting in the reduction of the vertical occlusal gap, early occlusal contact, occlusal interference, and even tooth extraction.
OBJECTIVE: To observe the expression of receptor for advanced glycation end products (RAGE) and bone sialoprotein (BSP) in periapical tissue of diabetic mice during tooth occlusal elongation, and explore the effect of diabetes on periapical tissues.
METHODS: Totally 120 male C57BL mice were divided randomly into diabetic group (n=40), negative control group (n=40) and blank control group (n=40). Animal models of type II diabetes were established in the diabetic group by intraperitoneal injection of 70 mg/kg streptozotocin. The negative control group was intraperitoneally injected with the same amount of sodium citrate solution, while the blank control group was not disposed. After modeling, 30 mice randomly were selected from each group to extract the right maxillary molars. Then, the mice were further divided into five subgroups of 0, 3, 6, 9 and 12 days (n=6 per group). The mice were killed respectively according to the time specified by each group to obtain their right mandibles. The mRNA and protein expression levels of RAGE and BSP in periapical tissue were detected by real-time PCR and immunohistochemistry, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Real-time PCR results indicated significantly higher RAGE and lower BSP relative mRNA expression levels in the diabetic group than the blank and negative control groups (P < 0.05), while there was no significant difference between blank and negative control groups (P > 0.05). With the time extension of tooth extraction, the relative expression levels of two genes in the three groups both showed a trend of continuous growth. In the diabetic group, the expression levels increased obviously from 3 to 6 days, while in the blank and negative control groups, the expression levels raised apparently from 6 to 9 days. The increase trend of RAGE mRNA relative expression in the diabetic group was more obvious than that in the blank and negative control groups, while the increase trend of BSP mRNA relative expression did the opposite. Immunohistochemical staining results showed that the positive rates of RAGE and BSP in the periapical tissue of the three groups increased with the time prolongation of tooth extraction. The positive rate of RAGE was significantly higher in the diabetic group than the blank and negative control groups at each time after tooth extraction (P < 0.05). The positive rate of BSP was significantly lower in the diabetic group than the blank and negative control groups at 6, 9 and 12 days after tooth extraction (P < 0.05). There was no significant difference in the positive rate of RAGE and BSP between the blank and negative control groups (P > 0.05). To conclude, the expressions of RAGE and BSP in the periapical tissues of diabetic mice increased gradually with the time extension of tooth extraction, while he growth rate and expression of BSP were lower in the diabetic group than the negative and blank control groups. These indicate that diabetes may inhibit the expression of BSP. However, the high expression level of RAGE may be related to the accelerated damage to periapical tissue and delayed tissue reconstruction in diabetes.

Key words: bone sialoprotein, diabetic mouse, receptor for advanced glycation end products, tooth elongation, immunohistochemical staining, real-time fluorescence quantitative PCR

中图分类号:

郑毅, 魏舟丹, 郭栋, 师子清, 牛蔚然, 许倬瑜, 李鹏翠, 李文晋. 2型糖尿病小鼠牙齿牙合向伸长运动过程中根尖周组织的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(32): 5196-5202.

Zheng Yi, Wei Zhoudan, Guo Dong, Shi Ziqing, Niu Weiran, Xu Zhuoyu, Li Pengcui, Li Wenjin. Changes in periapical tissue of type 2 diabetic mice during tooth occlusal elongation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(32): 5196-5202.

图/表（结果） 14

2.1 实验动物数量分析纳入120只小鼠，分为3组，每组40只，每组随机选择30只进行结果观察。
2.2 实时荧光定量 PCR 结果
2.2.1 RAGE 结果显示，糖尿病组RAGE mRNA的相对表达量明显高于阴性对照组及空白对照组(P < 0.05)；阴性对照组与空白对照组之间RAGE mRNA的相对表达量差异无显著性意义(P > 0.05)。3组RAGE mRNA的相对表达量均呈持续增长的趋势，糖尿病组在拔牙后3-6 d之间表达量增加最快，9-12 d时增长趋势放缓；阴性对照组及空白对照组在6-9 d时增长速度较快；糖尿病组RAGE mRNA相对表达量的增长趋势整体较阴性对照组及空白对照组明显，见图1，2。

2.2.2 BSP 结果显示，糖尿病组BSP mRNA的相对表达量明显低于阴性对照组及空白对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，阴性对照组BSP mRNA相对表达量与空白对照组差异无显著性意义(P > 0.05)；3组BSP mRNA的相对表达量均呈持续增长的状态，糖尿病组在拔牙后3-6 d之间表达量增加最快，6-12 d时增长速度放缓，阴性对照组及空白对照组在6-9 d时增长速度较快；糖尿病组BSP相对表达量的增长速率整体较阴性对照组及空白对照组缓慢，见图3，4。

2.3 免疫组化染色结果
2.3.1 RAGE RAGE在3组小鼠牙槽骨的细胞膜及外基质中有表达，糖尿病组RAGE染色在0 d时为弱阳性表达，随拔牙时间延长而逐渐加深成强阳性，在第12天时达到最强；阴性和空白对照组表达也呈逐渐加强趋势，在第12天时RAGE染色逐渐加深，呈阳性。糖尿病组阳性表达时细胞外基质呈棕黄色或棕色染色，表达量在各个亚组均显著高于阴性、空白对照组(图 5-7)。

RAGE阳性率结果显示，3组小鼠根周RAGE的阳性率均越来越高。在拔牙后0，3，6，9，12 d糖尿病组阳性率显著高于阴性对照组及空白对照组(P < 0.05)；阴性对照组与空白对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，见表4及图8。

2.3.2 BSP BSP在3组小鼠的牙槽骨的细胞膜及外基质中均有表达，在拔牙后0-6 d时阳性细胞少且染色偏浅，阴性对照组和空白对照组呈弱阳性染色；在拔牙后第9-12天时，糖尿病组BSP染色逐渐加深呈阳性，12 d时表达最强，阳性表达时细胞外基质呈黄色或棕黄色染色，但始终较阴性、空白对照组弱(图9-11)。

糖尿病组与阴性、空白对照组BSP阳性率结果显示：3组小鼠根周BSP的阳性率均越来越高。糖尿病组在拔牙后6，9，12 d染色阳性率均显著低于阴性对照组及空白对照组(P < 0.05)；阴性与空白对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图12及表5。

参考文献

[1] YAMAMOTO M, SUGIMOTO T. Advanced Glycation End Products, Diabetes, and Bone Strength. Curr Osteoporos Rep. 2016;14(6):320-326.
[2] BORTOLOTTO V, GRILLI M. Every Cloud Has a Silver Lining: Proneurogenic Effects of Aβ Oligomers and HMGB-1 via Activation of the RAGE-NF-κB Axis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2017;16(10):1066-1079.
[3] BYUN K, YOO Y, SON M, et al. Advanced glycation end-products produced systemically and by macrophages: A common contributor toinflammation and degenerative diseases. Pharmacol Ther. 2017;177:44-55.
[4] BOULEFTOUR W, JUIGNET L, BOUET G, et al. The role of the SIBLING, Bone Sialoprotein in skeletal biology - Contribution of mouse experimental genetics. Matrix Biol. 2016;52-54:60-77.
[5] BOUDIFFA M, WADE-GUEYE NM, GUIGNANDON A, et al. Bone Sialoprotein Deficiency Impairs Osteoclastogenesis and Mineral Resorption In Vitro. J Bone Miner Res. 2020;35(8):1617.
[6] 武婧. 糖尿病对小鼠牙齿伸长运动的影响[D].太原:山西医科大学,2017.
[7] 余佳丽. SPARC、Ⅰ型胶原蛋白在牙齿伸长过程中的表达研究[D].太原:山西医科大学,2017.
[8] 邓旎,谢莉莉,何祥一.系统性牙周治疗影响重度慢性牙周炎松动牙转归的临床研究[J].临床口腔医学杂志,2019,35(6):358-361.
[9] 周婷,徐屹,丁一,等.慢性牙周炎龈下菌斑中五种牙周可疑致病微生物的分布[J].华西口腔医学杂志,2007(5):470-473.
[10] WINNING L, PATTERSON CC, NEVILLE CE, et al. Periodontitis and incident type 2 diabetes: a prospective cohort study. J Clin Periodontol. 2017;44(3): 266-274.
[11] ACHARYA AB, THAKUR S, MUDDAPUR MV, et al. Cytokine ratios in chronic periodontitis and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Metab Syndr. 2017; 11(4):277-278.
[12] CHAPPLE IL, GENCO R, WORKING GROUP 2 OF THE JOINT EFP/AAP WORKSHOP. Diabetes and periodontal diseases: consensus report of the Joint EFP/AAP Workshop on Periodontitis and Systemic Diseases. J Periodontol. 2013;84(4 Suppl):S106-112.
[13] DETZEN L, CHENG B, CHEN CY, et al. Soluble Forms of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts (RAGE) in Periodontitis. Sci Rep. 2019; 9(1):8170.
[14] MØLVIG J, BAEK L, CHRISTENSEN P, et al. Endotoxin-stimulated human monocyte secretion of interleukin 1, tumor necrosis factor alpha, and prostaglandin E2 shows stable interindividual differences. Scand J Immunol. 1988;27:705-716.
[15] 王刚,孙澎,李娟,等.晚期糖基化终产物受体在2型糖尿病伴慢性牙周炎大鼠牙龈组织内皮细胞中的表达[J].口腔疾病防治,2019,27(7): 428-434.
[16] KATZ J, BHATTACHARYYA I, FARKHONDEH‐KISH F, et al Expression of the receptor of advanced glycation end products in gingival tissues of type 2 diabetes patients with chronic periodontal disease: a study utilizing immunohistochemistry and RT‐PCR J Clin Periodontol. 2005;32(1):40-44.
[17] TAKEDA M, OJIMA M, YOSHIOKA H, et al. Relationship of serum advanced glycation end products with deterioration of periodontitis in type 2 diabetes patients. Periodontol. 2006;77(1):15-20.
[18] NI N, WAGNER RS, LANGER P, et al. New developments in the management of periocular capillary hemangioma in children. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 2011;48(5):269-276.
[19] GENNARO G, CLAUDINO M, CESTARI TM, et al. Green tea modulates cytokine expression in the periodontium and attenuates alveolar bone resorption in type 1 diabetic rats. PLoS One. 2015;10(8):e0134784.
[20] KATAYAMA Y, AKATSU T, YAMAMOTO M, et al. Role of nonenzymatic glycosylation of type 1 collagen in di abetic osteopenia. Bone Miner Res. 1996;11:9312937.
[21] LECKA-CZERNIK B. Diabetes, bone and glucose-lowering agents: basic biology. Diabetologia. 2017;60(7):1163-1169.
[22] ANGELA M, INZERILLO E, SOLOMON E .Osteoporosis and diabetesmellitus. Endocr Metab Disord. 2004;5(2):261.
[23] KANAZAWA I. Interaction between bone and glucose metabolism. Endocr J. 2017;64(11):1043-1053.
[24] YANG Y, CUI Q, SAHAI N. How does bone sialoprotein pro- mote the nucleation of hydroxyapatite? A molecular dynamics study using model peptides of different conformations. Langmuir. 2011;26(12):9848-9859.
[25] NAGASAKI K, CHAVEZ MB, NAGASAKI A, et al. The Bone Sialoprotein RGD Domain Modulates and Maintains Periodontal Development. J Dent Res. 2022;101(10):1238-1247.
[26] AO M, CHAVEZ MB, CHU EY, et al. Overlapping functions of bone sialoprotein and pyrophosphate regulators in directing cementogenesis. Bone. 2017;105:134-147.
[27] GORDON JA, HUNTER GK, GOLDBERG HA. Activation of the mitogen-activated protein kinase pathway by bone sialoprotein regulates osteoblast differentiation. Cells Tissues Organs. 2011;189(1-4):138-143.
[28] YANG Y, HUANG Y, ZHANG L, et al. Transcriptional regulation of bone sialoprotein gene expression by Osx. Biochem Biophys Res Commun. 2016; 476(4):574-579.
[29] MALAVAL L, WADE-GUEYE NM, BOUDIFFA M, et al. Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis. J Exp Med. 2008;205(5):1145-1153.
[30] FOSTER BL, AO M, WILLOUGHBY C, et al. Mineralization defects in cementum and craniofacial bone from loss of bone sialoprotein. Bone. 2015;78:150-164.
[31] THOMAS MC, FORBES JM, COOPER ME. Advanced glycation end products and diabetic nephropathy. Am J Ther. 2005;12(6):562-572.
[32] FOSTER BL, SOENJAYA Y, NOCITI FH JR, et al. Deficiency in acellular cementum and periodontal attachment in bsp null mice. J Dent Res. 2013; 92(2):166-172.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，对PCR结果数据进行单因素方差分析，对3组免疫组化染色阳性率进行卡方检验。
1.2 时间及地点实验于2019年11月至2022年9月在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物清洁级 6 周龄 C57BL 雄性小鼠 120只，体质量20-22 g，购于山西医科大学动物实验中心。分笼适应性饲养2周，糖尿病组高脂饮食饲养，昼夜节律为12 h/12 h，饲养室内温度在(21±2) ℃，每3 d给鼠笼消毒、更换垫料，糖尿病小鼠模型建立后改为每日更换垫料，保证环境卫生，实验方案获得山西医科大学伦理委员会的批准(伦理备案号：DW2022038)。

1.3.2 实验试剂见表1。

1.3.3 实验仪器与设备见表2。

1.4 方法
1.4.1 建立糖尿病小鼠模型
(1)模型建立方法：将 120 只小鼠采用简单随机抽样方法随机分为3组，即糖尿病组、阴性对照组和空白对照组，每组40只，用耳号标记后分别称量每只小鼠的体质量，适应性饲养2周。
(2)链脲佐菌素溶液的用量：按照70 mg/kg的注射量计算出糖尿病组小鼠所需的链脲佐菌素溶液量，将链脲佐菌素溶于pH=4.4、0.1 mol/L的柠檬酸钠缓冲液中，配制出1 g/100 mL的链脲佐菌素溶液。全部小鼠禁食不禁水10 h后，糖尿病组小鼠腹腔注射配置好的链脲佐菌素溶液(70 mg/kg)；阴性对照组小鼠腹腔注射等量柠檬酸钠缓冲液，连续注射5 d；空白对照组不做处理。
(3)观察指标：①记录饮食：水及饲料消耗情况，垫料卫生情况；②记录身体情况：注射链脲佐菌素溶液后记录体质量、小鼠活力、精神状况、毛色等情况，每日观察，连续4周；③记录血糖：链脲佐菌素注射结束后检测空腹血糖值，禁食10 h，尾端局部消毒，剪尾法取末端血，每周测1次，连续4周，记录血糖数据。
(4)成模标准：小鼠食量、水量增加，垫料有异味明显且潮湿，体质量降低，连续4周空腹血糖大于11.1 mmol/L，视为已成功建立糖尿病小鼠模型[6]。
1.4.2 建立牙齿牙合向伸长模型糖尿病建模成功后，从每组小鼠中随机选取30只。3组小鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠进行全身麻醉，麻醉成功后拔除小鼠右侧上颌全部磨牙，局部压迫止血，术后给予以正常进食饮水。将拔牙后的3组小鼠随机分为0，3，6，9，12 d组，每组6只，共5个亚组。并于对应时间处死相应组别的小鼠，提取完整的右侧下颌骨[7]。每组中随机选取3只小鼠通过实时荧光定量PCR观察右侧下颌骨磨牙根尖周组织RAGE和BSP mRNA的表达水平；对各组中剩余3只小鼠的右侧下颌骨磨牙根尖周组织进行免疫组化染色，观察RAGE和BSP的蛋白表达水平。

1.4.3 实时荧光定量PCR 将冰冻于-80 ℃冰箱中的3组小鼠右侧下颌骨研磨后进行实时荧光定量PCR检测，将得到的各组Ct值按照2-ΔΔct方法进行计算，得出3组具体数据并两两比较。RAGE和BSP的引物序列见表3。

用 2-ΔΔCt方法分析各组实时荧光定量PCR的Ct值，利用GraphPad Prism软件(下载地址为https://graphpad-prism.cn)绘制柱状图。2-ΔΔCt计算公式为：
ΔCt = Ct(target gene) − Ct(reference gene)
ΔΔCt = ΔCt(target sample) − ΔCt(reference sample)
1.4.4 组织学标本的制备及染色取各组小鼠的右侧下颌骨及牙齿制备标本，进行RAGE、BSP免疫组化染色。各个亚组中随机取2个切片进行观察，每个切片在下颌磨牙根尖周随机选择5个高倍视野，每张切片选取的5个视野位置大致相同，计算RAGE、BSP免疫组化染色阳性率。

将图片导入Image J软件IHC Profiler插件内，读入图片后可快速得到自动评分结果，其评分公式为：

1.5 主要观察指标 ①实时荧光定量PCR测定RAGE、BSP mRNA的相对表达量；②免疫组化染色观察RAGE、BSP的表达阳性率。
1.6 统计学分析采用 STATA 15.0 软件对实验结果进行统计学分析，对PCR结果数据进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义；对3组免疫组化染色阳性率进行卡方检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着饮食中高油高脂食品的比例逐渐升高，糖尿病在人群中的发病率也在逐年上升。临床工作中经常会遇到一些糖尿病患者的牙齿缺失情况，牙齿缺失后如果未及时行修复治疗，会导致对颌牙伸长，引起垂直向牙合间隙减少、咬合早接触、牙合干扰，甚至需要拔除等一系列问题[6]。在牙齿伸长过程中牙根尖周组织发生重建，细胞外基质中相关基因表达水平发生变化，其中骨组织重要的矿化蛋白BSP表达水平也发生变化。而糖尿病患者的根尖周组织重建则更复杂，高血糖最重要的代谢产物RAGE在根尖周组织的表达也发生了巨大变化。
3.1 RAGE-AGEs对牙齿脱落及移动的作用慢性牙周炎是最常见的一类牙周炎，约占牙周炎患者的95%，是由细菌感染而引起牙龈组织慢性感染的疾病[8]，国内成人的患病率高达80%-90%，临床表现为牙龈炎症、探诊出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收、牙齿松动、移位甚至脱落[9]。慢性牙周炎是糖尿病的第六大并发症，85%-95%糖尿病患者同时患有慢性牙周炎，严重危害糖尿病患者的生活品质。未经控制的糖尿病患者机体内环境长时间处于高血糖状态时，由于AGEs的形成速度加快，导致患者血浆及各组织中AGEs累积，研究表明RAGE-AGEs通路活化加速牙槽骨丧失的致病机制包括中性粒细胞的募集和功能受损、感染致病菌[10-11]、胶原纤维生成减少和溶解增高以及遗传倾向等[12-14]。有文献报道在慢性牙周炎的牙龈组织、龈沟液和外周血血清中，RAGE高表达，RAGE及其配体相互作用导致多种细胞因子的释放，破坏细胞外基质，提示其可能对慢性牙周炎的发展起到重要的促进作用[15]。
KATZ等[16]对15例2型糖尿病患者和15例同年龄、同性别的非糖尿病患者行牙龈活检，随后对样本进行免疫组化染色和RT-PCR定量检测RAGE mRNA，免疫组化显示RAGE阳性染色在2型糖尿病和非糖尿病患者炎症牙龈组织上皮的内皮层、基底层和棘层均存在，两组相比无明显差异；然而RT-PCR结果显示，糖尿病患者牙龈中RAGE mRNA相比对照组增加了1.5倍(P < 0.05)，提示在2型糖尿病患者中RAGE表达较单纯牙周炎患者明显增加。TAKEDA等[17]招募2型糖尿病患者和非糖尿病牙周炎患者共97例，对其牙周和糖尿病情况进行分析，结果显示血清中AGEs与牙周炎的恶化程度显著相关。这些研究证明，RAGE-AGEs相互作用可加快牙周炎发展并加重牙周炎的临床症状。除了2型糖尿病可以导致RAGE-AGEs通路活化，吸烟、肥胖等慢性牙周炎的危险因素也可以使外周血血清及牙周组织中RAGE表达升高，加重慢性牙周炎牙齿松动等临床症状[18-19]。
3.2 RAGE在糖尿病小鼠牙齿伸长过程中的表达变化 KATAYAMA等[20]证明，在构造蛋白中存在高浓度AGEs，可直接改变构造蛋白的物理特性导致骨强度降低。AGEs-RAGE可激活核因子κB途径使破骨细胞和成骨细胞内细胞因子、生长因子和黏附分子的表达量增加，促进骨质疏松的发展，同时导致骨重建过程紊乱。研究表明AGEs抑制小鼠成骨细胞活性有2种，包括胞质内碱性磷酸酶活性下降和抑制成骨细胞分泌骨钙素，提示AGEs能减少新骨生成[21]。ANGELA等[22]应用AGEs修饰Ⅰ型胶原，用其培养成骨细胞，发现合成骨钙素和Ⅰ型胶原纤维数量显著减少，指出经AGEs修饰的构造蛋白能够抑制成熟过程中成骨细胞的增殖分化。AGEs含量增加，可导致成骨细胞对构造蛋白的黏附能力降低[23]。
此次实验通过对牙齿牙合向伸长小鼠模型下颌根尖周组织进行实时荧光定量PCR和免疫组化染色，观察根尖周组织中RAGE的变化。RT-PCR结果表明，糖尿病组RAGE mRNA的相对表达量在各时间点均显著高于阴性对照组及空白对照组；随着拔牙后时间的延长各组小鼠根周组织中RAGE mRNA表达量均持续增高；糖尿病组RAGE mRNA相对表达量的增长趋势整体较阴性对照组及空白对照组明显。免疫组化染色结果发现，糖尿病组RAGE阳性表达率均随着拔牙时间的增加而增强，12 d时最强，阴性对照组及空白对照组小鼠阳性表达率增高不明显；糖尿病组RAGE阳性表达率在各时间点均显著高于阴性对照组及空白对照组。这些结果提示，糖尿病小鼠持续高血糖使局部根周组织中RAGE表达量增高；非糖尿病小鼠根尖组织中RAGE表达增高不明显，推测高RAGE水平可能与糖尿病导致加速根尖周组织破坏、延缓组织重建速度有关。
3.3 BSP在牙周附着中的作用 BSP是重要的非胶原糖基化磷酸蛋白之一，大量存在于骨细胞外基质中，是一种矿化的骨组织特异性蛋白质，在未成熟的成骨细胞中表达，在骨矿化的起始发挥作用，可使无定形磷酸钙簇集成团，矿化为羟基磷灰石晶体；BSP同时还可作用于破骨细胞，加速其黏附分化[24]。
BSP促进成骨细胞分化以及矿化的方式有2种：一是通过RGD介导的细胞相互作用[25]，二是作为基质相关信号作用于成骨细胞[26]。有研究表明，BSP在皮质骨愈合、原始骨形成和新生骨矿化过程中发挥了作用[27]。BSP在成骨细胞中的表达增加可以使Runx2和osx基因在成骨细胞内的表达上调，同时促进碱性磷酸酶和骨钙素的表达上调，加快基质矿化[28]。但是BSP的过度表达会降低成骨细胞的数量，增加破骨细胞的活性，引起骨吸收的速度加快及新形成的骨量不足，进而导致小鼠骨质减少和轻度侏儒症[29]。BSP缺乏很可能损害骨的生长和矿化，同时显著减少骨形成[30]，缺失BSP也会因损害了新骨形成和破骨细胞活性而延迟骨修复[31]。有研究发现，随着BSP缺失小鼠牙周完整性逐渐退化，牙骨质牙周组织界面的结构缺陷、牙周组织紊乱、上皮生长下降以及牙齿和骨吸收增加[32]。
3.4 BSP在糖尿病小鼠牙齿伸长过程中的表达变化此次实验通过对牙齿牙合向伸长小鼠模型下颌根尖周组织进行实时荧光定量PCR和免疫组化染色，来观察根尖周组织中BSP的变化。
RT-PCR实验结果发现，糖尿病组BSP mRNA在各时间点的相对表达量均明显低于阴性对照组及空白对照组，随着拔牙后时间的延长各组BSP表达量均持续增高；糖尿病组在拔牙后6-9 d之间表达量增加最快，9-12 d时增长趋势放缓，阴性对照组及空白对照组在9-12 d时增长速度较快；糖尿病组BSP相对表达量的增长趋势整体较阴性对照组及空白对照组平缓。免疫组化染色结果表明，3组小鼠BSP阳性表达率随着拔牙时间的延长而增加，12 d时最强；而在同一时间点，糖尿病组阳性BSP表达率均明显低于阴性对照组及空白对照组。推测糖尿病小鼠由于血糖升高导致伸长牙齿的根周组织中新骨形成速度减慢与BSP表达偏低、牙根表面矿化减弱有关。
总之，2型糖尿病小鼠牙齿牙合向伸长过程的根周组织改建涉及多因素，持续的高血糖导致根周组织中RAGE表达增高，抑制BSP的表达，延缓根周组织的重建，但其调控机制还有待进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

2型糖尿病小鼠牙齿牙合向伸长运动过程中根尖周组织的变化

Changes in periapical tissue of type 2 diabetic mice during tooth occlusal elongation

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 14

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张路遥, 杨康. 不同运动干预2型糖尿病模型小鼠的肾间质纤维化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 200-207.
[2]	费冀, 张开伟, 周一夫, 凌一鸣. 石香膏干预糖尿病溃疡创面模型大鼠创面组织晚期糖基化终产物及其受体与内皮型一氧化氮合成酶表达的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(20): 3196-3201.
[3]	杨晓叶, 李文晋, 朱莉, 王瑜, 张双元. 糖尿病模型小鼠拔牙后对颌牙牙合向伸长过程中根周骨密度及相关因子的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(2): 242-247.
[4]	张雪梅，刘培培，刘军，张保荣. 基于real-time PCR的齿垢密螺旋体含量与慢性牙周炎严重程度的关系研究[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(28): 4493-4498.
[5]	姜泳，迟晓飞，邹喜军，慈元，姚琦，杨茂伟. 重复经颅磁刺激联合嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 98-102.
[6]	赵高平，邓绍平，黄孝伦，杨卯竹，魏玲玲，李姝蓉，魏亮. 组织工程预血管化处理对胰岛移植的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(24): 3562-3567.
[7]	徐锐，杨毅宁，马依彤，李晓梅，赵倩，陈邦党，刘芬. 巨噬细胞移动抑制因子基因rs1007888位点单核苷酸多态性与哈萨克族冠状动脉粥样硬化性心脏病发病的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(2): 231-235.
[8]	孙曙，李州利，蔡明，王强，金海龙，陈昌庆，刘志佳，孔祥瑞，李聪然，石炳毅. 白细胞介素17在肾移植排斥反应中的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(51): 8275-8280.
[9]	刘川，邹叶青，石庆芝. 造血干细胞移植中人巨细胞病毒检测：荧光定量聚合酶链反应的早期诊断价值[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(28): 4563-4567.
[10]	李天然，杜湘珂，宋斌，魏正茂，霍天龙. 骨髓间充质干细胞对高转移肝癌模型的干预[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(49): 8498-8504.
[11]	刘瑞瑾，吴新荣. 鱼藤素可影响斑马鱼胚胎Wnt信号通路相关基因的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(15): 2776-2779.
[12]	韩永，蔡明，钱叶勇，王新颖，黄海燕，许晓光，肖漓，周文强，冯凯，石炳毅. 肾移植后BK病毒相关性肾病的早期诊断[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(53): 9916-9920.
[13]	解俊杰1，钱叶勇2，石炳毅2，范宇2，柏宏伟2，常京元2，韩永2，王洪阳1. 肾移植后BK病毒感染者实时荧光定量PCR检测★[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(5): 797-800.
[14]	念馨，卫俊杰，苏艳丹，刘华，张旭祥，李红. 内脏脂肪组织FOXC2 mRNA表达水平与2型糖尿病的关系[J]. 中国组织工程研究, 2011, 15(50): 9496-9500.
[15]	王亚南，史进方，顾国浩. 急性髓细胞性白血病患者外周血单个核细胞CD28 mRNA的表达[J]. 中国组织工程研究, 2011, 15(10): 1841-1844.